Analisi delle strutture amiloidi in una sezione di tessuto mediante microscopia a fluorescenza con imaging a vita

Prendi una sezione di tessuto con aggregati amiloidi che rappresentano depositi proteici anomali.

Il tessuto è colorato con il colorante fluorescente eptamero-formil tiofene acido acetico o hFTAA, che si lega specificamente alle strutture beta-sheet delle fibrille amiloidi.

Visualizzare il vetrino utilizzando un microscopio confocale dotato di un'unità di microscopia per imaging a fluorescenza, che misura il tempo di fluorescenza delle molecole di colorante.

Ottimizza le impostazioni del microscopio per un'efficace eccitazione delle molecole di colorante.

Quando la luce laser illumina il tessuto, l'hFTAA eccita e diventa fluorescente.

Un legame del colorante più forte in strutture compatte si traduce in una durata più lunga, mentre un legame del colorante più debole in strutture meno compatte porta a una durata più breve.

Successivamente, il software genera un'immagine codificata a colori dell'aggregato.

I colori, come il rosso e il giallo, appaiono nella periferia, indicando tempi di fluorescenza più brevi che riflettono strutture amiloidi meno compatte e instabili.

Mentre colori come il blu e il verde nel nucleo rappresentano tempi di fluorescenza più lunghi, riflettono strutture amiloidi più compatte e stabili.

Il giorno della colorazione, immergere le sezioni in bagni consecutivi di etanolo al 99%, etanolo al 70%, dH_2O e PBS per 10 minuti ogni volta, quindi lasciare asciugare le sezioni di tessuto in condizioni ambientali. Mentre il tessuto si asciuga, preparare una soluzione di lavoro di HFTAA diluendo il brodo da 1 a 10.000 in PBS. Quando il tessuto è asciutto, aggiungere goccioline della soluzione di lavoro HFTAA a ciascuna sezione di tessuto per coprirlo. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.

Risciacquare la soluzione colorante con 500 microlitri di PBS, quindi immergere il vetrino nel bagno PBS per 10 minuti. Dopo aver lasciato asciugare la sezione in condizioni ambientali, montare utilizzando un mezzo di montaggio a fluorescenza. Lasciare che il supporto di montaggio si stabilizzi durante la notte.

rilevamento dell'amiloide può essere eseguito direttamente dopo il montaggio o anche senza montaggio. Tuttavia, se l'obiettivo dell'esperimento è raccogliere informazioni spettrali di alta qualità, è preferibile l'incubazione notturna.

Passare il microscopio alla modalità FLIM, impostare il foro stenopeico su 20, la lunghezza d'onda di eccitazione su 490 nanometri e l'intensità del laser su 0,5%. Utilizzare laser pulsati a 40 megahertz. Nel software FLIM, impostare il conteggio dei fotoni oltre i 550 nanometri. Nella finestra Parametri di visualizzazione, seguire il conteggio dei fotoni fino a quando il conteggio massimo è di circa 4.000 conteggi di fotoni. Salvare il file ed esportarlo come immagine SPC.