Name: Quantificazione e analisi della formazione di HO-endonucleasi Stimolato traslocazioni cromosomiche da Single-Strand Ricottura in Saccharomyces cerevisiae /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Scopri come quantificare le traslocazioni cromosomiche indotte da HO-endonucleasi in Saccharomyces cerevisiae mediante ricottura di singolo filamento. Questo metodo permette di studiare il controllo genetico della formazione di traslocazioni.

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Questo lavoro è stato sostenuto da fondi del National Institutes of Health e del Beckman Research Institute della Città della Speranza. Vorremmo ringraziare i revisori per i loro commenti costruttivi che aggiunge chiarezza al manoscritto.

1. HO-stimolato traslocazione frequenze <ol><li> Inoculare 10-20 culture indipendenti 1 ml di YPGly / Lac media (1 estratto di lievito%, 2% peptone, 3% glicerolo e lattato 3%) con singole colonie del genotipo desiderato. Incubare le culture durante la notte, o per il tempo sufficiente a raggiungere una densità cellulare di circa 7-5x10 1x10 8 cellule / ml, a 30 ° C su un rotore, o con agitazione. </li><li> Aggiungi galattosio alle culture ad una concentrazione finale del 2% per indurre HO endonucleasi-diretto presso il DSB his3-Δ3 '(cromosoma III) e his3-Δ5' (cromosoma XV) substrati traslocazione. </li><li> Incubare per 4 ore a 30 ° C su un rotore, o con agitazione. </li><li> Dopo 4 h, diluizioni appropriato delle culture su YPD (1 estratto di lievito%, 2% peptone, 2% di destrosio) per produrre circa 100 a 200 colonie per piastra, e un numero sufficiente di cellule su istidina medio manca di produrre un osservabile Il suo numero di colonie + ricombinante. Incubare le piastre a 30 ° C per 2-3 giorni. </li></ol> NOTA: Passo 1,4 descrive la determinazione delle frequenze traslocazione in condizioni di placcatura selettiva delle culture su terreno istidina carente. Questa analisi può anche essere condotto sotto non selettivi condizioni di placcatura culture su YPD, e poi replica-plating le colonie che sorgono sul suo piastre-due-tre giorni dopo. Questi metodi producono frequenze simili di traslocazione (Figura 2C). <ol start="5"><li> Determinare la frequenza traslocazione dividendo il numero di colonie prototrophic istidina per il numero totale di cellule vitali placcato (determinato da diluizioni placcatura in YPD). Determinare la frequenza mediana traslocazione e il 95% intervallo di confidenza 15. </li></ol> 2. Placcatura efficienze <ol><li> Rimozione di una aliquota di cellule da ogni cultura un giorno all'altro, e di determinare il numero di cellulare da emocitometro conteggio (Baxter Healthcare Corporation del catalogo #:. B3178-1). </li><li> Piastra di circa 100 a 200 cellule utilizzando una diluizione appropriata sul YPD. Incubare per 2-3 giorni a 30 ° C (es. Per una cultura con una densità cellulare di 1x10 8 cellule / ml, si dovrebbe piatto 100-200 ml di una diluizione 10-5 per piastra). </li><li> Aggiungere 20% galattosio alle culture ad una concentrazione finale del 2%. </li><li> Dopo 4 ore, rimuovere un aliquota di cellule da ogni cultura, determinare il numero delle cellule dal conte emocitometro, e la piastra di circa 100 a 200 cellule utilizzando una diluizione appropriata sul YPD. Incubare per 2-3 giorni a 30 ° C. </li><li> Determinare l'efficienza placcatura dividendo il numero di colonie che appaiono sul YPD per il numero di cellule placcato, e moltiplicando questo quoziente per 100. Determinare la percentuale media con un intervallo di confidenza al 95%. </li></ol> 3. Genomica Southern blot <ol><li> Selezionare una singola sua colonia ricombinante + indipendente da ogni prova e prepararsi DNA genomico 16. </li><li> Digest circa 4 mg di DNA con endonucleasi di restrizione BamHI. </li><li> Separare BamHI digerito frammenti su un 0,7% gel, e trasferimento in una membrana di nylon carica positiva (Hybond N +, GE Healthcare Codice prodotto:. RPN303B) 17. </li><li> Ibridare con un P-32 etichettata sonda ottenuto da innesco casuale (Amersham Biosciences Codice prodotto:. RPN1604) con 1,8 kb BamHI / BamHI clone genomico contenente il gene HIS3. </li><li> Visualizza frammenti di DNA mediante autoradiografia o phosphorimaging. </li></ol> 4. Blot analisi cromosomica con cromosomi