Quantificazione e analisi della formazione di HO-endonucleasi Stimolato traslocazioni cromosomiche da Single-Strand Ricottura in Saccharomyces cerevisiae

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare il controllo genetico della formazione di traslocazione mediante inginocchiamento a singolo filamento in cellule di lievito in gemmazione diploide. Ciò si ottiene inoculando prima le colture con singole colonie di un genotipo specifico e facendole crescere durante la notte. La seconda fase della procedura consiste nell'indurre la formazione simultanea di rotture a doppio filamento mediante endonucleasi ho su due cromosomi mediante l'aggiunta di galattosio alle colture.

La successiva diluizione di queste colture viene placcata su terreni selettivi e non selettivi. Il passo finale consiste nel determinare la frequenza di traslocazione contando le colonie che si verificano su terreni selettivi e non selettivi. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano il controllo genetico della formazione di traslocazione da parte di un singolo filamento, un inginocchiamento attraverso cambiamenti nella frequenza di formazione di traslocazione stimolata in ceppi di diversi genotipi.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alle conseguenze dell'esposizione terapeutica alle radiazioni dei pazienti oncologici perché le rotture del doppio filamento di DNA e la formazione di traslocazioni sono le conseguenze primarie di questo trattamento. Per iniziare la procedura per determinare le frequenze di traslocazione stimolate, inoculare da 10 a 20 colture indipendenti da un millilitro di terreno di lattato di glicerolo con picco Y con singole colonie del genotipo desiderato, incubare le colture per una notte a 30 gradi Celsius su un rotatore. Quando le colture hanno raggiunto la densità cellulare desiderata, aggiungere il 20% di galattosio alle colture fino a una concentrazione finale del 2%Il galattosio indurrà l'espressione dell'endonucleasi ho, che dirigerà le rotture del doppio filamento all'allele prim delta cinque sulla storia del cromosoma tre sul cromosoma tre e ha tre alleli delta tre prim sul cromosoma 15 incubare per quattro ore a 30 gradi Celsius su un rotatore.

Il passo successivo è fondamentale per il successo della procedura. Un'attenta diluizione e impiattamento delle colture è imperativa. Se si desidera ottenere frequenze di traslocazione sufficientemente riproducibili da consentire confronti statisticamente significativi tra ceppi di genotipo diverso: dopo quattro ore di diluizione appropriata delle colture su terreno privo di istidina e su YPD td, circa 100-200 colonie per piastra, incubare le piastre a 30 gradi Celsius per due o tre giorni.

Quando si formano le colonie, è possibile determinare la frequenza di traslocazione. L'efficienza della placcatura prima e dopo l'induzione dell'espressione dell'endonucleasi ho indicherà se la presenza o l'assenza di uno dei cromosomi di traslocazione influisce sulla capacità di sopravvivere alla formazione di DSB. Questo frammenta una copia sia del cromosoma tre che del cromosoma 15 per determinare l'efficienza della placcatura pre-induzione.

Innanzitutto, rimuovere un'aliquota di cellule da ciascuna coltura notturna e determinare il numero di cellule contando con un emocitometro. Successivamente, utilizzare una diluizione appropriata per placcare circa 100-200 cellule su YPD incubato per due o tre giorni a 30 gradi Celsius fino alla comparsa delle colonie. Aggiungere il 20% di galattosio alle restanti colture fino a una concentrazione finale del 2% e incubare a 30 gradi Celsius per quattro ore per determinare l'efficienza della placcatura post-induzione.

Rimuovere un'aliquota di cellule da ciascuna coltura dopo quattro ore dall'induzione e determinare il numero di cellule mediante emocitometro Contare su piastra circa 100-200 cellule utilizzando un'appropriata diluizione su YPD incubare per due o tre giorni a 30 gradi Celsius fino alla formazione di colonie. Una volta che le colonie si formano sulle piastre, è possibile determinare l'efficienza della placcatura. I cloni portatori di traslocazione putativa possono essere esaminati mediante southern blot.

Questa procedura utilizza il DNA genomico preparato da un singolo sibilo più una colonia ricombinante da ogni studio indipendente, digerisce circa quattro microgrammi di ciascun campione di DNA con BAM H, un'endonucleasi di restrizione separata BAM H, uno frammenti digeriti su un she allo 0,7% e quindi trasferisce su una membrana di nylon caricata positivamente ibridata con una sonda marcata con P 32, ottenuta mediante priming casuale con un clone genomico da 1,8 KILOBASE, BMH, un BMH, un contenente l'HIS tre gene. Visualizzazione di frammenti di DNA mediante autoradiografia o imaging fosfo. Un altro modo per esaminare i cloni portatori di traslocazione putativa è l'analisi dei grafici cromosomici.

