Name: Isolamento e caratterizzazione di Hoechst Basso CD45 Negativo Mouse cellule staminali mesenchimali del polmone (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 55 s
Description: Scopri l'isolamento e la caratterizzazione di cellule staminali mesenchimali polmonari CD45 negative da tessuto murino. Questo metodo utilizza citometria a flusso e saggi di formazione colonie per studiare le proprietà immunomodulatorie.

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Questo lavoro è stato finanziato da borse di SMM: AHA GIA0855953G, NIH 1R01 HL091105-01. Ulteriore supporto è stato fornito da: DW: NIH RO1DK075013, DDK e la Fondazione Kleberg, il codice UCCC Nucleo Citometria a Flusso (NIH 5 P30 CA 46934-15), il codice UCCC Microarray core (NCI P30 CA 46934-14).

1. Isolamento del polmone <ol><li> Sacrificio topi adulti (8-10 settimane di età, 18-20 g; C57Bl6J) topi con una dose eccessiva di isoflurano seguito da dissanguamento con tecnica sterile. Profili varia leggermente tra i ceppi. </li><li> Rimuovere chirurgicamente il diaframma, aprire la cavità toracica, tagliando la gabbia toracica laterale su ciascun lato del mouse. Lavare il sangue dai polmoni mediante perfusione del ventricolo destro del cuore delicatamente con 3-5mls di tampone fosfato (PBS). </li><li> Sezionare i lobi polmonari rimuovendo trachea, i bronchi grandi e metterlo in una capsula di Petri riempite con soluzione salina tampone Hanks (HBSS). Seguente raccolta di tutte le pinze lobi polmonari sono utilizzati per posizionare il tessuto sul coperchio del piatto. Tessuto viene poi macinato in piccoli pezzi con bisturi monouso con abbastanza liquido per mantenerli umidi, ma non così tanto che galleggiare e muoversi. </li><li> Sezionare uno degli arti posteriori di uno dei topi e isolare il midollo osseo da utilizzare come un controllo colorazione per impostare la flow citometria cancelli. Macchia del midollo osseo (BM), come descritto in precedenza 1. </li></ol> 2. Preparazione di una sospensione cellulare singola da tessuto polmonare <ol><li> Ogni polmone è digerito utilizzando un peso ottimizzato dei tessuti in rapporto al volume di 0,2 g: 5mls di pre-riscaldato 0,2% Worthington collagenasi di tipo 2 (Biochemicals Worthington, Lakewood, NJ; cat # LS004202) disciolto in HBSS sterile. La miscela è immerso in un bagno d'acqua a 37 ° C per 30 min 2,3. </li><li> Triturare campione bene fino a digerire il tessuto polmonare scorre facilmente attraverso una pipetta da 10 ml (circa 10 ripetizioni). Incubare per altri 15 minuti a 37 ° C per completare il tessuto digerisce e assicura una sospensione più uniforme singola cellula. </li><li> Diluire la sospensione cellulare del polmone con HBSS e triturare con una pipetta da 5 ml per disperdere frammenti di tessuto residuo. </li><li> Filtrare la sospensione con un colino 70μM cellula per rimuovere frammenti di tessuto non digerito. Campione può essere diviso in multipltubi e conici, a questo punto per evitare di sovraccaricare uno colino cellula e diminuire il tempo. </li><li> Pellet la sospensione cellulare per 10 min a 1500 giri e decantare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet cellulare delicatamente con temperatura ambiente RBC lisi buffer (eBiosciences, San Diego, CA; cat # 00-4333-57) e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Aggiungere un volume equivalente di HBSS di inattivare il tampone di lisi e filtrare la sospensione cellulare usando un colino 40μM cellula per rimuovere i detriti e aggregati cellulari. </li><li> Pipettare 10μl di ciascun campione da colorare e contare il numero di cellule sia per il polmone e campioni di BM con un emocitometro. Nota: registrare il volume totale delle cellule. </li><li> Pellet la sospensione cellulare di cellule polmonari mediante centrifugazione a 1500 rpm per 10 min. </li><li> Risospendere sia polmoni e le cellule BM a 1x10 6 cellule / ml in preriscaldata (37 ° C) DMEM + (Dulbecco modificato Eagle medio, alto livello di glucosio (Gibco, Carlsbad, CA; cat # 11965-092) contenente il 2% Bovi fetalene siero (FBS) e HEPES 10mM. </li><li> Preparare una soluzione 1mg/ml stock di Hoechst 33342 dye (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, cat # B2261) in acqua e filtro sterilizzare 1,4. Il colorante Hoechst può essere memorizzato come aliquote a -80 ° C. </li><li> Aggiungi Hoescht 33342 colorante ad una concentrazione finale di 5μg/ml (a 200x diluizione di uno stock 1mg/ml) alla sospensione singola cella. </li><li> Mescolare delicatamente le cellule inversione e incubare in bagnomaria a 37 ° C per esattamente 90 minuti. </li></ol> 3. Colorazione e Preparazione della sospensione di Polmone di Cellula per l'analisi Citometria a Flusso <ol><li> Dopo 90 minuti