separati in un profilo-bloccato omogenea campo elettrico (CHEF): <ol><li> Preparare cromosomi scelto Sua ricombinanti + in spine agarosio 18: <ul><li> Crescere una cultura liquido del suo candidato + TXV:: III cromosoma contenenti ricombinante in 5 ml di YPD a circa 1-2 x 10 8 cellule / ml. </li><li> Spin down e lavare le cellule 2 volte con 50 mM EDTA. </li><li> Risospendere le cellule in circa 200 ml di 50 mM EDTA, e calda a 50 ° C. </li><li> Aggiungere un uguale volume di fuso 2% (w / v) bassa temperatura di fusione agarosio portato a 50 ° C, mescolare accuratamente. </li><li> Erogare circa 80 microlitri aliquote in stampi spina e lasciare raffreddare per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Estrudere prese dallo stampo in un 12-ben piatto. Fino a cinque spine può essere collocato in ciascun pozzetto. </li><li> Aggiungere 3 ml di soluzione preparata spheroplasting (14 mM 2-β-mercaptoetanolo, 20 mM EDTA, 0,5 mg / ml Zymolyase 20T, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 Sorbitolo M) in ciascun pozzetto. Incubare a 37 ° C per 4 ore con agitazione. </li><li> Rimuovere la soluzione spheroplasting e sostituire con 3 ml di soluzione LDS (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM EDTA, 1% (w / v) al litio solfato Dodecyl, adjust pH a 8,0). Incubare a 37 ° C per 15 min con agitazione. </li><li> Rimuovere la soluzione LDS e sostituirla con un'altra aliquota 3 ml di LDS. Incubare a 37 ° C per una notte e scuotendo con cautela. </li><li> Rimuovere LDS e sostituire con 3 ml di 0,2 X NDS (0,6 g di Tris base, 93 g di EDTA disodico diidrato, 5 g di N-Lauroyl Sarcosina, regolare il pH a 8,0, ha portato a 500 ml con dH 2 O). Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti con agitazione. Rimuovere NDS, e ripetere 2 volte. </li><li> Rimuovere NDS e sostituire con 3 ml di TE. Lavare con leggera agitazione per 30 minuti a temperatura ambiente. Ripetere 4 volte. </li><li> Conservare le spine a 4 ° C in 2 ml di TE. Spine può tenere fino a un anno. </li></ul></li><li> Cromosomi separati su un 1% gel utilizzando un Bio-Rad-CHEF DRII apparato a 14 ° C (Catalogo #: 170-3612). </li></ol> Parametri: 1 ° Blocco: interruttore '70 tempo, 15h a 6V/cm. 2 ° blocco: Interruttore orario 120s, 11h a 6V/cm <ol start="3"><li> Visualizza cromosomi dalla colorazione con bromuro di etidio 1μg/ml per 30 minuti, irradiando con 60 mJ di UV in un Stratalinker UV (Stratagene), e de-colorazione per 30 minuti in dH 2 O. Irradiando etidio bromuro cromosomi colorati nick il DNA per consentire l'efficiente trasferimento alla membrana. </li><li> Trasferimento cromosomi di una membrana a carica positiva (Hybond N +, GE Healthcare Codice prodotto:. RPN303B) per azione capillare in condizioni di denaturazione (0.4N NaOH, 1.5M NaCl). </li><li> Ibridare con un P-32 etichettata sonda ottenuto da innesco casuale (Amersham Biosciences Codice prodotto:. RPN1604) con 1,8 kb BamHI / BamHI clone genomico contenente il gene HIS3 17. </li><li> Visualizza cromosomi mediante autoradiografia o phosphorimaging. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Una rappresentazione grafica del test traslocazione è raffigurato a livello cromosomico (Figura 1). Uno schema della procedura sperimentale è anche (Figura 2A). Sia pre-e post-induzione efficienze placcatura sono determinate dividendo il numero totale di vitali, le cellule formanti colonie per il numero totale dei corpi cellulari nella cultura determinata dalla emocitometro count (Figura 4B). Pre-e post-induzione efficienze placcatura non sono risultati significativamente differenti per le cellule wild-type (p = 0,1400) (Tabella 1). <img src="/files/ftp_upload/3150/3150table1.jpg" alt="Tabella 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabella 1"> Tabella 1. Pre-e post-induzione efficienze placcatura in cellule wild-type. Il numero uno di corpi cellulari per millilitro sono determinate dal numero di emocitometro. b Il numero di cellule vitali per millilitro sono determinati dalla placcatura opportune diluizioni su terreno non selettivo per la produzione di ~ 100-200 colonie. c Le informazioni pre e post-induzione efficienze placcatura sono determinate dividendo il numero totale di vitale, formanti colonie, le cellule per il numero totale dei corpi cellulari nella cultura, determinato