Isolamento e caratterizzazione di Hoechst ^Basso CD45 ^Negativo Mouse cellule staminali mesenchimali del polmone

Questo video mostra un protocollo per l'isolamento di cellule staminali mesenchimali polmonari negative CD 45 negative. Le cellule staminali mesenchimali risonanti tissutali o MSC sono importanti regolatori della riparazione o rigenerazione tissutale, della fibrosi, dell'infiammazione e dell'angiogenesi. In primo luogo, i polmoni vengono sezionati da un topo sacrificato.

Il tessuto polmonare viene digerito per ottenere una sospensione di una singola cellula. Le cellule vengono colorate con die hoax e CD 45 e selezionate mediante citometria a flusso per ottenere MSC polmonari negative CD 45 basse. Le MSC polmonari vengono quindi espanse in coltura e viene eseguito un test di formazione di colonie per valutare le capacità di differenziazione delle MSC.

Ulteriori studi possono quindi essere eseguiti per esaminare il ruolo delle MSC durante l'omeostasi e la malattia dei tessuti. Il metodo che mostriamo qui può essere utilizzato per isolare cellule staminali mesenchimali di topo o polmone umano e può essere applicato a questo studio di malattie polmonari come la fibrosi polmonare, l'ipertensione polmonare e la BPCO. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa della varietà di metodi disponibili per la preparazione dei tessuti, nonché per l'impostazione del citometro a flusso, i controlli e l'analisi appropriati.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché è difficile descrivere la tecnica corretta per tritare e digerire il tessuto polmonare per una vitalità ottimale delle cellule con le sole parole. Inoltre, la configurazione e le analisi dello strumento di citometria a flusso vengono comunicate al meglio attraverso la dimostrazione. Inizia questo protocollo rimuovendo i polmoni che verranno utilizzati per ottenere cellule staminali mesenchimali da un topo adulto sacrificato.

Usa un piccolo paio di forbici affilate per tagliare la gabbia toracica lateralmente su ciascun lato del mouse. Aprire la cavità toracica, quindi rimuovere il diaframma. Inserire una siringa da 10 millilitri con un ago da 20 gauge e mezzo nel ventricolo cardiaco destro e premere delicatamente lo stantuffo per perfonderlo con tre o cinque millilitri di PBS, eliminando il sangue dai polmoni.

Quindi, usando le forbici, taglia la trachea e il grosso bronch e scartali. Quindi usando il forcipe. Raccogli i piccoli lobi polmonari bianchi e mettili in una capsula di Petri riempita con soluzione salina tamponata di matassa o HBSS.

Quindi rimuovere il cuore e separare i lobi polmonari. Ripeti questo processo per tutti i topi nello studio. Trasferire i lobi polmonari sul coperchio del piatto.

Inumidisci il fazzoletto con una quantità di HBSS sufficiente per evitare che si secchino. Quindi, utilizzando un bisturi monouso, tritare i lobi polmonari per ottenere il midollo osseo e utilizzare il controllo di sostegno per la citometria a flusso. Usa un paio di forbici affilate per tagliare la caviglia e la parte superiore del femore.

Metti l'arto in una nuova capsula di Petri. Quindi tagliare il ginocchio, lasciando un pezzo lineare di femore e un secondo pezzo contenente la tibia e il perone. Usando una pinza, estrai il muscolo per rivelare la tibia, il perone e il femore.

Ora prendi una siringa da cinque millilitri con un ago da 26 gauge e mezzo e inserisci l'ago nell'apertura del midollo osseo. A un'estremità della tibia, tenere l'osso con l'altra estremità diretta in un tubo conico da 50 millilitri riempito con 15 millilitri di HBSS e premere lo stantuffo per erogare HBSS e lavare il midollo osseo nel tubo. Ripeti questo processo con una fibula e un femore.

Colorare il midollo osseo con l'ospite 3 3 3 4 2 die a una concentrazione finale di cinque microgrammi per millilitro in DMEM ad alto contenuto di glucosio integrato. Successivamente, dal tessuto isolato verrà generata una sospensione di una singola cellula di tessuto polmonare. Mettere ogni polmone in una provetta contenente prewarm.0,2%Worthington.

Collagenasi di tipo due Preparato in HBSS sterile, quindi immergere la provetta in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e incubare per 30 minuti. Dopo l'incubazione, utilizzare la pipetta da 10 millilitri per tritrare il campione fino a quando il digestato scorre facilmente attraverso la pipetta. Circa 10 ripetizioni incubano per altri 15 minuti, a 37 gradi Celsius per completare il digestato dei tessuti.

