Name: Espressione e purificazione di particelle virus-simili per la vaccinazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Scopri come purificare particelle virus-simili (VLP) espresse da sistemi di cellule di mammifero o insetto. Questo metodo semplificato utilizza ultracentrifugazione per identificare antigeni virali come target vaccinali in modo sicuro e flessibile.

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Vogliamo riconoscere i membri precedenti del laboratorio Ross che hanno contribuito a ottimizzare il protocollo per la massima efficienza e rendimento.

1. sistema mammifero di espressione per la generazione di influenza H3N2 VLP <ol><li> Sottoclone virale glicoproteine ​​strutturali emoagglutinina (HA), neuraminidasi (NA), e il virus dell&#39;immunodeficienza umana (HIV) Gag p55 in vettori di espressione eucariotica, come descritto in precedenza pTR600. 7 </li><li> Amplificare il DNA in Escherichia coli chimicamente competente (ad esempio, DH5α) e isolare trasfezione-grade plasmide utilizzando un kit di purificazione plasmide secondo le istruzioni del produttore. Quantità di DNA dipende dalla resa e le esigenze degli utenti. </li><li> Mantenere linea cellulare di mammifero, 293T, in terreni di coltura contenente 10% di siero fetale bovino (FBS) a 37 ° C con 5% di CO 2 in un incubatore umidificato. </li><li> Crescere le cellule in modo che un pallone di coltura tissutale T-150 contiene 45-75 x 10 6 cellule per fiasco tale che matraccio ottiene completa adesione delle cellule e cellule confluenza 85-95% entro il giorno successivo. Ispezionare le cellule sotto il microscopio per conflu desideratorenza. Nota: ad alta densità cellulare è in genere consigliato di cedere l&#39;espressione della proteina ottimale con il minimo citotossicità utilizzando reagenti di trasfezione commerciali comunque un eccesso di confluenza può causare l&#39;accumulo di rifiuti cellulari sottoprodotti e ridurre la vitalità cellulare. </li><li> Il giorno della transfezione, preparare liposomi e la miscela di DNA secondo le raccomandazioni del costruttore e trasfezione le cellule del DNA con una composizione del DNA di 1: 1: 2 di HA: NA: Gag con una quantità di DNA totale di 40 mcg per pallone T-150. Diluire soluzioni di DNA e liposomi in mezzi trasfezione privo di siero senza antibiotici tale che ciascun pallone contenente un volume totale di 20-30 ml. Nota: Rapporto tra costrutti genici può richiedere l&#39;ottimizzazione degli utenti. Sebbene non dimostrato qui, una procedura di trasfezione simile è stata eseguita con il virus respiratorio sinciziale (RSV) F e HIV Gag ad un rapporto 1: 1. Per DENV e CHIKV plasmidi singola espressione, per un totale di 20 mg di DNA per T-150 pallone sono utilizzati per la ottimale eXpression. DNA: transfezione rapporti reagenti sono ottimizzati utente. Uso consigliato media transfezione basato sul metodo di trasfezione, vale a dire, trasfezioni lipidi policationici raccomandano riduzione o assenza di siero fetale bovino in tal modo i media possono essere completate con ormoni della crescita e oligoelementi per sostenere la crescita in assenza di siero. </li><li> Rientro palloni a 37 ° C con 5% di CO 2 incubatore. Per