dal numero di emocitometro. Ciò suggerisce che la presenza o l'assenza di entrambi traslocazione cromosomica non influisce sulla capacità di sopravvivere formazione di DSB. La frequenza di traslocazioni cromosomiche può essere calcolato dividendo il numero di colonie prototrophic istidina per il numero totale di cellule vitali determinato dal piastrato su YPD (Figura 2B). Questa analisi può essere condotta utilizzando ceppi di genotipo diverso per capire come la perdita della funzione della proteina influenza SSA (cioè rad51Δ - / -). Frequenze di ricombinazione determinato in diversi ceppi possono essere rappresentati graficamente per confrontare le differenze nella capacità di questi ceppi di riparare il HO-endonucleasi DSB indotte da SSA (Figura 2C). Frequenze traslocazione ottenuti con il ceppo selvatico diploide sotto selettivo (2.2x10 -2) e non selettiva (2.17x10 -2) le condizioni non erano statisticamente differenti tra loro (p = 0,9131), mentre le frequenze traslocazione ottenuto selettivamente (6.0x10 -2) e non selettiva (11.9x10 -2) con la rad51Δ - / - omozigoti erano simili, ma statisticamente differenti (p-value = 0,0089). Le frequenze ottenuti sia selettivo (p-value = 0,0001) e non selettiva (p-value = 0,0002) con i pulsanti ° rad51 - / - omozigoti erano statisticamente differenti da quelli ottenuti utilizzando le condizioni in corrispondenza del ceppo selvatico. Putativo traslocazione portante cloni può essere ulteriormente esaminati da genomico Southern blot ed analisi cromosomica blot (Figura 3). Per l'analisi del sud, il DNA genomico viene digerito con endonucleasi BamHI prima di elettroforesi su gel di agarosio, blotting e ibridazione a 32P-etichettati 1.8kb HIS3 sonda per visualizzare la diagnostica 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 ', 4 kb tIII:: XV, 5 kb TXV:: III, e 8 kb his3-Δ5' frammenti (Figura 3B.1) . Cromosomi intatti possono essere preparati, separati da CHEF (Figura 3B.2), cancellati al nylon e ibridato con il 32 P-etichettati 1,8 kb HIS3 sonda per visualizzare la 1.1 Mb intatto cromosoma XV, 0,8 Mb TXV: traslocazione cromosomica III, 0,6 Mb tIII: traslocazione cromosomica XV, e 0,3 Mb intatto cromosoma III (Figura 3B.3). Una mappa grafica raffigurante previsto endonucleasi BamHI-digerito frammenti di DNA genomico, e genitore e cromosomi ricombinanti, è raffigurato (Figura 3A). <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Formazione traslocazione dei cromosomi da single-strand annealing (SSA). 1) DSB sono creati al his3-Δ3 'e his3-Δ5' substrati (cromosomi XV e III, rispettivamente) da endonucleasi HO dopo l'aggiunta di galattosio alle culture. 2) DSB sono trattati per generare 3 'a singolo fili alle estremità dei cromosomi rotti. 3) annealing macchinari SSA 311 complementari o 60 nucleotidi a singolo filamento HIS3 sequenze formate in ciascuno dei substrati ricombinazione. Non omologhe code formate sulla ricottura vengono rimossi dalla digestione endonucleasi. Complementari quattro sovrasta bp sui frammenti rimanenti cromosomica formata da HO-endonucleasi digestione può anche temprare. 4) La legatura conclude la creazione di un gene intatto HIS3 e TXV:: traslocazione cromosomica III da SSA. Le cellule che trasportano questo cromosoma possono essere selezionati per la loro capacità di crescere su medio istidina carente. Legatura può anche generare il reciproco tIII:: traslocazione cromosomica XV NHEJ da un meccanismo simile. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Test per determinare la frequenza di traslocazione da SSA. A) Un ml YPGly / Lac colture vengono inoculate con colonie di cellule di un genotipo selezionare e cresciuto fino a una densità appropriata di circa 7-5x10 1x10 8 cellule / ml. Galattosio viene aggiunto ad una concentrazione finale del 2% per creare DSB al substrati ricombinazione sui cromosomi III e XV. Per condurre il test in condizioni selettive, diluizioni appropriate fatta in modo che circa 100 a 200 cellule sono placcati su YPD e un numero sufficiente di cellule sono placcati su terreno privo di istidina produrre un numero osservabile della Sua colonie + ricombinante. Per condurre il test senza selezione, circa 100 a 200 cellule sono placcati su YPD, coltivate per due o tre giorni di singole colonie e poi replica placcata sul istidina media manca. B) frequenza di traslocazione può essere determinato dividendo il numero di colonie che crescono sul suo piastre per la frazione che crescono sul YPD. C) Le frequenze traslocazione di ceppi di genotipo diverso (cioè wild-type e rad51Δ - / -) può essere tracciata per confrontare le differenze nella capacità di questi ceppi per riparare i DSB da SSA. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Determinare l'efficienza placcatura. (A) un'aliquota di cellule è preso dalla cultura durante la notte prima e dopo induzione DSB, diluizioni sono apportate appropriate, seguita da un conteggio emocitometro per determinare il numero totale dei corpi cellulari per ml di cultura. Diluizioni appropriate sono placcati su terreno non selettivo per determinare il numero totale di cellule vitali per ml, contando le colonie che appaiono sul YPD. (B) L'efficacia placcatura è quindi determinato dividendo il numero totale di cellule vitali per il numero totale dei corpi cellulari, e moltiplicando questo quoziente per 100. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Rilevamento di eventi traslocazione cromosomica da genomico Southern blot e blot cromosoma. A) Rappresentazione grafica dei cromosomi rilevanti prima (a sinistra) e dopo (a destra) la formazione di traslocazione. Misure di genitore e cromosomi ricombinanti sono elencati nella megabase coppie (Mb). Dimensioni dei frammenti di restrizione contenenti sequenze rilevanti generate da BamHI digestione del DNA genomico da parenti ei ceppi ricombinanti, e ha rivelato su macchine da ibridazione con una kb 1,8 clone BamHI HIS3 genomico, sono elencati in kilobase coppie (kb). I cromosomi non sono in scala. B) Analisi fisica di presunti cloni di traslocazione-cuscinetto. (1) analisi genomica Southern blot - Il DNA genomico è stato raccolto e digerito con endonucleasi di restrizione BamHI, frazionato mediante elettroforesi su gel, blopreformato in nylon e ibridato a un P-32 etichettato 1,8 kb HIS3 sonda per visualizzare i seguenti frammenti: 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 ', 4 kb tIII:: XV, 5 kb TXV:: III, e 8 kb his3-Δ5 '. Corsie: a) diploide genitore, b) La sua + non reciproci traslocazione ricombinante, c) La sua traslocazione reciproca + ricombinante. (2) CHEF gel - cromosomi intatti sono stati preparati in spine agarosio, separati da CHEF, colorati con bromuro di etidio e visualizzati sotto raggi UV. Corsie: Come sopra. (3) macchine Cromosoma - cromosomi separati sono stati cancellati al nylon e ibridato con l'etichetta P-32 1,8 kb HIS3 sonda di visualizzare i cromosomi seguenti: 1.1 Mb intatto cromosoma XV, 0,8 Mb TXV: traslocazione cromosomica III, 0,6 Mb tIII: traslocazione XV cromosoma, e 0,3 Mb intatto cromosoma III. Corsie: Come sopra.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Alte dosi di radiazioni ionizzanti presentano un rischio intrinseco di instabilità del genoma attraverso la generazione di un gran numero di DSB 19. Genomi eucariotici sono pieni di sequenze ripetitive che sono substrati eccellenti per la generazione di traslocazioni e riarrangiamenti genomici altri 20,21. Traslocazioni cromosomiche da HR sono frequentemente osservate quando DSB sono introdotti tra sequenze ripetitive 12,21,22. Schiacciante evidenza suggerisce che gran parte l&#39;instabilità genomica associata a leucemie e linfomi possono essere attribuiti a traslocazioni cromosomiche, sottolineando l&#39;importanza di capire come questo meccanismo si verifica negli eucarioti 22,23. Abbiamo sviluppato un sistema di lievito per l&#39;esame della formazione dei cromosomi traslocazione di DSB indotte HR tra le regioni a corto di omologia su cromosomi diversi che sono di dimensioni simili a elementi ripetitivi dispersi in tutto il lievito e genoma umano. Nel saggio, il substrato traslocazione his3-Δ3 &#39;si trova su una copia del cromosoma XV. L&#39;altro his3 allele (his3-Δ200) ha un ~ cancellazione 1kb del promotore HIS3 e la sequenza di codifica che impedisce questa sequenza venga utilizzato come modello per la riparazione 24. Il substrato his3-Δ5 &#39;si trova nel locus LEU2 su una copia del cromosoma III, con l&#39;altra copia del cromosoma III che contiene un inalterata LEU2 allele (Figura 1). Un galattosio-inducibile cassetta endonucleasi HO espressione