Mappatura di interazioni proteine-DNA con ChEC-seq nel gene-wide Saccharomyces cerevisiae

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare mappe genomiche delle interazioni proteina-DNA in situ con alta risoluzione e basso fondo, senza la necessità di reticolazione della formaldeide, solubilizzazione della cromatina o anticorpi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della trascrizione, ad esempio dove vari fattori regolatori si associano alla cromatina, rispetto alle regioni di regolazione genica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce mappe di legame genomico ad alta risoluzione con sfondo trascurabile ed evita le limitazioni associate ai protocolli ChEC-seq standard.

A dimostrare la procedura sarà Sebastian Grunberg, mio collega del Fred Hutchinson Cancer Research Center. Nel pomeriggio o nella sera del giorno precedente l'esperimento, iniziare una pre-coltura del ceppo sperimentale. Inoculare tre millilitri di peptone destrosio usato, o un terreno selettivo appropriato con una singola colonia del ceppo, recante il fattore marcato MNasi.

Incubare questa coltura per una notte in un incubatore shaker a 30 gradi Celsius. La mattina seguente, diluire la coltura notturna in 50 millilitri di terreno a una densità ottica a 600 nanometri da 0,2 a 0,3. Incubare la coltura nell'incubatore shaker fino a raggiungere una densità ottica a 600 nanometri da 0,5 a 0,7.

Preparare la quantità necessaria di tampone A più gli additivi e mantenerla a temperatura ambiente durante la procedura. Preparare le provette per microfugi per la raccolta dei campioni. Per ogni nuovo fattore analizzato, raccogliere campioni senza aggiunta di calcio e aggiungere 30 secondi, un minuto, 2,5 minuti, 5 minuti e 10 minuti dopo l'aggiunta di calcio.

Ad ogni provetta aggiungere 90 microlitri di soluzione stop e 10 microlitri di SDS al 10%. Quando la coltura ha raggiunto una densità ottica a 600 nanometri da 0,5 a 0,7, decantare la coltura in una provetta conica da 50 millilitri e centrifugare a 1.500 volte g per un minuto a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante, risospendere accuratamente le cellule in un millilitro di tampone A e trasferire le cellule risospese in una provetta per microfuge.

Pellettare le cellule risospese in una microfuga a 1, 500 volte g per 30 secondi a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante e risospendere accuratamente le cellule in un millilitro di tampone A pipettando su e giù. Pellettare le celle risospese a 1, 500 volte g per 30 secondi a temperatura ambiente.

Rimuovere il surnatante, risospendere le cellule in un millilitro di tampone A e centrifugare nuovamente. Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere accuratamente le cellule in 570 microlitri di tampone A.Aggiungere 30 microlitri di digitonina al 2% per facilitare la permeabilizzazione delle cellule e capovolgere per mescolare. Permeabilizzare le celle in un blocco termico a 30 gradi Celsius per cinque minuti.

Pipettare la reazione su e giù per garantire una distribuzione uniforme delle cellule. Come controllo negativo, trasferire 100 microlitri di aliquota di cellule permeabilizzate in una provetta per microfuge contenente la soluzione di arresto e SDS, e agitare brevemente per mescolare. Prima di iniziare il corso del tempo, è fondamentale avere i tubi della soluzione di arresto, la pipetta, i puntali delle pipette e un timer accanto ai blocchi di calore, in modo che i primi punti temporali possano essere raccolti in modo efficiente.

Per iniziare il corso del tempo, aggiungere 1,1 microlitri di cloruro di calcio monomolare alle cellule permeabilizzate per attivare la MNasi e capovolgere più volte rapidamente per mescolare. Riportare immediatamente la reazione mista a 30 gradi Celsius e avviare un timer. Ad ogni punto temporale da raccogliere, pipettare la reazione su e giù per garantire una distribuzione uniforme delle cellule, quindi rimuovere un'aliquota di 100 microlitri di cellule permeabilizzate in una provetta per microfugo contenente la soluzione di arresto e la SDS.

Agitare brevemente per mescolare. Una volta raccolti tutti i punti temporali, aggiungere quattro microlitri di 20 milligrammi per millilitro di proteinasi K a ciascun campione. Agitare brevemente per mescolare e incubare a 55 gradi Celsius per 30 minuti.

Aggiungere 200 microlitri di fenolo:cloroformio:alcol isoamilico a ciascun campione, agitare energicamente per mescolare e centrifugare alla massima velocità per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la fase acquosa in una nuova provetta. Aggiungere 30 microgrammi di glicogeno e 500 millilitri di etanolo al 100%.

Agitare energicamente per mescolare e precipitare su ghiaccio secco per 10 minuti, o fino a quando la soluzione non è viscosa. Pellettare il DNA precipitato centrifugando alla massima velocità e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Decantare il surnatante e lavare ogni pellet con un millilitro di etanolo al 70% a temperatura ambiente.