un volume di 200 ml, utilizzare 9 T-150 palloni. Le cellule vengono mantenute in mezzo di coltura trasfezione fino al giorno del raccolto VLP. </li><li> Harvest cultura surnatante dalle cellule dopo 72-96 ore dopo la trasfezione seconda antigene, o quando vitalità cellulare è sceso a 70-80%, come stimato mediante ispezione al microscopio. Trasferire il surnatante in 50 ml provette coniche e far girare le celle in basso a 500 g per 5 minuti a 4 ° C per far sedimentare i detriti cellulari. Nota: La sostituzione di tre giorni surnatante con pre-riscaldato, privo di siero dei media trasfezione fresco di cellule aderenti saranno yielda secondo lotto di VLP con rendimento simile o leggermente ridotto e deve essere ottimizzato dall&#39;utente. </li><li> Pool surnatante e filtro attraverso una membrana 0,22 micron pori prima sedimentazione tramite ultracentrifugazione. </li><li> Testare l&#39;attività emoagglutinazione dei VLP HA-esprimono mediante test di emoagglutinazione standard di 14 utilizzando lo 0,8% di tacchino o di globuli rossi dei mammiferi o procedere con ELISA antigene-specifica. Vedere la Figura 2 per i risultati rappresentativi. </li></ol> 2. CHIK VLP espressione utilizzando Baculovirus / Insect Cell System <ol><li> Generare baculovirus ricombinanti che esprimono capside del virus Chikungunya e proteine ​​dell&#39;involucro (C-E3-E2-6K-E1) da S-27 ceppo utilizzando un sistema commerciale di espressione baculovirus. </li><li> Cellule Sf9 Cultura Spodoptera frugiperda in terreno di crescita Sf9 privo di siero con 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina a 28 ° C. Utilizzare 3-5 x 10 5 c / ml di avviare culture pallone filatore per suspensla crescita delle cellule di ioni. Passaggio routine quando raggiungono densità di cellule di 2-4 x 10 6 c / ml (ogni 3-4 giorni). </li><li> cellule Culture Sf9 in sospensione in flaconi filatore con agitazione a 130 rpm in un sistema multipunto piatto agitatore. Per una corretta aerazione, mantenere volumi di coltura a non più di metà del volume del pallone filatore. </li><li> Per l&#39;espressione di CHIK VLP, infettare le cellule Sf9 ad una densità di 2 x 10 6 cellule / ml con baculovirus ricombinante ad una molteplicità di infezione di 1 e tornare a 28 ° C incubatore. In genere, infettare una o due palloni filatore, contenenti 250 ml cellule Sf9. Nota: Anche se non utilizzare questo metodo, le cellule Sf9 possono essere coltivate in fiaschi di vibrazione a 28 ° C utilizzando una piattaforma shaker. </li><li> culture raccolto dopo 72-96 ore dopo l&#39;infezione, o quando la vitalità delle cellule è diminuito al 70-80%, come determinato dal Trypan Blue esclusione secondo il protocollo del produttore. Nota: le cellule continuano a proliferare, mentre infetto e vi èun ~ 80% vitalità nelle culture Sf9 infettate con baculovirus ricombinanti CHIK VLP a 3 giorni dopo l&#39;infezione (dpi). cellule baculovirus infettate sono più grandi in apparenza. Morfologia può anche cambiare da rotondo a oblunga. Alla fine di stadi di infezioni baculovirus, le cellule hanno cominciato a lisare. </li><li> culture trasferire direttamente dal coltura in sospensione in 50 ml provette coniche e spin giù