contrassegnati con KAN-MX è stato inserito nel locus TRP1 del cromosoma IV (TRP1:: GAL-HO-KAN-MX). Ogni substrato traslocazione è affiancata da un HO-endonucleasi sequenza di riconoscimento che può essere oggetto di scissione da indurre l&#39;espressione del gene HO attraverso l&#39;aggiunta di galattosio al mezzo. Dopo la scissione HO-endonucleasi che agiscono sui his3-Δ3 &#39;e his3-Δ5&#39; substrati, le cellule possono utilizzare in modo efficiente il tratto comune a corto di HIS3 omologia di sequenza (311 bp e 60 bp) per riparare i cromosomi rotto da HR, generando una traslocazione cromosomica con un intatto HIS3 allele 12-14,25. Perché le cellule genitore manca una copia intatta del gene HIS3, non sono in grado di crescere sul suo mezzo. Solo le cellule che hanno subito l&#39;evento traslocazione può essere selezionato per il medio istidina carente. Pertanto, la frequenza di traslocazioni cromosomiche può essere calcolato dividendo il numero di colonie prototrophic istidina per il numero totale di cellule vitali placcato, determinato da piastrato su YPD. DNA genomico e cromosomi intatti possono quindi essere isolate dal rappresentante sue colonie +, e la presenza di un cromosoma traslocazione verificato da genomico Southern Blot e analisi dei cromosomi. Attenta analisi ci ha permesso di raccogliere ulteriori importanti informazioni sul test 12. Genomica analisi Southern blot ha dimostrato che non vi è il taglio quasi totale di cromosomi XV e III dopo 30 minuti di HO-endonucleasi induzione, e quindi non c&#39;è sfondo significativo di uncut substrati cromosomiche nella popolazione (G. &amp; A. Manthey Bailis, risultati non pubblicati). Genomico analisi Southern blot e del suo cromosoma - sopravvissuti indica che le cellule perdono spesso uno, l&#39;altro o entrambi i cromosomi taglio e rimanere vitale (L. Liddell &amp; A. Bailis, risultati non pubblicati). È importante sottolineare che le efficienze placcatura quasi equivalente a quello non selettivo, prima e dopo l&#39;induzione di espressione di HO-endonucleasi indica che né la mancata riparazione cromosomi rotti, né il fallimento di mantenere cromosomi traslocazione influisce sulla capacità di sopravvivere formazione di DSB. Coerentemente con questo, il TXV: traslocazione cromosomica III ha dimostrato di essere instabile in cellule mitotiche in assenza di selezione. Questo è stato dimostrato da una crescente TXV:: III contenente la sua ricombinanti + pernottamento non-selettivo, placcatura singole colonie su piastre non selettivo, e placcatura replica su terreno selettivo privo istidina. Dieci al 70% delle colonie derivanti da questi piatti hanno perso la TXV:: traslocazione cromosomica III (N. Pannunzio &amp; A. Bailis, risultati non pubblicati). Traslocazione cromosomi generati dall&#39;esposizione IR negli esseri umani mostrano una simile instabilità 26. Questo suggerisce che la formazione di traslocazione può contribuire a eventi precoci nella tumorigenesi attraverso la promozione di perdita di eterozigosi. In secondo luogo, estese analisi genetiche e molecolari suggeriscono che SSA, un meccanismo efficiente e obbligatoriamente non conservative di AR, è il meccanismo principale della formazione di traslocazione da HR a seguito della creazione simultanea di DSB su due cromosomi 12,27,28. Questo è consistent con la constatazione che grandi dosi di risultato IR in una densità di DSB sufficiente a creare interruzioni adiacente a più sequenze ripetitive nel genoma del lievito, e una frequenza elevata di formazione traslocazione da HR. Insieme, queste osservazioni suggeriscono che l&#39;effetto oncogeno di esposizione IR negli esseri umani possono, in parte, derivare dalla riparazione di DSB da un meccanismo efficiente di risorse umane che genera traslocazioni che, attraverso la loro instabilità intrinseca, promuovere cambiamenti genetici che tumorigenesi lancio. Poiché la radiazione è spesso usato per curare il cancro, riarrangiamenti del genoma che risultano dalla riparazione di DSB indotte da radiazioni possono contribuire alla generazione di tumori secondari che si presentano frequentemente nei pazienti. Così, questo modello può aiutarci ad acquisire una migliore comprensione delle basi genetiche e molecolari di un&#39;importante risposta clinica al trattamento IR.

