Visualizzazione della morfologia degli astrociti utilizzando la ionoforesi con colorante fluorescente in una fetta di cervello di topo fissa

Metti una fetta di cervello di topo fissata chimicamente in un piatto con fondo di vetro contenente tampone e fissala con una rete.

Collegare un elettrodo riempito con un colorante fluorescente anionico idrofilo a una sorgente di tensione.

Inserire un elettrodo di terra nel tampone per completare il circuito elettrico.

Utilizzando l'illuminazione a campo chiaro, far avanzare l'elettrodo riempito di colorante verso la fetta.

Passa all'imaging a contrasto interferenziale differenziale a infrarossi per localizzare un astrocita.

Forare il soma degli astrociti con l'elettrodo per accedere al citoplasma.

Applicare una corrente elettrica per guidare il colorante nel citoplasma tramite ionoforesi.

Passa alla microscopia confocale per monitorare il movimento del colorante.

Il colorante idrofilo, incapace di attraversare la membrana idrofoba, si diffonde all'interno del citoplasma per riempire il soma e i rami.

Una volta riempita la cella, interrompere la corrente ed estrarre l'elettrodo.

Lasciare che la membrana degli astrociti si richiuda.

Acquisisci immagini su vari piani Z e ricostruiscile per visualizzare la morfologia degli astrociti.

Per il test di iniezione del colorante, posizionare delicatamente una fetta di cervello leggermente fissata in un piatto con fondo di vetro riempito con 0,1 molari di PBS a temperatura ambiente. E tieni la fetta in posizione con un'arpa di platino con corde di nylon.

Collegare l'elettrodo a una fonte di tensione e posizionare l'elettrodo di terra nella vasca contenente la fetta di cervello. Spostare l'obiettivo di un microscopio confocale sulla regione del cervello di interesse.

E abbassare l'elettrodo nella soluzione utilizzando la lente a immersione in acqua 10x, spostando l'elettrodo al centro del campo visivo. Quindi, in campo chiaro, abbassare lentamente l'elettrodo verso la fetta, fermandosi appena sopra la superficie.

Per riempire un astrocita di interesse con la ionoforesi, utilizzare il contrasto di interferenza differenziale all'infrarosso per identificare gli astrociti con somata allungati di forma ovale, di circa 10 micrometri di diametro, da 40 a 50 micrometri sotto la superficie della fetta.

Questo è lo strato radiato dell'ippocampo direttamente sotto lo strato cellulare piramidale. Mentre ci muoviamo attraverso il tessuto, possiamo vedere vasi sanguigni, neuroni, astrociti e altri tipi di cellule.

Una volta selezionato un astrocita, spostare la cella al centro del campo visivo e abbassare lentamente la punta dell'elettrodo nella fetta. Navigazione attraverso il tessuto fino a quando l'elettrodo si trova sullo stesso piano del corpo cellulare.

Una volta che il corpo cellulare dell'astrocita è chiaramente visibile e delineato, far avanzare lentamente e delicatamente l'elettrodo in avanti, muovendo l'elettrodo fino a quando la punta non impala il soma della cellula.

Muovi lentamente la messa a fuoco dell'obiettivo su e giù per notare se l'elettrodo si trova all'interno del soma. Una volta che la punta dell'elettrodo è all'interno della cella, accendere lo stimolatore a una velocità compresa tra 0,5 e 1 volt per espellere continuamente la corrente nella cella.

Utilizzando il microscopio confocale, osservare il riempimento della cellula, aumentando lo zoom digitale per visualizzare i dettagli della cellula e per assicurarsi che la punta dell'elettrodo sia visibile all'interno della cellula, se necessario.

Attendere circa 15 minuti fino a quando i rami e i processi più fini appaiono definiti, prima di spegnere la tensione e ritirare delicatamente la punta dell'elettrodo dalla cella.

Per visualizzare la cellula riempita, attendere da 15 a 20 minuti affinché la cellula ritorni alla sua forma originale, prima di regolare l'impostazione sul microscopio confocale per assicurarsi che i rami e i processi più fini appaiano definiti sotto l'obiettivo 40x.

Impostare uno z-stack con una dimensione del passo di 0,3 micrometri, spostando l'obiettivo durante l'imaging fino a quando non c'è segnale dalla cella. E imposta quel passaggio come in alto.

Quindi sposta l'obiettivo verso il basso, mettendo a fuoco la cella fino a quando non c'è segnale. E imposta quel passaggio come fondo.