le cellule a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Raccogliere surnatanti e filtrare attraverso una membrana da 0,22 micron pori prima sedimentazione tramite ultracentrifugazione. </li></ol> 3. La sedimentazione / Purificazione di VLP / SVP <ol><li> Sterilizzare tubi ultracentrifuga open-top 25 mm x 89 mm con il 70% di etanolo in cappuccio biosicurezza. Assicurarsi che l&#39;etanolo è asciugata prima dell&#39;uso. </li><li> Caricare fino a 32 ml di surnatante in una provetta pulita. Si raccomanda un volume minimo di 25 ml per prevenire il collasso e il danno di tubi riempiti ultracentrifuga adeguatamente. </li><li> underlay attentamente surnatanti ingegnoh sterile 3 ml 20% glicerolo in PBS (v / v). Assicurarsi che i tubi sono equilibrati. </li><li> Spin a 135.000 xg per 4 ore a 4 ° C. </li><li> Aspirare il surnatante, garantendo il pellet non sloggiare dal tubo. </li><li> Risospendere sedimentato VLP nella parte inferiore dei tubi con PBS sterile vigorosamente pipettando su e giù. La quantità di PBS necessaria per risospendere VLP dipende dalla resa di proteine ​​totali VLP e applicazioni a valle. In genere, risospendere ogni pellet VLP in almeno 100 ml. </li><li> Conservare i campioni a 4 ° C per una conservazione a breve termine e di stoccaggio -80 ° C per una conservazione a lungo termine. </li></ol> 4. determinazione delle rese di proteine ​​e rendimenti antigene specifico <ol><li> Determinare il contenuto proteico totale utilizzando un metodo proteina quantificazione commerciale, come ad esempio test BCA come da protocollo del produttore. </li><li> Per valutare il contenuto antigene specifico, eseguire diretta enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) rivestendo diluizioni seriali di antigene standard e 2-51; g di campione proteico totale a una piastra da 96 pozzetti a fondo piatto ELISA. <ol><li> Seguire con anticorpi antigene-specifici per sondare la presenza degli antigeni sulla piastra e utilizzare substrati sviluppo ELISA convenzionali per produrre assorbanza rilevabili per lettore di micropiastre. Vedere la Figura 2 per i risultati rappresentativi di test HA e ELISA per un campione HA-esprimendo VLP; molte combinazioni di HA e NA sono forse, ma i rendimenti possono essere diverse su HA-NA compatibilità 15. Nota: gli anticorpi antigene-specifici hanno affinità variabili e si raccomanda che la diluizione endpoint-titolazione degli anticorpi essere determinata prima di eseguire VLP quantificazione. anticorpi commerciali avranno intervalli di concentrazione o diluizione consigliato per l&#39;uso in ELISA, così come protocolli suggerite. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Abbiamo usato le tecniche sopra descritte per esprimere con successo e purificare SVP e VLP composti da più proteine ​​strutturali di vari agenti patogeni. In generale, usiamo sistemi di espressione di mammifero per generare i nostri VLP. Tuttavia, nelle nostre mani, dei mammiferi cellule derivate Chik rendimenti VLP erano bassi. CHIK resa VLP è stato più robusto quando si utilizza un sistema di celle baculovirus-insetto ricombinante. In generale, baculovirus-insetti sistemi cellulari producono una maggiore quantità di ...