tutti i punti con le cellule polmonari Hoechst macchiato deve essere eseguito a 4 ° C o su ghiaccio per evitare efflusso colorante. Agglomerare le cellule mediante centrifugazione a 1500 rpm per 10 min a 4 ° C e risospendere le cellule in ghiaccio freddo colorazione tampone (PBS +2% FBS). </li><li> Risospendere le cellule ad una concentrazione non superiore a 1x10 7 cellule / tubo utilizzando 300-600μl di PBS contenente il 2%FBS e HEPES 10mM. </li><li> Aggiungi adeguatamente ridacchiò anticorpo CD45 (di solito 1:200 diluizione di CD45-APC (BD Pharmingen, San Diego, CA; cat # 559864), al polmone e campioni di BM Incubare in ghiaccio per 10-15 min Compreso un controllo senza macchia durante il.. procedura sperimentale è utile per impostare le porte di analisi. </li><li> Cellule pellet a 4 ° C per 5 min a 1500 giri. Decantare il surnatante e risospendere le cellule in 500 ml di buffer di colorazione fredda (PBS +2% FBS). Trasferimento a tubi prechilled scatto tappo in polipropilene (Fisherbrand, Schaumburg, IL, cat # 14-956-1D). </li><li> Aggiungi ioduro di propidio (PI, fotografia 200μg/ml in PBS) per i campioni per una concentrazione finale di 2μg/ml di escludere le cellule morte. PI deve essere utilizzato in combinazione con il colorante Hoechst 33342 per ottenere il profilo corretto di fluorescenza su citometria a flusso. </li><li> Conservare le provette su ghiaccio, al riparo dalla luce fino al momento dell'analisi in citometria a flusso. </li></ol> 4. Citometria a flusso di analisi per definire e isolareuno Stem Cell Lung mesenchimali (MSC polmone) Popolazione con tintura Hoechst efflusso di rilevare una popolazione Side (SP) <ol><li> Questo test ha lo strumento seguenti requisiti: </li><ul><li> 488 nm e UV (350-355 nm) </li><li> 2 rivelatori sul cammino laser UV con il blu (450/65) e rosso (675/50) filtri. </li><li> Il rilevatore UV rossi devono essere ad alta sensibilità per il segnale rosso. Questo può essere un problema con selezionatrici delle cellule vecchie. </li><li> Impianto di refrigerazione per mantenere il campione a 5-10 ° C. </li></ul><li> Allineare i laser e configurare per l'ordinamento delle cellule seguendo il protocollo del produttore. </li><li> Raccogliere il rosso (asse x) e blu (asse y) segnali Hoechst utilizzando una scala lineare. </li><li> Regolare le tensioni del tubo fotomoltiplicatore per posizionare il picco G0/G1 in alto a destra del centro sul terreno per consentire un'adeguata visualizzazione della popolazione lato finale. Una parte della fase S e l'intero G2 del ciclo cellulare può essere fuori scala in alto a destra del grafico. L'azzurro firmasegnale è relativamente brillante, mentre il segnale rosso è scarsa. Tipico MoFlo XDP (Beckman Coulter, Miami, FL) tensioni sono 425 per il blu e 650 per il rosso. </li><li> Le cellule morte vengono gated con l'ausilio di PI. Il percorso standard PI (eccitazione 488 nm, emissione di 630nm) possono essere utilizzati. In alternativa, PI è anche entusiasta dal laser UV e la popolazione di cellule morte è fuori scala sul lato destro della popolazione laterali (SP) trama. Questo riduce la necessità di compensare il segnale di PI da qualsiasi altra fluorocromi come FITC e PE. Il metodo originale Goodell seguito le ultime procedure 5-7. </li><li> Mantenere una differenza di pressione relativamente bassa durante l'analisi e la selezione per assicurarsi della tenuta della popolazione laterali. </li><li> La SP appare come un braccio di lato a parte la principale popolazione di cellule del polmone. Questa popolazione è chiamata Hoechst basso. </li><li> Il basso Hoechst / SP viene analizzata per separare le popolazioni CD45 positivi e negativi utilizzando un istogramma 2,3 (FIGURA 1). </li><li> A seguito di selezione e gating del basso Hoechst popolazione CD45 neg MSC polmone le cellule possono essere raccolte da ordinamento sia come popolazione mista in un tubo o di singole cellule per isolare cloni in una piastra a 96 pozzetti 3. </li><li> Per piastra di smistamento del flusso di deflessione ordinamento è regolato al 25% per creare un flusso specie più verticale di quello solitamente usato per l'ordinamento del tubo. </li><li> Dirigere il getto ordinare l'invio di un impulso di corrente di prova sulla parte superiore sinistra e poi in basso a destra e di una piastra a 96 pozzetti. </li><li> Impostare il software mappa selezionatrice piastra per depositare il numero desiderato di cellule in ogni pozzetto. </li><li> Per isolare cloni singola cella uno MSC polmone singolo è ordinato nel pozzo di una piastra a 96 pozzetti in 150μl di cultura dei media (α-MEM integrato con 20% FBS). Dopo l'ordinare un ulteriore 100μl di medium viene aggiunto. </li></ol> 5. Isolamento, coltura e caratterizzazione