quantificazione e analisi della formazione di ho-endonucleasi stimolato traslocazioni cromosomiche da single-strand ricottura in saccharomyces cerevisiae</em

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

Variazione genetica è spesso mediata da riarrangiamenti genomici che emergono attraverso l&#39;interazione tra i dispersi elementi ripetitivi presenti in ogni genoma degli eucarioti. Questo processo è un importante meccanismo per la generazione di diversità tra e all&#39;interno degli organismi 1-3. Il genoma umano è costituito da circa il 40% sequenza ripetitiva di origine retrotrasposoni, tra cui una varietà di linee e SINE 4. Eventi di scambio tra questi elementi ripetitivi può portare a riarrangiamenti del genoma, tra cui le traslocazioni, che possono interrompere il dosaggio del gene e di espressione che può portare a malattie autoimmuni e cardiovascolari 5, così come il cancro negli esseri umani 6-9. Scambio tra gli elementi ripetitivi si verifica in una varietà di modi. Scambio tra le sequenze che condividono perfetto (o quasi perfetta) omologia si verifica da un processo chiamato ricombinazione omologa (HR). Al contrario, non omologhe fine unirsi (NHEJ) usa poco o non-omologia di sequenza per lo scambio di 10,11. Lo scopo principale di AR, in cellule mitotiche, sia per riparare rotture del doppio filamento (DSB) generati endogenamente dalla replica del DNA aberrante e lesioni ossidative, o da esposizione a radiazioni ionizzanti (IR), e altri agenti dannosi DNA esogeno. Nel test qui descritto, DSB sono creati simultaneamente al confine con substrati ricombinazione a due diversi loci cromosomici nelle cellule diploidi da un galattosio-inducibile HO-endonucleasi (Figura 1). La riparazione dei cromosomi rotti genera traslocazioni cromosomiche dal singolo filamento ricottura (SSA), un processo in cui le sequenze omologhe adiacenti alle estremità dei cromosomi sono uniti covalentemente successivamente alla ricottura. Uno dei substrati, his3-Δ3 &#39;, contiene un 3&#39; troncato HIS3 allele e si trova su una copia del cromosoma XV al locus nativo HIS3. Il secondo substrato, his3-Δ5 &#39;, si trova nel locus LEU2 su una copia del cromosoma III, e contiene un 5&#39; troncato HIS3 allele. Entrambi i supporti sono affiancate da un sito di riconoscimento HO endonucleasi che possono essere oggetto di incisione da HO-endonucleasi. HO siti di riconoscimento endonucleasi nativi del locus MAT, su entrambe le copie del cromosoma III, sono stati soppressi tutti i ceppi. Questo impedisce l&#39;interazione tra i substrati ricombinazione e gli altri finisce cromosoma rotto di interferire nel saggio. La KAN-MX-segnato galattosio-inducibile cassetta endonucleasi HO espressione è inserita nel locus TRP1 sul cromosoma IV. La quota substrati 311 bp e 60 bp della sequenza HIS3 di codifica che possono essere utilizzati dalla macchina HR per la riparazione di SSA. Celle che utilizzano questi substrati per riparare i cromosomi rotto da HR formare una intatta HIS3 allele e una TXV:: traslocazione cromosomica III che possono essere selezionati dalla capacità di crescere sulla istidina medio manca (Figura 2A). Frequenza traslocazione da HR è calcolato dividendo il numero di colonie prototrophic istidina che sorgono sul terreno selettivo per il numero totale di cellule vitali che si presentano dopo la placcatura opportune diluizioni su terreno non selettivo (Figura 2B). Una varietà di mutanti di riparazione del DNA sono stati utilizzati per studiare il controllo genetico della formazione di traslocazione di SSA utilizzando questo sistema 12-14.

L&#39;HO-stimolato test traslocazione monitor singolo filamento di ricottura seguito alla creazione di DNA a doppio filamento a loci multipli in diploidi<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Questo meccanismo può modello di riarrangiamenti del genoma nelle cellule somatiche di eucarioti superiori in seguito all&#39;esposizione ad alte dosi di radiazioni ionizzanti.

Quantificazione e analisi della formazione di HO-endonucleasi Stimolato traslocazioni cromosomiche da Single-Strand Ricottura in Saccharomyces cerevisiae</em

La variazione genetica è frequentemente mediata da riarrangiamenti genomici che originano dall'interazione tra elementi ripetitivi dispersi presenti in ogni...