particelle virus-simili (VLP) sono una tecnologia approvata per la vaccinazione umana. In effetti, alcuni dei vaccini più contemporaneamente in licenza, tra cui il papillomavirus umano (HPV) e l&#39;epatite Β (HepΒ) vaccini impiegano questo metodo. VLP sono formate da proteine ​​strutturali in grado di auto-assemblaggio. Le particelle assemblate imitano morfologie virali, ma non possono infettare o replicare perché non hanno genomi virali. VLP possono essere espressi e purificati da un certo numero di sistemi procariotici ed eucariotici. Una revisione della letteratura ha rivelato che diversi sistemi di espressione sono impiegati alle seguenti tariffe: batteri - 28%, lievito di birra - 20%, impianto - 9%, insetto - 28%, e di mammiferi - 15% 1. Da segnalare, vaccini HPV a base di proteine ​​del capside L1 sono prodotte nel lievito (Gardasil) o in un sistema di cellule di insetto (Cervarix) 2. Vaccini HepΒ, Recombivax e Engerix-Β, sono prodotti anche nel lievito, e sono composti da HepΒ antigene di superficie 3, 4. Usiamo sistemi di espressione di cellule di mammiferi e insetti per la produzione di VLP che richiedono co-espressione di molteplici proteine ​​strutturali per il montaggio. Il nostro lavoro si concentra sulla progettazione, produzione, e di vaccini VLP-based di depurazione contro gli agenti patogeni umani: virus dell&#39;influenza, virus respiratorio sinciziale (RSV), virus della dengue (DENV), e virus Chikungunya (CHIKV). I nostri metodi sono sufficientemente flessibili per permettere co-espressione delle molteplici proteine ​​strutturali da più plasmidi di espressione, o un singolo plasmide di espressione (Figura 1). In precedenza, abbiamo prodotto e purificato H5N1 VLP assemblato dalla co-espressione di plasmidi che codificano emoagglutinina influenza (HA), neuraminidasi (NA), e matrice (M1) in embrionali cellule 293T renali umane 5,6. I geni sono stati codone-ottimizzati per l&#39;espressione in cellule di mammifero e clonati in pTR600, un vettore di espressione eucariotica contenente i citomegalovirus immediato inizio promotore più INTRON A per avviare transcrizione di inserti eucariotiche e il segnale di poliadenilazione ormone della crescita bovina per la terminazione della trascrizione 7. Un approccio simile utilizzando tre plasmide co-espressione di HA, NA (Figura 1A) e una proteina della matrice virale alternativa, HIV Gag p55, è stato utilizzato per la generazione di influenza stagionale sottotipo umana H3N2 VLP in questo studio e ha dimostrato di generare VLP di dimensioni simili come particelle influenzali 8. Anche se vaccini contro l&#39;influenza prevalentemente suscitano anticorpi anti-HA, l&#39;aggiunta di neuraminidasi dell&#39;influenza media attività sialidasi per consentire VLP in erba da cellule trasfettate 9 e presenti anche gli obiettivi immunogenico aggiuntivi. Per produrre RSV VLP, abbiamo anche scelto il nucleo non collegato di HIV Gag per progettare vaccini prototipo che presentano glicoproteine ​​di superficie esclusivamente RSV per dimostrare ulteriormente la flessibilità della formazione VLP con HIV Gag, come descritto in precedenza e caratterizzato da microscopia elettronica 6,10. Altrihanno precedentemente dimostrato che VLP presentando glicoproteine ​​RSV possono essere assemblati utilizzando vari componenti virali da virus della malattia di Newcastle (NDV) 11, e l&#39;influenza di matrice 12. Full-length sequenze glicoproteina di superficie sono stati utilizzati in questo studio per mantenere conformazioni nativi che possono essere necessari per il recettore funzionale di legame e il dosaggio degli anticorpi riconoscimento attraverso test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). I nostri esempi di utilizzo di sistemi di singola espressione plasmide per generare particelle sono DENV e CHIKV. Nel caso di DENV, possiamo produrre particelle subvirale (SVP) senza capside in cellule 293T da un singolo plasmide contenente un PRM / E gene strutturale cassetta di espressione 13. Il termine SVP viene usato per indicare la mancanza di una proteina core o capside nell&#39;assemblaggio di proteine ​​strutturali virali. CHIK VLP può anche essere prodotto utilizzando un singolo plasmide contenente un CHIKV cassette gene strutturale, capside codifica e busta proteine, o in icellule nsect infettando con un baculovirus ricombinante che codifica per la stessa cassetta gene strutturale ottimizzato per l&#39;espressione di cellule di insetto (Figura 1B - C). Il risultato finale dell&#39;espressione approcci sopra discusso è il rilascio di VLP nel mezzo di coltura cellulare che possono poi essere purificato mediante ultracentrifugazione attraverso un cuscino glicerolo 20%. In questo rapporto, presentiamo i metodi per esprimere e purificare queste VLP da sistemi cellulari di mammiferi e insetti.