di polmone MSC e cloni <ol><li> Culture ed espansione della popolazione mista MSC polmone e cloni di cellule singole che seguono l'ordinamento è identico con condizioni di coltura standard (37 ° C, 5% di CO 2 e umidità&gt; 95%). Le cellule sono permesso di aderire isolamento seguenti per 16 ore. Media è sostituito ogni 48 ore (α-MEM integrato con 20% FBS). Quando le cellule iniziano a proliferare più rapidamente e raggiungere confluenza tra il 75-80% sono diversi passaggi (Figura 2). </li><li> Le cellule sono sciacquati con HBSS preriscaldata e incubate con 0,5% tripsina / EDTA (Cellgro, Manassas, VA; cat # 25-053-Cl) a 37 ° C per meno di 2 min. Le cellule sono monitorati utilizzando una portata invertita per confermare l'aspetto di una sospensione cellulare. </li><li> Polmone MSC sono poi divisi con rapporti di 1:2 o 1:3 a seconda del tasso attuale proliferazione della cultura. </li><li> La capacità di MSC polmone di differenziarsi in linee tradizionali mesenchimali di osteoblasti, adipociti e condrociti e la loro espressione sulla superficie cellulare dei accettato i marcatori mesenchimalis valutati per ogni preparazione cellulare. Analisi citogenetica bande è anche esibito per confermare l'assenza di gravi anomalie cromosomiche 2,3,8-11. </li></ol> 6. Enumerazione di MSC polmone usando un test formanti colonia (CFU-F) <ol><li> Diluire cellule in terreno MesenCult completa (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) ad una concentrazione finale di 1x10 6 cellule / ml. </li><li> Eseguire diluizioni in serie per raggiungere concentrazioni finali in un piatto 100mm di 6x10 4 celle, 3x10 4 celle, 1,5 x10 4 celle e 0,75 x10 4 celle in 10 ml di media. Le analisi sono eseguite in triplicato duplicato o per ogni concentrazione cellulare e può essere scalato per superfici più piccole. </li><li> Celle di coltura per 10 giorni in condizioni standard. Il giorno 10 celle vengono sciacquati con PBS e fissati con metanolo al 100% per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rilevare il CFU-F colonie con la colorazione 0,4% w / v soluzione colorante Giemsa(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) diluito 1:20 con acqua deionizzata. Attendere che i campioni di aria secca e quantificare il numero di colonie contenenti più di 25 cellule per colonia (Figura 3). </li></ol> 7. Analisi delle proprietà immunomodulanti delle MSC polmone a cellule T proliferazione e apoptosi <ol><li> 6.25x10 4 celle polmonari MSC per pozzetto sono rivestiti in piastre da 96 pozzetti e lasciato riposare tutta la notte 2. </li><li> Cellule CD4 + da milza di recettore delle cellule T (TCR) topi transgenici, OT-II con le cellule T che riconoscono il ovalbumina 323-339 peptide, sono purificati mediante deplezione CD8 +, CD19 +, MHC-II + e CD25 + con una cella Miltenyi AutoMACS sorter (Miltenyi, Auburn, CA). Cellule presentanti l'antigene (APC) sono isolati dal positivamente ordinamento MHC-II + cellule 12. </li><li> APC sono fissate in 4% paraformaldeide, lavati 3 volte in PBS / 5% BSA/2mM EDTA, e caricato con 0.5μg/ml o 5μg / ml OVA323 peptide. </li><li> Simulata, la crescita arrestati APC vengono aggiunti alla MSC polmone in piastre da 96 pozzetti. </li><li> Superiore al 95% pura CD4 + 1x10 5 cellule sono etichettati con 5 micron Carboxyfluorescein succinimidile estere (CFSE, Sigma, St.Louis MO) in PBS e incubate per 5 minuti al buio, lavato con BSA PBS-5%, e poi aggiunti al APC e cellule MSC polmone in DMEM al 5% FBS media. Le cellule sono poi incubate per 96 ore. </li><li> T-cellule sono poi colorati con anti anti-CD40 (Cy5); CD4 (APC-Cy7), CD8 (ViolBlue); Vbeta 5 (PE) e analizzati utilizzando un Miltenyi MacsQuant 7 citofluorimetro canale (Miltenyi, Aurburn, CA) e flojo software di analisi (Treestar, Ashland, OR). Proliferazione è misurata come la diminuzione di intensità media di fluorescenza CFSE rispetto allo sfondo, le cellule T etichettati con CFSE e non esposto ad APC (Figura 4). T-cellule sono contate in questo momento e vitalità valutato con esclusione trypan blu. </li></ol> 8. Rappresentante dei risultati: Figura 1. Analisi citofluorimetrica e definizione di MSC polmone. Sospensioni singola cellula del tessuto digerire polmone sono colorati con Hoechst 33342 e analizzati mediante citometria a flusso per rilevare le differenze in A. forward scatter (FSC) e lato dispersione (SSC) e B. Hoechst blu e rosso fluorescenza. La presenza di una popolazione laterale (SP) è visibile nel cancello. La Hoechst bassa SP viene poi analizzata per separare il C. Popolazione CD45 negativa di MSC polmone. Il CD45 positivo ai rapporti negativi di polmone SP sono di solito 70:30 / 60:40. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Isolamento e la coltura di MSC polmone. Dopo la raccolta della MSC polmone di separazione delle cellule, le cellule sono placcati in piatti di 30 millimetri con α-MEM supplemented con il 20% FBS. A. Appena le cellule appaiono ordinati piccolo, rotondo e brillante. B. Dopo circa 2-3 settimane con colonie di un fenotipo mesenchimale diventano evidenti e la proliferazione è più evidente. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Enumerazione di MSC da Colony Forming fibroblasto-saggio. Esteso polmone MSC sono placcati per il protocollo descritto per il saggio CFU-F. A. Dopo 10 giorni e colonie Giemsa sono evidenti. B. Le colonie sono grandi e composta da un poche centinaia di cellule. C. Le cellule visualizzare un fenotipo mesenchimale. A &amp; B, bar Scala = 0,5 cm; bar Scala C = 0,14 cm. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. CFSE saggio basato su cellule T proliferazione. In assenza di MSC polmonari e la presenza di antigen cellule presentanti (APC) + / - ovalbumina (OVA) CD40 delle cellule T effettrici positivi dimostrano una diminuzione di intensità CFSE che indica la proliferazione (cerchio rosso). CFSE intensità di fluorescenza della membrana delle cellule T diminuisce stechiometricamente con tutti cioè la divisione cellulare. con ogni divisione. In presenza di MSC polmone, APC + / - OVA, CD40 delle cellule T effettrici positivo dimostrare nessuna variazione significativa in intensità CFSE che indica una mancanza di proliferazione (cerchio rosso).

<ol><li>Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).</li>
<li>Jun, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pathology+of+Bleomycin+Induced+Fibrosis+is+Associated+with+Loss+of+Resident+Lung+Mesenchymal+Stem+Cells+Which+Regulate+Effector+T-Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22STEM+CELLS%22%5BJournal%5D)">The Pathology of Bleomycin Induced Fibrosis is Associated with Loss of Resident Lung Mesenchymal Stem Cells Which Regulate Effector T-Cell Proliferation.</a> STEM CELLS. , (2011).</li>
<li>Martin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+lung+side+population+cells+have+mesenchymal+stem+cell+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Adult lung side population cells have mesenchymal stem cell potential.</a> Cytotherapy. 10, 140-151 (2008).</li>
<li>Majka, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+progenitor+populations+in+skeletal+muscle+are+bone+marrow+derived+and+exhibit+different+cell+fates+during+vascular+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Distinct progenitor populations in skeletal muscle are bone marrow derived and exhibit different cell fates during vascular regeneration.</a> The Journal of Clinical Investigation. 111, 71-79 (2003).</li>
<li>Goodell, M. A., McKinney-Freeman, S., Camargo, F. D. Methods in Molecular Biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoodell%2C+MA+%22Basic+Cell+Culture+Protocols%22">Basic Cell Culture Protocols</a>. Helgason, D. C., Miller, C. L. 290, Humana Press. 343-352 (2005).</li>
<li>Tadjali, M., Zhou, S., Rehg, J., Sorrentino, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+Isolation+of+Murine+Hematopoietic+Stem+Cells+by+Expression+of+an%5BTitle%5D)+AND+%22Abcg2%2FGFP+Allele.+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Prospective Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells by Expression of an.</a> Abcg2/GFP Allele. Stem Cells. 24, 1556-1563 (2006).</li>
<li>Zhou, S., Schuetz, J. D., Bunting, K. D., Colapietro, A. -M., Sampath, J., Morris, J. J., Lagutina, I., Grosveld, G. C., Osawa, M., Nakauchi, H., Sorrentino, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABC+transporter+Bcrp1%2FABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nature Medicine. 7, 1028-1034 (2001).</li>
<li>Chateauvieux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profile+of+mouse+stromal+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Molecular profile of mouse stromal mesenchymal stem cells.</a> Physiological Genomics. 29, 128-138 (2007).</li>
<li>Gregory, C. A., Prockop, D. J., Spees, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-hematopoietic+bone+marrow+stem+cells%3A+Molecular+control+of+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Non-hematopoietic bone marrow stem cells: Molecular control of expansion and differentiation.</a> Experimental Cell Research. 306, 330-335 (2005).</li>
<li>Menicanin, D., Bartold, P., Zannettino, A., Gronthos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Profiling+of+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Genomic Profiling of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 5, 36-50 (2009).</li>