I cromosomi vengono prima preparati da sibilo selezionato più ricombinanti in tappi aros, cromosomi separati su un gel all'1% di aros in un campo elettrico omogeneo bloccato al contorno o chef a 14 gradi Celsius. Vengono utilizzati i seguenti parametri: primo blocco 14 gradi Celsius, 72° tempo di commutazione e 15 ore a sei volt centimetro, secondo blocco, 14 gradi Celsius, 122° tempo di commutazione e 11 ore a sei volt per centimetro. Al termine dell'elettroforesi, visualizzare i cromosomi colorando il gel con bromuro AUM per 30 minuti, quindi irradiando con UV e trattenendo e trasferendo i cromosomi con acqua distillata su una membrana caricata positivamente per azione capillare.

Le condizioni di denaturazione si ibridano con una sonda marcata con P 32 ottenuta mediante priming casuale con un clone genomico da 1,8 kilobasi bam H un bam H one contenente il sibilo. Tre geni visualizzano i cromosomi mediante autoradiografia o imaging fosfo. La frequenza delle traslocazioni cromosomiche può essere calcolata dividendo il numero di colonie fototrofiche di istamina per il numero totale di cellule vitali determinato mediante placcatura su YPD.

In questo esempio, la frequenza di ricombinazione calcolata è di circa il 3%Il test per le frequenze di traslocazione stimolate può essere condotto utilizzando ceppi di diversi genotipi per confrontare le differenze nella capacità di riparare le rotture del doppio filamento per singolo filamento. Un inginocchiamento come mostrato in questo grafico rappresentativo. Le frequenze di traslocazione ottenute sia selettivamente che non selettivamente con l'omozigote nullo delta RAD 51 erano statisticamente diverse da quelle ottenute utilizzando le condizioni corrispondenti con il ceppo wild type sia pre che post induzione plating.

Le efficienze sono determinate dividendo il numero totale di cellule formanti colonie vitali per il numero totale di corpi cellulari nella coltura determinato dalla conta dell'emocitometro come mostrato in questa tabella prima e dopo la placcatura di induzione. Le efficienze non erano significativamente diverse per le cellule wild type, il che suggerisce che la presenza o l'assenza di entrambi i cromosomi di traslocazione non influisce sulla capacità di sopravvivenza. Formazione DSB.

I cloni portatori di traslocazione putativa possono essere esaminati mediante analisi genomica del southern blot. Qui viene mostrata una rappresentazione grafica dei cromosomi rilevanti prima e dopo la formazione della traslocazione. Dimensioni dei frammenti di restrizione contenenti sequenze rilevanti generate dalla digestione BAM H one di DNA genomico da ceppi genitori e ricombinanti e rivelate su blot mediante ibridazione con una BAM H da 1,8 kilobasi.

I suoi tre cloni genomici sono elencati in coppie di kilobasi per l'analisi del southern blot. Il DNA genomico viene digerito con un'endonucleasi BMH one e ibridato in una base di 1,8 kilobasi marcata con P 32. HIS tre sonde per visualizzare questi frammenti diagnostici.

0,8 kilobase HIS tre delta 201,7 kilobase sibilo tre delta tre primi quattro kilobase T 3 15 5 kilobase T 15 tre e otto kilobasi sibilo tre delta cinque primi frammenti. La corsia A è il diploide genitore. La corsia B è un ricombinante ricombinante sibilante più traslocazione non reciproca e la corsia C è una traslocazione reciproca più his.

L'analisi BLO cromosomica ricombinante può essere impiegata anche per esaminare cloni portatori di traslocazione. I cromosomi intatti preparati in tappi aros vengono separati mediante elettroforesi chef e il gel colorato con un bromuro di iridio e visualizzato sotto luce UV. I cromosomi separati vengono quindi tamponati in nylon e ibridati con il P 32 marcato 1,8 kilobase.

Le sue tre sonde per visualizzare il cromosoma intatto 1,1 megabase, 15,8 megabase, T 15, tre cromosoma di traslocazione, 0,6 megabase T, tre cromosoma di traslocazione 15 e 0,3 megabase cromosoma intatto, tre. La corsia A è l'elemento padre distribuito. La corsia B è il suo più la traslocazione reciproca ricombinante, e la corsia C è il suo più la traslocazione reciproca ricombinante.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare la frequenza di formazione della traslocazione a seguito di più rotture del doppio filamento stimolate ho.