<table><tbody><tr><td>Maxi kit di plasmidi</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Life Technologies</td><td>L3000075</td><td>Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Sistema di espressione del baculovirus</td><td>Life Technologies</td><td>10359-016</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di agitazione multipunto Cimarec I 6</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50094596</td><td></td></tr><tr><td>Provette per ultracentrifuga Polyclear</td><td>Seton</td><td>7025</td><td>Confermare le provette appropriate per l'ultracentrifuga e le dimensioni del secchio</td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine Micro BCA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Tampone citrato fosfato</td><td>Sigma</td><td>P4922</td><td></td></tr><tr><td>o-fenilendiammina dicloridrato&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8287</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; m filtro sottovuoto superiore (500 ml)</td><td>Nalgene</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Sigma</td><td>339741&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10902-096</td><td></td></tr></tbody></table>

espressione e purificazione di particelle virus-simili per la vaccinazione

Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

particelle virus-simili (VLP) e particelle subvirale (SVP) sono un approccio alternativo per la progettazione di vaccini virali che offre i vantaggi di una maggiore sicurezza biologica e stabilità oltre l&#39;uso di agenti patogeni dal vivo. Non infettive e di auto-assemblaggio, VLP sono utilizzati per presentare proteine ​​strutturali come immunogeni, bypassando la necessità di agenti patogeni dal vivo o vettori virali ricombinanti per la consegna antigene. In questo articolo, abbiamo dimostrato le diverse fasi di progettazione VLP e sviluppo per applicazioni future in sperimentazione animale preclinico. Il procedimento comprende le seguenti fasi: selezione di antigene, espressione dell&#39;antigene in linea cellulare di scelta, purificazione di VLP / SVP, e quantificazione per il dosaggio dell&#39;antigene. Dimostriamo uso di entrambe le linee cellulari di mammiferi e insetti per l&#39;espressione dei nostri antigeni e dimostrare come le metodologie differiscono nella resa. La metodologia presentata può applicare a una varietà di agenti patogeni e può essere ottenuto sostituendo gli antigeni con str immunogenicoproteine ​​uctural di microrganismo dell&#39;utente di interesse. VLP e SVP assistono con caratterizzazione dell&#39;antigene e la selezione dei migliori candidati vaccini.

rendimenti VLP erano variabili in base alla progettazione di antigene virale costrutto. In questo protocollo, abbiamo dimostrato l&#39;uso di cellule di insetto e di mammiferi per la produzione di SVP o VLP nel surnatante e purificazione da ultracentrifugazione. Quattro sottotipi di DENV PRM / E gene strutturale cassette di espressione sono stati usati per costruire le versioni di DENV SVP (delimitate da 1-4) nella tabella 1 e dimostrare un range compreso tra 1,1-2,6 mg ...

Qui, vi presentiamo un protocollo per la sintesi di particelle virus-simili che utilizzano sia baculovirus o sistemi di espressione di mammifero, e la purificazione ultracentrifugazione. Questo approccio altamente personalizzabile viene utilizzato per identificare antigeni virali come bersagli vaccino in modo sicuro e flessibile.

Espressione e purificazione di particelle virus-simili per la vaccinazione

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...