<li>Summer, R., Fitzsimmons, K., Dwyer, D., Murphy, J., Fine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+an+Adult+Mouse+Lung+Mesenchymal+Progenitor+Cell+Population%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of an Adult Mouse Lung Mesenchymal Progenitor Cell Population.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 37, 152-159 (2007).</li>
<li>Waid, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+T+cell+subset+described+as+CD4loCD40%2B+T+cells+%28TCD40%29+in+human+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">A unique T cell subset described as CD4loCD40+ T cells (TCD40) in human type 1 diabetes.</a> Clinical Immunology. 124, 138-148 (2007).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Noi abbiamo adattato un metodo inizialmente utilizzato per identificare BM cellule ematopoietiche per isolare una specifica popolazione di MSC polmone residenti. A causa della riproducibilità di isolamento queste cellule sono state poi ben caratterizzati come MSC. La loro origine è stato definito come residente nel polmone topo adulto (al contrario di BM derivati) e un profilo fenotipico e molecolare documentata 2. La capacità di isolare ripetutamente questa popolazione caratterizzata permette lo studio ulteriore della importanza biologica e il ruolo delle MSC polmone durante l&#39;omeostasi dei tessuti e la malattia. La definizione recente di questa popolazione in vivo sia in murine e umane del tessuto polmonare facilita lo sviluppo di una strategia terapeutica rivolta al recupero delle cellule endogene per facilitare la riparazione ai polmoni durante lesioni e la malattia.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Tampone fosfato (PBS) </td><td> Sigma </td><td> P-5368 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks soluzione salina tamponata (HBSS) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30588.01 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,2% Worthington collagenasi di tipo 2 </td><td> Worthington Biochemicals </td><td> LS004202 </td><td></td
></tr><tr><td> Globuli rossi tampone di lisi </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4333-57 </td><td></td
></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> 11965-092 </td><td></td
></tr><tr><td> Hoechst 33342 dye </td><td> Sigma </td><td> B2261 </td><td></td
></tr><tr><td> CD45-APC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559864 </td><td></td
></tr><tr><td> Propidio ioduro </td><td> Sigma </td><td> 81845 </td><td></td
></tr><tr><td> a-MEM </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30265.01 </td><td>; </td
></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-069 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,5% tripsina / EDTA </td><td> Cellgro </td><td> 25-053-Cl </td><td></td
></tr><tr><td> MesenCult Media completo </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05511 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,4% w / v colorazione Giemsa soluzione </td><td> Sigma </td><td> GS1L </td><td></td
></tr><tr><td> 4% paraformaldeide </td><td> Microscopia Elettronica Servizi </td><td> 15710 </td><td> 16% paraformeldehyde è diluito al 4% con PBS </td
></tr><tr><td> Carboxyfluorescein succinimidile estere (CFSE) </td><td> Sigma </td><td> 21888 </td><td></td
></tr></tbody></table>

isolamento e caratterizzazione di hoechst basso cd45 negativo mouse cellule staminali mesenchimali del polmone

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Tessuto cellule staminali residenti mesenchimali (MSC) sono importanti regolatori della riparazione dei tessuti e la rigenerazione, la fibrosi, l&#39;infiammazione, l&#39;angiogenesi e la formazione di tumori. Nel loro insieme questi studi suggeriscono che MSC polmone residente svolgere un ruolo durante l&#39;omeostasi del tessuto polmonare, ferite e la riparazione in corso di malattie come la fibrosi polmonare (PF) e l&#39;ipertensione arteriosa (PAH). Qui descriviamo una tecnologia per definire una popolazione di MSC polmone residenti. La definizione di questa popolazione in vivo del tessuto polmonare con una serie di definire marcatori facilita l&#39;isolamento ripetuto di una popolazione staminali ben caratterizzato cellulare mediante citometria di flusso e lo studio di un tipo specifico di cellule e la funzione.

In questo articolo dimostriamo l&#39;isolamento di cellule staminali murine residente polmone mesenchimali (MSC polmone), la loro espansione, caratterizzazione e analisi delle proprietà immunomodulanti.

Isolamento e caratterizzazione di Hoechst Basso CD45 Negativo Mouse cellule staminali mesenchimali del polmone

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) residenti nei tessuti sono importanti regolatori della riparazione o rigenerazione tissutale, della fibrosi, dell'infiammazione, dell'angiogenesi e del tumore...