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare il controllo genetico della formazione di traslocazioni mediante il ripiegamento a singolo filamento in cellule diploidi di lievito in gemmazione. Questo viene ottenuto innanzitutto inoculando colture con singole colonie di un genotipo specifico e coltivandole per tutta la notte. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'indurre la formazione simultanea di rotture a doppio filamento mediante l'endonucleasi Ho su due cromosomi, aggiungendo galattosio alle colture.Successivamente, questi colture vengono diluite e seminate su terreni selettivi e non selettivi. L'ultimo passaggio consiste nel determinare la frequenza di traslocazione contando le colonie sviluppatesi sui terreni selettivi e non selettivi. Alla fine, si possono ottenere risultati che mostrano il controllo genetico della formazione di traslocazioni da parte del singolo filamento, mediante variazioni nella frequenza di formazione di traslocazioni indotte da ho in ceppi di diverso genotipo.Le implicazioni di questa tecnica riguardano le conseguenze dell'esposizione a radiazioni terapeutiche nei pazienti affetti da cancro, poiché la formazione di rotture a doppio filamento del DNA e di traslocazioni costituisce l'effetto principale di questo trattamento. Per iniziare la procedura di determinazione delle frequenze di traslocazione indotta, inoculare da 10 a 20 colture indipendenti di un millilitro di mezzo glicerolo-lattato Y in presenza di singole colonie del genotipo desiderato, quindi incubare le colture tutta la notte a 30 gradi Celsius su un agitatore rotante. Quando le colture hanno raggiunto la densità cellulare desiderata, aggiungere il 20% di galattosio alle colture fino a una concentrazione finale del 2%. La galattosio indurrà l'espressione dell'endonucleasi ho, che provocherà rotture a doppio filamento nell'allele *his3-δ5'* sul cromosoma tre e nell'allele *his3-δ3'* sul cromosoma 15; incubare per quattro ore a 30 gradi Celsius su un agitatore rotante.Il passaggio successivo è fondamentale per il successo della procedura. Una diluizione e un’allestimento accurati delle colture sono essenziali. Se si ottengono frequenze di traslocazione sufficientemente riproducibili da permettere confronti statisticamente significativi tra ceppi di diverso genotipo, dopo quattro ore allestire su piastra la diluizione appropriata delle colture su mezzo privo di istidina, nonché su YPD, con circa da 100 a 200 colonie per piastra; incubare le piastre a 30 gradi Celsius per due o tre giorni.Quando compaiono le colonie, è possibile determinare la frequenza di traslocazione. Le efficienze di semina prima e dopo l'induzione dell'espressione dell'endonucleasi ho indicheranno se la presenza o l'assenza di uno dei cromosomi traslocati influisce sulla capacità di sopravvivere alla formazione di rotture a doppio filamento (DSB). Tali frammenti una copia sia del cromosoma tre che del cromosoma 15 per determinare le efficienze di semina pre-induzione.Prima di tutto, prelevare un'aliquote di cellule da ciascuna coltura notturna e determinare il numero di cellule contando con un emocitometro. Successivamente, utilizzare un'opportuna diluizione per piastrare circa da 100 a 200 cellule su YPD e incubare per due o tre giorni a 30 °C fino alla comparsa di colonie. Aggiungere il 20% di galattosio alle colture rimanenti fino a una concentrazione finale del 2% e incubare a 30 °C per quattro ore per determinare l'efficienza di piastramento post-induzione.Prelevare un'aliquote di cellule da ciascuna coltura dopo quattro ore di induzione e determinare il numero di cellule mediante emocitometro. Seminare circa da 100 a 200 cellule su piastra utilizzando un'opportuna diluizione su YPD e incubare per due o tre giorni a 30 gradi Celsius fino alla comparsa di colonie. Una volta comparse le colonie sulle piastre, è possibile determinare l'efficienza di semina. Le clone portatrici di traslocazione putative possono essere analizzate mediante Southern blot.Questa procedura utilizza DNA genomico preparato da una singola colonia ricombinante di hiss proveniente da ciascun esperimento indipendente; digerire circa quattro microgrammi di ciascun campione di DNA con l'endonucleasi di restrizione BAM H1, separare i frammenti digeriti con BAM H1 su un gel di agarosio allo 0,7% e quindi trasferirli su una membrana di nylon positivamente carica. Ibridizzare con una sonda marcata con P-32 ottenuta mediante priming casuale, utilizzando un clone genomico BMH1 di 1,8 chilobasi contenente il gene HIS3. Visualizzare i frammenti di DNA mediante autoradiografia o fosfoimaging. Un altro modo per analizzare le colonie presumibilmente portatrici di traslocazione è l'analisi cromosomica mediante blot.I cromosomi vengono inizialmente preparati da ricombinanti hiss positivi e separati