Decantare l'etanolo e rimuovere il resto capovolgendolo e picchiettando delicatamente i tubi su un tovagliolo di carta. Centrifugare brevemente i campioni utilizzando una centrifuga da banco, quindi utilizzare una pipetta per rimuovere l'etanolo residuo, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Asciugare i pellet all'aria a temperatura ambiente per cinque minuti.

Mentre i pellet di DNA si asciugano, fare una miscela master di tampone Tris e RNasi A per risospendere i pellet una volta essiccati e vortice per mescolare. Aggiungere 30 microlitri della soluzione di RNasi A a ciascun pellet di DNA essiccato, vorticare per mescolare e incubare a 37 gradi Celsius per 20 minuti per digerire l'RNa. Dopo 20 minuti, mescolare un microlitro di colorante da carico DNA 6X con cinque microlitri di ciascun campione e far funzionare un gel di agarosio all'1,5% a 120 volt per 40 minuti.

Iniziare la procedura di selezione delle dimensioni aggiungendo a ciascun campione 75 microlitri di perle SPRI in una soluzione di polietilenglicole. Pipettare su e giù 10 volte per mescolare le perle e la miscela di DNA, quindi incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Durante l'incubazione delle microsfere SPRI, preparare provette per microfughe contenenti 96 microlitri di Tris pH 8.0 da 10 millimolari e quattro microlitri di cloruro di sodio da cinque molari per ciascun campione.

Posizionare le provette contenenti le perle e la miscela di DNA in una rastrelliera magnetica per due minuti per raccogliere le perle sul lato della provetta, quindi trasferire ciascun surnatante in una nuova provetta contenente Tris e cloruro di sodio. Aggiungere 200 microlitri di fenolo:cloroformio:alcol isoamilico a ciascun campione, vorticare per mescolare e centrifugare alla massima velocità a temperatura ambiente per cinque minuti. Rimuovere ogni fase acquosa in una nuova provetta, aggiungere 30 microgrammi di glicogeno e 500 microlitri di etanolo al 100%.

Precipitare il DNA su ghiaccio secco per 10 minuti, o fino a quando la soluzione è viscosa. Pellettare il DNA precipitato centrifugando alla massima velocità e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Decantare il surnatante e lavare ogni pellet con un millilitro di etanolo al 70%.

Decantare l'etanolo, rimuovendo il resto capovolgendolo e picchiettando delicatamente i tubi su un tovagliolo di carta. Centrifugare brevemente i campioni utilizzando una centrifuga da banco e utilizzare una pipetta per rimuovere l'etanolo residuo, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Asciugare i pellet all'aria a temperatura ambiente per cinque minuti.

Risospendere ogni pellet essiccato in 25 microlitri di Tris pH 8. Determinare la concentrazione di ciascun campione utilizzando un saggio ad alta sensibilità. L'elettroforesi su gel di agarosio del DNA da un'analisi di scissione endogena della cromatina di Reb1, un fattore regolatore generale che lega le regioni deplete dei nucleosomi, rivela un aumento calcio-dipendente della frammentazione del DNA nel tempo, come indicato dallo striscio, e dall'eventuale completa digestione del DNA genomico.

La visualizzazione delle estremità dei frammenti da un esperimento di sequenziamento della scissione endogena della cromatina Reb1 rivela un robusto arricchimento di Reb1 sul fondo, derivato dal ceppo MNasi libero dopo 30 secondi di trattamento con calcio. Allo stesso modo, una sostanziale scissione del DNA è stata osservata da una fusione della subunità mediatore Med8 con MNasi, ma non MNasi libera guidata dal promotore Med8 un minuto dopo l'aggiunta di calcio. Per confrontare i dati di sequenziamento endogeno della cromatina Reb1 con l'immunoprecipitazione della cromatina e i dati di sequenziamento ad alto rendimento, sono stati centrati sul motivo 1.992 picchi di Reb1 determinati con il metodo organico ed è stato determinato il conteggio medio dei frammenti in ciascuna posizione di base in una finestra di 100 coppie di basi attorno al punto medio del motivo.

È stata osservata una sorprendente asimmetria e scissione con la maggior parte delle estremità dei frammenti rilasciati da Reb1-MNase che si mappano sul lato a monte del motivo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'intera giornata di lavoro, se eseguita correttamente. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare di limitare il numero di campioni analizzati in parallelo, per garantire tempi di pipettaggio e manipolazione accurati.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della trascrizione per caratterizzare in modo inequivocabile l'associazione genomica di un complesso proteico delle dimensioni di un megadalton che non lega il DNA nel lievito. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea di come eseguire il metodo ChEC-Seq per la mappatura dell'intero genoma dei siti di legame delle proteine nel genoma del lievito in gemmazione.