Questo video illustra un protocollo per l'isolamento di cellule staminali mesenchimali polmonari negative per CD45 a bassa espressione di CD45 dell'ospite. Le cellule staminali mesenchimali residenti nei tessuti, o MSC, sono importanti regolatori della riparazione o rigenerazione tissutale, della fibrosi, dell'infiammazione e dell'angiogenesi. Per prima cosa, i polmoni vengono dissecati da un topo sacrificato.Il tessuto polmonare viene digerito per ottenere una sospensione di singole cellule. Le cellule vengono colorate con il colorante hoax e con CD45 e separate mediante citometria a flusso per ottenere cellule staminali mesenchimali polmonari CD45 negative e a bassa espressione di CD45 di origine ospite. Le cellule staminali mesenchimali polmonari vengono quindi espanse in coltura e viene eseguito un saggio di formazione di colonie per valutarne le capacità di differenziazione.Possono quindi essere condotti ulteriori studi per esaminare il ruolo delle cellule staminali mesenchimali nell'omeostasi tissutale e nelle malattie. Il metodo qui descritto può essere utilizzato per isolare cellule staminali mesenchimali polmonari di topo o umane e può essere applicato allo studio di malattie polmonari come la fibrosi polmonare, l'ipertensione polmonare e la BPCO. In generale, coloro che si approcciano per la prima volta a questo metodo potrebbero incontrare difficoltà a causa della varietà di metodi disponibili per la preparazione del tessuto, nonché per quanto riguarda l'impostazione del citometro a flusso, i controlli appropriati e l'analisi.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché è difficile descrivere adeguatamente la tecnica corretta per tritare e digerire il tessuto polmonare al fine di ottenere la massima vitalità cellulare usando esclusivamente il linguaggio verbale. Inoltre, la configurazione dello strumento di citometria a flusso e le analisi sono meglio trasmesse attraverso una dimostrazione pratica. Iniziare questo protocollo rimuovendo i polmoni, che verranno utilizzati per ottenere cellule staminali mesenchimali, da un topo adulto sacrificato.Utilizzare un piccolo paio di forbici affilate per tagliare lateralmente la gabbia toracica da entrambi i lati del topo. Aprire la cavità toracica, quindi rimuovere il diaframma. Inserire una siringa da 10 millilitri con un ago da 20 e mezzo gauge nel ventricolo destro del cuore e premere delicatamente lo stantuffo per perfondere da tre a cinque millilitri di PBS, eliminando il sangue dai polmoni.Successivamente, utilizzando le forbici, recidere la trachea e i grossi bronchi e scartarli. Poi, usando la pinzetta, prendere i piccoli lobi polmonari bianchi e posizionarli in una piastra di Petri riempita con soluzione salina tamponata di Hank o HBSS.Quindi rimuovere il cuore e separare i lobi polmonari. Ripetere questo procedimento per tutti i topi dello studio. Trasferire i lobi polmonari sul coperchio della piastra.Inumidire il tessuto con la quantità minima di HBSS necessaria per evitare che si secchi. Quindi, utilizzando un bisturi monouso, tritare i lobi polmonari per ottenere il midollo osseo da usare come controllo di mantenimento per la citometria a flusso. Usare un paio di forbici affilate per tagliare alla caviglia e alla sommità del femore.Posizionare l'arto in una nuova capsula di Petri. Quindi recidere il ginocchio, lasciando un segmento lineare di femore e un secondo segmento contenente la tibia e la fibula. Utilizzando pinzette, rimuovere il muscolo per esporre la tibia, la fibula e il femore.Ora prendere una siringa da cinque millilitri con un ago da 26 e mezzo e inserire l'ago nell'apertura del midollo osseo. All'estremità di una tibia, tenere l'osso con l'altra estremità diretta verso un tubo conico da 50 millilitri riempito con 15 millilitri di HBSS e premere lo stantuffo per erogare HBSS e lavare il midollo osseo nel tubo. Ripetere questo procedimento con una fibula e un femore.Colorare il midollo osseo con l'ospite 3 3 3 4 2 a una concentrazione finale di cinque microgrammi per millilitro in DMEM ad alto glucosio supplementato. Successivamente, verrà ottenuta una sospensione monocellulare di tessuto polmonare dal tessuto isolato. Posizionare ciascun polmone in un tubo contenente prewarmed 0,2% Worthington.Preparare la collagenasi di tipo due in HBSS sterile, quindi immergere il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e incubare per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, utilizzare la pipetta da 10 millilitri per tritare il campione finché il digestato scorre facilmente attraverso la pipetta. Eseguire circa 10 ripetizioni e incubare ulteriormente per 15 minuti a 37 gradi Celsius per completare la digestione del tessuto.Una volta completata la digestione, diluire la sospensione cellulare con HBSS e utilizzare una pipetta da cinque millilitri per tentare nuovamente di disperdere eventuali frammenti di tessuto residui. Successivamente, per rimuovere i frammenti di tessuto non digeriti, versare la sospensione attraverso un filtro cellulare da 70 micromolari in un tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere la sospensione un po' alla volta per consentire al campione di fluire attraverso il filtro cellulare.Se frammenti di tessuto non