in un gel all'1% di aros in un campo elettrico omogeneo con clampaggio a contorno o CHEF a 14 gradi Celsius. Vengono utilizzati i seguenti parametri: primo blocco a 14 gradi Celsius, tempo di commutazione di 72 secondi e durata di 15 ore a sei volt per centimetro; secondo blocco a 14 gradi Celsius, tempo di commutazione di 122 secondi e durata di 11 ore a sei volt per centimetro. Al termine dell'elettroforesi, visualizzare i cromosomi colorando il gel con bromuro di AUM per 30 minuti, seguito da irradiazione con luce UV e successiva detenzione; trasferire quindi i cromosomi in una membrana carica positivamente mediante azione capillare.In condizioni denaturanti, si effettua l'ibridazione con una sonda marcata con P 32 ottenuta mediante priming casuale, utilizzando un clone genomico di 1,8 chilobasi bam H one bam H one contenente il gene hiss. Il gene viene visualizzato sui cromosomi mediante autoradiografia o phosphor imaging. La frequenza delle traslocazioni cromosomiche può essere calcolata dividendo il numero di colonie fototrofiche all'istamina per il numero totale di cellule vitali determinato tramite semina su YPD.In questo esempio, la frequenza di ricombinazione calcolata è di circa il 3%. Il saggio per le frequenze di traslocazione indotte da HO può essere eseguito utilizzando ceppi di diverso genotipo per confrontare le differenze nella capacità di riparare interruzioni a doppio filamento mediante singolo filamento. Un andamento come mostrato in questo grafico rappresentativo. Le frequenze di traslocazione ottenute sia in modo selettivo che non selettivo con l'omozigote nullo RAD51Δ erano statisticamente diverse da quelle ottenute utilizzando le condizioni corrispondenti con il ceppo di tipo selvatico, sia prima che dopo la piastratura induttiva.I rendimenti sono determinati dividendo il numero totale di cellule formanti colonie vitali per il numero totale di corpi cellulari nella coltura, determinato tramite conta con emocitometro, come mostrato in questa tabella prima e dopo la semina post-induzione. I rendimenti non sono risultati significativamente diversi per le cellule di tipo selvaggio, il che suggerisce che la presenza o l'assenza di uno qualsiasi dei cromosomi traslocati non influisce sulla capacità di sopravvivenza. Formazione di DSB.Le colture putative portatrici di traslocazione possono essere analizzate mediante analisi genomica con blot di Southern. Qui viene mostrata una rappresentazione grafica dei cromosomi rilevanti prima e dopo la formazione della traslocazione. Le dimensioni dei frammenti di restrizione contenenti le sequenze rilevanti, generati dalla digestione con BAM H uno del DNA genomico di ceppi parentali e ricombinanti e rivelati su membrane mediante ibridazione con una sonda di 1,8 chilobasi BAM H uno, sono indicate.I suoi tre cloni genomici sono elencati in coppie di chilobasi per l'analisi mediante Southern blot. Il DNA genomico viene digerito con l'endonucleasi BMH1 e ibridato con una sonda per l'HIS3 marcata al P32 di 1,8 chilobasi per visualizzare questi frammenti diagnostici.0,8 chilobasi HIS tre delta 201,7 chilobasi hiss tre delta tre prime 4 chilobasi T 3 15 5 chilobasi T 15 tre e 8 chilobasi hiss tre delta cinque prime frammenti. La corsia A è il diploide parentale. La corsia B è un ricombinante con traslocazione non reciproca hiss più e la corsia C è una traslocazione reciproca his più.L'analisi cromosomica BLO ricombinante può essere utilizzata anche per esaminare le linee cellulari portatrici di traslocazioni. I cromosomi integri, preparati in tappi di agarosio, vengono separati mediante elettroforesi CHEF e il gel viene colorato con bromuro di iridio e visualizzato sotto luce UV. I cromosomi separati vengono quindi trasferiti su membrana di nylon e ibridati con una sonda di 1,8 chilobasi marcata con P 32.Il suo tre sonde per visualizzare il cromosoma intatto di 1,1 megabasi, il cromosoma di traslocazione T 15 di 15,8 megabasi, il cromosoma di traslocazione T 3;15 di 0,6 megabasi e il cromosoma tre intatto di 0,3 megabasi. La corsia A è il progenitore dispiegato. La corsia B è A his più ricombinante con traslocazione non reciproca, e la corsia C è A his più ricombinante con traslocazione reciproca.Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare la frequenza di formazione di traslocazioni a seguito di molteplici rotture a doppio filamento indotte da ho.

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Quantificazione e analisi della formazione di HO-endonucleasi Stimolato traslocazioni cromosomiche da Single-Strand Ricottura in Saccharomyces cerevisiae /em (Video) | JoVE Journal

Quantificazione e analisi della formazione di HO-endonucleasi Stimolato traslocazioni cromosomiche da Single-Strand Ricottura in Saccharomyces cerevisiae

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