L'obiettivo generale di questa procedura è purificare particelle simili a virus, o VLPs, espresse e secrete da sistemi di espressione in cellule di mammifero o in cellule di insetto. Questo metodo può rispondere a domande fondamentali nel campo della vaccinologia, ad esempio come esprimere e purificare antigeni virali conformazionalmente rilevanti in modo sicuro e flessibile. Il principale vantaggio di questa tecnica è che non richiede la precipitazione delle proteine mediante polietilene glicole né la preparazione di strati di densità multipli per concentrare le VLPs.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni utili per l'identificazione di antigeni virali come bersagli vaccinali, le VLP possono essere utilizzate anche come strumenti per la diagnosi delle malattie e la sierologia. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché l'utilizzo di un sottile strato di glicerolo durante i passaggi di risospensione delle VLP è difficile da apprendere, in quanto i principianti potrebbero non adottare la tecnica corretta. Nel giorno della transfezione, preparare le soluzioni di liposomi e di DNA seguendo le raccomandazioni del produttore.Trasfettare le cellule con una composizione di DNA in rapporto uno a uno a due di HA rispetto a NA rispetto a Gag e una quantità totale di DNA di 40 microgrammi per fiasca T150. Ripetere questo passaggio per ottenere nove fiasche T150, per un volume totale di 200 millilitri. Successivamente, diluire le soluzioni di DNA e liposomi in un mezzo di trasfezione privo di siero e antibiotici, in modo che ogni fiasca contenga un volume totale di 24 millilitri.Riportare le fiasche nell'incubatore e mantenere le cellule e il mezzo di coltura di transfezione fino al giorno della raccolta di particelle simili a virus, o VLP. Trasferire il sopranatante in provette coniche da 50 millilitri per raccogliere la coltura dalle cellule dopo 72-96 ore dalla transfezione. Centrifugare le cellule per formare un pellet dei detriti cellulari.Prelevare i soprannatanti e filtrarli attraverso una membrana da 0,22 micron. Coltivare le cellule di *Spodoptera frugiperda*, o cellule Sf9, precedentemente preparate, in sospensione in fiaschi agitatori, mescolando continuamente a 130 rpm su un sistema di piastre agitatrici multipunto. Mantenere i volumi di coltura non superiori alla metà del volume del fiasco agitatore per un’adeguata aerazione.Successivamente, esprimere i VLP di CHIK infettando 250 millilitri di cellule Sf9 in un matraccio agitato a una densità di due volte dieci alla sesta cellule per millilitro con il baculovirus ricombinante precedentemente preparato, quindi reinserire le cellule in un incubatore a 28 gradi Celsius. Utilizzare l'esclusione al blu di tripano per determinare se la vitalità cellulare è diminuita al 70-80%. Dopo aver confermato, trasferire le colture direttamente in sospensione in provette coniche da 50 millilitri e centrifugare le cellule. Raccogliere i soprannatanti e filtrarli attraverso una membrana da 0,22 micron prima della sedimentazione.Sterilizzare sei provette aperte per ultracentrifuga da 25 millimetri per 89 millimetri con etanolo al 70%. Assicurarsi quindi che l'etanolo sia completamente evaporato. Caricare 32 millilitri di sopranatanti nelle provette pulite.Successivamente, stratificare attentamente i soprannatanti con tre millilitri di glicerolo sterile al 20% in PBS. Aggiungere il glicerolo lentamente per evitare di disturbare il sottile strato di densità tra il glicerolo e la soluzione di VLP. Se il glicerolo viene dispensato troppo rapidamente, le soluzioni di glicerolo e di VLP si mescoleranno, riducendo la sedimentazione dei VLP.Assicurarsi che i tubi siano bilanciati, quindi avviare la centrifugazione. Dopo quattro ore, rimuovere i tubi dalla centrifuga. Aspirare il soprannatante, avendo cura di non disperdere il pellet dal tubo.Risospendere i VLP sedimentati in almeno 100 microlitri nel fondo delle provette con PBS sterile, aspirando e dispensando delicatamente e lentamente con una pipetta. La risospensione del pellet di VLP deve essere effettuata con ripetute aspirazioni ed espulsioni lente e delicate di PBS mediante pipetta. Evitare la formazione di bolle per limitare la perdita di VLP.Infine, conservare i VLP risospesi. I volumi di VLP e la resa totale di proteine ottenuti da un saggio BCA convenzionale sono stati ricavati da una varietà di costrutti SVP e VLP. Le rese di SVP di CHIK da cellule Sf9 variano tra 0,008 e 0,016 milligrammi di proteina totale per millilitro di volume del supernatante.Mentre la produzione mediante cellule mammaliane 293 T comporta una riduzione dieci volte maggiore della quantità di proteina. Questa immagine di microscopia elettronica mostra che le VLP di influenza contenenti il core HA Gag vengono espresse, assemblate e purificate con successo come VLP. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di trasfettare e infettare soltanto colture cellulari sane e vitali, poiché ciò influirà sui livelli complessivi di espressione proteica.Al termine di questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come i saggi BCA, ELIZA e HA per misurare rispettivamente il contenuto totale di proteine, il contenuto di antigene specifico e l'espressione della proteina HA funzionale. Ricordare che lavorare con un ultracentrifugo può essere pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni come bilanciare le provette, utilizzare esclusivamente rotori e velocità raccomandati e supervisionare adeguatamente il personale nuovo in laboratorio durante l'esecuzione di questa procedura.

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Fluorescence-Based Detection and Purification of Recombinant Vaccinia Virus

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