digeriti bloccano completamente il flusso della sospensione cellulare, versare attraverso un nuovo filtro cellulare in un nuovo tubo. Centrifugare la sospensione cellulare per 10 minuti a 450 RCF.Dopo la centrifugazione, decantare il soprannatante e risospendere delicatamente il pellet cellulare a temperatura ambiente nel buffer per la lisi dei globuli rossi; incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi aggiungere un volume uguale di HBSS per inattivare il buffer di lisi.Versare la sospensione cellulare in un filtro cellulare da 40 micromolari per rimuovere detriti e aggregati cellulari, raccogliendo il flusso in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Successivamente, utilizzando un emocitometro, determinare il numero di cellule sia per i campioni di polmone che di midollo osseo. Registrare la concentrazione e il volume totale della sospensione cellulare.Quindi, centrifugare la sospensione cellulare singola del polmone a 450 RCF per 10 minuti per ottenere il pellet. Per mantenere vive le cellule, risospendere contemporaneamente le cellule del polmone e del midollo osseo a una concentrazione di 10⁶ cellule per millilitro in DMEM ad alto contenuto di glucosio, supplementato e preriscaldato.Per colorare il DNA, aggiungere il colorante HOAXED 3 3 3 4 2 a una concentrazione finale di cinque microgrammi per litro. Successivamente, mescolare le cellule mediante inversione delicata e incubare in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius esattamente per 90 minuti. Quindi, centrifugare per 10 minuti a 450 G a quattro gradi Celsius dopo la centrifugazione.Procedere con la colorazione del tessuto polmonare e del midollo osseo con anti-CD45 e ioduro di propidio in preparazione per l'analisi mediante citometria a flusso. Una volta che le cellule sono state colorate, conservare le provette sul ghiaccio al riparo dalla luce fino all'esecuzione dell'analisi mediante citometria a flusso. Prepararsi per la citometria a flusso assicurandosi che i laser dello strumento siano allineati e che lo strumento sia configurato per il sorting cellulare.Lo strumento utilizzato deve essere dotato di laser blu a 488 nanometri, rosso a 635 nanometri e UV compresi tra 350 e 355 nanometri, con due rilevatori sul percorso del laser UV provvisti di filtri blu 45/65 e rosso 675/50. Inoltre, il rilevatore UV-rosso deve avere un'elevata sensibilità per il segnale rosso e lo strumento deve essere equipaggiato con un'unità refrigerante per mantenere il campione a 10 gradi Celsius. Nel software dello strumento, configurare istogrammi per visualizzare lo scattering lineare anteriore rispetto a quello laterale e un grafico di discriminazione dei doppietti adeguato allo strumento.Un grafico istogramma di PI utilizzando un segnale logaritmico, un grafico rosso contro blu utilizzando segnali lineari e un grafico istogramma di CD45 APC utilizzando un segnale logaritmico. Una volta che lo strumento è pronto, inserire il campione di midollo osseo colorato nel portello di caricamento dello strumento. Questo campione viene utilizzato come controllo della colorazione e della configurazione dello strumento.Iniziare a raccogliere gli eventi e regolare i segnali lineari di scattering anteriore. Per visualizzare chiaramente la popolazione cellulare, le cellule devono trovarsi approssimativamente al centro in basso nel grafico di scattering anteriore sull'asse x. Poiché il colorante nucleare PI è permeabile alle membrane IMP, verrà escluso dalle cellule vive.Disegnare una regione di gating sulla popolazione di cellule morte PI positive nell'istogramma del PI. Istruire il software dello strumento a colorare le cellule morte con questo colore di gating: rosso.È utile utilizzare le cellule morte colorate come riferimento per identificare la popolazione G zero G uno dell'ospite. La colorazione con PI viene eccitata anche dal laser UV e la maggior parte delle cellule morte dovrebbe risultare fuori scala. Sul lato destro del grafico di fluorescenza rosso contro blu hoecsato, la popolazione G zero G uno del midollo osseo dovrebbe apparire come un gruppo compatto di eventi nel grafico rosso contro blu hoecsato.Regolare le tensioni del rivelatore in modo da posizionare l'aggregato G0-G1 nell'angolo superiore destro del centro del grafico. Una porzione della fase S e l'intera fase G2 del ciclo cellulare potrebbero risultare fuori scala. Nella parte superiore destra del grafico rosso contro blu, la popolazione laterale a basso segnale sarà visibile come una scia che parte dal lato sinistro dell'aggregato G0-G1 e si estende fino all'angolo inferiore sinistro del grafico.Ora tracciare un'area di selezione intorno al cluster cellulare nel grafico FSC rispetto a SSC. Riportare la popolazione di cellule singole identificata nel grafico doppio e le cellule vitali nell'istogramma del PI. Assegnare quindi il grafico hoax in modo da visualizzare solo queste popolazioni selezionate.Dopo aver delimitato il tracciato dell'ospite, tracciare una regione attorno alla popolazione laterale. Assegnare questa regione come un gate all'istogramma CD45 APC, insieme ai gate relativi allo scatter laterale dei singoletti e alle cellule vitali. Ora che il sistema è configurato, rimuovere il campione dal