Espressione e purificazione di particelle virus-simili per la vaccinazione

Qui, vi presentiamo un protocollo per la sintesi di particelle virus-simili che utilizzano sia baculovirus o sistemi di espressione di mammifero, e la purificazione ultracentrifugazione. Questo approccio altamente personalizzabile viene utilizzato per identificare antigeni virali come bersagli vaccino in modo sicuro e flessibile.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di purificare le particelle simili ai virus, o VLP, espresse e secrete dai sistemi di espressione delle cellule di mammifero o di insetto. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo di un vaccinoly, come ad esempio come esprimere e purificare antigeni virali conformazionalmente rilevanti in modo sicuro e flessibile. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non richiede la precipitazione delle proteine utilizzando glicole polietilenico o la preparazione di strati di densità multipli per concentrare le VLP.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'identificazione degli antigeni virali come bersagli dei vaccini, le VLP possono anche essere utilizzate come strumenti per la diagnosi e la sierologia delle malattie. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto un sottofondo di glicerolo nelle fasi di risospensione VLP è difficile da imparare perché i principianti potrebbero non riuscire a esercitare la tecnica corretta. Il giorno della trasvezione preparare le soluzioni di liposomi e DNA secondo le raccomandazioni del produttore.

Traspetta le cellule di DNA con una composizione del DNA di uno a uno o due da HA a NA a Gag e una quantità totale di DNA di 40 microgrammi per matraccio T150. Ripetere questo passaggio per creare nove matracci T150, per un volume totale di 200 millilitri. Successivamente, diluire le soluzioni di DNA e liposomi in mezzi di trasvezione privi di siero e senza antibiotici, in modo che ogni pallone contenga un volume totale di 24 millilitri.

Rimettere i flaconi nell'incubatore e mantenere le cellule e il terreno di coltura di trasvezione fino al giorno in cui una particella simile al virus, o VLP, viene raccolta. Trasferire il surnatante in provette coniche da 50 millilitri per raccogliere la coltura dalle cellule dopo 72-96 ore dalla trasvezione. Ruotare le celle verso il basso per pellettare i detriti cellulari.

Raccogliere i surnatanti e filtrarli attraverso una membrana da 0,22 micron. Coltura di spodoptera frugiperda, o cellule Sf9, precedentemente preparate, in sospensione in fiasche rotanti, agitando continuamente a 130 giri/min su un sistema di piastre di agitazione multipunto. Mantenere i volumi di coltura a non più della metà del volume del pallone per una corretta aerazione.

Successivamente, esprimere le VLP CHIK infettando 250 millilitri di cellule Sf9 in un pallone rotante a una densità di due volte dieci a sei cellule per millilitro con baculovirus ricombinante precedentemente preparato e riportare le cellule in un incubatore a 28 gradi Celsius. Utilizzare l'esclusione del blu di tripano per determinare se la vitalità cellulare è diminuita dal 70 all'80%Dopo la conferma, trasferire le colture direttamente dalla sospensione in provette coniche da 50 millilitri e far girare le cellule verso il basso. Raccogliere i surnatanti e filtrarli attraverso una membrana da 0,22 micron prima della sedimentazione.

Sterilizzare sei provette per ultracentrifuga aperte da 25 mm x 89 millimetri con etanolo al 70%. Quindi, assicurati che l'etanolo si sia asciugato completamente. Caricare 32 millilitri di surnatanti nei tubi puliti.

Successivamente, stendere accuratamente i surnatanti con tre millilitri di glicerolo sterile al 20% e PBS. Stendere lentamente il glicerolo per evitare la rottura del sottile strato di densità tra il glicerolo e la soluzione VLP. L'erogazione del glicerolo troppo rapidamente causerà la miscelazione del glicerolo e delle soluzioni VLP, riducendo la sedimentazione VLP.

Assicurati che i tubi siano bilanciati, quindi inizia la centrifuga. Dopo quattro ore, rimuovere le provette dalla centrifuga. Aspirare il surnatante, facendo attenzione a non staccare il pellet dal tubo.

Risospendere le VLP sedimentate in almeno 100 microlitri sul fondo delle provette con PBS sterile pipettando delicatamente e lentamente su e giù. La risospensione del pellet VLP deve essere eseguita con un'aspirazione delicata e lenta ripetuta e l'espulsione di PBS utilizzando una pipetta. Evitare la creazione di bolle per limitare la perdita di VLP.

Infine, conservare le VLP risospese. I volumi di VLP e la resa proteica totale da un saggio BCA convenzionale sono stati ottenuti da una varietà di costrutti SVP e VLP. Le rese di CHIK SVP dalle cellule Sf9 variano tra 0,008 e 0,016 milligrammi di proteine totali per millilitro di volume di surnatante.

Mentre la produzione attraverso le cellule T 293 dei mammiferi produce una riduzione di dieci volte delle proteine. Questa immagine al microscopio elettronico mostra che le VLP dell'influenza HA Gag core sono espresse, assemblate e purificate con successo come VLP. Bene, tentando questa procedura, è importante ricordare di traspetrare e infettare solo colture cellulari sane e vitali in quanto ciò influenzerà i livelli complessivi di espressione proteica.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come i saggi BCA, ELIZA e HA per misurare il contenuto proteico totale, il contenuto specifico dell'antigene e l'espressione dell'HA funzionale. Non dimenticare che lavorare con un'ultracentrifuga può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero essere sempre prese precauzioni come il bilanciamento delle provette, l'utilizzo solo dei rotori e delle velocità consigliate e un'adeguata supervisione del nuovo personale di laboratorio.