portello di caricamento e inserire il campione polmonare nel portello di caricamento.Le impostazioni dello strumento non dovrebbero necessitare ulteriori aggiustamenti per questo campione. Iniziare la raccolta degli eventi sul grafico rosso contro blu. L'agglomerato G zero G uno per il campione polmonare di solito appare più allungato nella direzione dell'asse x e assomiglia al simbolo tilde su una tastiera.Il valore impostato per il segnale laterale dovrebbe essere posizionato in modo simile a quello impostato per il campione di midollo osseo. Potrebbero essere necessari piccoli aggiustamenti verso l'alto o verso il basso per garantire una risoluzione nitida della popolazione laterale. Mantenere una bassa differenza di pressione durante l'ordinamento assicurandosi che la valvola di flusso del campione non sia aperta eccessivamente.Successivamente, per isolare le MSC, posizionare una piastra di raccolta a 96 pozzetti nella camera di sorting e impostare le finestre di selezione sull'istogramma CD45 APC per separare le popolazioni positive e negative. Infine, raccogliere le cellule come popolazione mista in un tubo oppure singole cellule per isolare cloni in una piastra a 96 pozzetti. Dopo il sorting cellulare per l'isolamento delle MSC polmonari, le cellule vengono seminate in piastre da 30 millimetri utilizzando MEM-A integrato con FBS al 20%. Inizialmente, le cellule ordinate appaiono piccole, rotonde e brillanti dopo circa due o tre settimane.Le colonie con fenotipo mesenchimale diventano evidenti e la proliferazione è più marcata per ogni preparazione cellulare. Valutare la capacità delle cellule staminali mesenchimali polmonari di differenziarsi nelle tradizionali linee mesenchimali di osteoblasti, adipociti e condrociti e la loro espressione superficiale di marcatori mesenchimali accettati. Eseguire un'analisi citogenetica per confermare l'assenza di anomalie cromosomiche grossolane.Dopo l'isolamento mediante citometria a flusso e la generazione di cloni monocellulari, viene eseguito un saggio di formazione di colonie per caratterizzare le cellule MSC e le loro capacità differenziative. Iniziare con cellule diluite a tre volte 10 alla quattro cellule per millilitro. In piastre da 100 millimetri con mezzo di coltura incompleto, effettuare diluizioni seriali di due, sei volte 10 alla quattro, tre volte 10 alla quattro, 1,5 volte 10 alla quattro e 0,75 volte 10 alla quattro cellule per piastra in 10 millilitri di mezzo, in triplice replicato.Trascorsi 10 giorni di coltura, posizionare le piastre nell'incubatore, rimuovere il mezzo e lavare le cellule con PBS. Quindi fissarle aggiungendo metanolo al 100% per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo cinque minuti, rimuovere il metanolo.Quindi, per rilevare la formazione di colonie, aggiungere gza al 0,4% peso/volume diluito uno a 20 con acqua ionizzata e incubare per 10-15 minuti. Successivamente, eliminare il colorante e risciacquare con acqua ionizzata. Lasciare asciugare i campioni all'aria e quantificare il numero di colonie contenenti più di 25 cellule per colonia utilizzando un microscopio invertito o un metodo di visualizzazione.Le colonie sono grandi e costituite da alcune centinaia di cellule, come mostrato qui, e presentano un fenotipo mesenchimale. Le MSC sono state isolate come illustrato in questo video e seminate in piastre a 96 pozzetti per simulare la crescita. Successivamente, sono state aggiunte alle MSC polmonari cellule presentatrici di antigene marcate con CFSE e bloccate.La proliferazione delle MSC isolate è stata quindi misurata come diminuzione dell'intensità media di fluorescenza di CFSE rispetto al fondo, costituito da linfociti T marcati con CFSE da soli, come mostrato in questa figura, in assenza di SC polmonari e in presenza di cellule presentanti l'antigene, APC più o meno OVA. Linfociti T effettori CD40 positivi mostrano una diminuzione dell'intensità di CFSE, che indica proliferazione, evidenziata in rosso. L'intensità di fluorescenza di CFSE sulla membrana dei linfociti T diminuisce in modo equimolare con ogni divisione cellulare, ovvero si dimezza ad ogni divisione. In presenza di MSC polmonari APC più o meno OVA, i linfociti T effettori CD40 positivi non mostrano alcun cambiamento significativo nell'intensità di CFSE, il che indica assenza di proliferazione dopo il loro sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia delle cellule staminali polmonari per esplorare il ruolo delle cellule staminali mesenchimali in malattie polmonari come l'ipertensione arteriosa polmonare e la fibrosi polmonare.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa cinque ore seguendo questa procedura. Altri metodi, come i saggi di differenziamento, possono essere effettuati per rispondere ad ulteriori domande, inclusa la verifica se le presunte cellule staminali mesenchimali polmonari mostrano un appropriato potenziale di differenziamento multilinaggio verso osso, grasso e cartilagine.

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L&#39;isolamento e l&#39;arricchimento delle cellule staminali mesenchimali di ratto (MSC) e la separazione dei Single-colonia di cellule staminali mesenchimali derivate

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