Una volta completato il digestato, diluire la sospensione cellulare con HBSS e utilizzare una pipetta da cinque millilitri per disperdere nuovamente eventuali frammenti di tessuto residui. Successivamente, per rimuovere i frammenti di tessuto non digeriti, versare la sospensione attraverso un colino cellulare da 70 micromolari in un tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere la sospensione un po' alla volta per consentire al campione di fluire attraverso il filtro cellulare.

Se non digeriti, i frammenti di tessuto bloccano completamente il flusso della sospensione cellulare. Versare attraverso un nuovo filtro a celle in una nuova provetta. Pellettare la sospensione della cella per 10 minuti a 450 RCF.

Dopo la centrifuga, decantare il surnatante e risospendere delicatamente il pellet di cella a temperatura ambiente. Tampone di lisi dei globuli rossi, incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi aggiungere un volume uguale di HBSS per inattivare il tampone di lisi.

Versare la sospensione cellulare in un filtro cellulare da 40 micromolari per rimuovere i detriti e gli aggregati cellulari, raccogliendo il flusso in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Successivamente, utilizzando un emocitometro, determinare il numero di cellule sia per il polmone che per il midollo osseo. Registrare la concentrazione e il volume totale della sospensione cellulare.

Quindi pellettare la sospensione di una singola cellula polmonare mediante centrifugazione a 450 RCF per 10 minuti. Per sostenere le cellule, risospendere contemporaneamente sia le cellule polmonari che quelle del midollo osseo. Da 10 a sei cellule per millilitro in DMEM ad alto contenuto di glucosio integrato in preriscaldamento.

Per colorare il DNA aggiungere il colorante HOAXED 3 3 3 4 2 ad una concentrazione finale di cinque microgrammi per litro. Successivamente, mescolare le cellule mediante una leggera inversione e incubare in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per esattamente 90 minuti. Quindi centrifugare per 10 minuti a 450 Gs a quattro gradi Celsius dopo la centrifuga.

Procedere con la colorazione del tessuto polmonare e midollare con anti CD 45 e ioduro di propidio in preparazione all'analisi mediante citometria a flusso. Una volta che le cellule sono state colorate, conservare le provette su ghiaccio al riparo dalla luce fino a quando non viene eseguita l'analisi di citometria a flusso. Prepararsi per la citometria a flusso assicurandosi che i laser degli strumenti siano allineati e che sia predisposta per lo smistamento delle cellule.

Lo strumento utilizzato deve essere equipaggiato con laser blu a 488 nanometri, rossi a 635 nanometri e UV da 350 a 355 nanometri, con due rivelatori sul percorso del laser UV, con filtri blu 45 su 65 e rossi 6 75 su 50. Inoltre, il rivelatore rosso UV deve avere un'elevata sensibilità per il segnale rosso e lo strumento deve essere dotato di un'unità di raffreddamento per mantenere il campione a 10 gradi Celsius. Nel software dello strumento impostare i grafici dell'istogramma per visualizzare la dispersione lineare in avanti rispetto a quella laterale, un grafico di discriminazione del doppietto appropriato per lo strumento.

Un grafico a istogramma di PI utilizzando un segnale logaritmico, una costa rossa rispetto a blu utilizzando segnali lineari e un grafico a istogramma di CD 45 A PC utilizzando un segnale logaritmico. Una volta che lo strumento è pronto, posizionare il campione di midollo osseo colorato nella porta di caricamento dello strumento. Questo campione viene utilizzato come controllo della colorazione e della configurazione dello strumento.

Inizia a raccogliere eventi e regola i segnali lineari di dispersione interni in avanti. Per visualizzare chiaramente la popolazione cellulare, le cellule dovrebbero risiedere approssimativamente nel centro inferiore della dispersione in avanti del grafico come l'asse x. Poiché la colorazione nucleare PI è permeante all'IMP di membrana, sarà esclusa dalle cellule viventi.

Disegna una regione dell'andatura sulle cellule morte PI positive nell'istogramma PI. Istruire il software dello strumento a colorare le cellule morte. In questo cancello rosso.

È utile utilizzare le cellule morte ventilate a colori come navigatore per identificare la popolazione ospite G zero G uno. La colorazione PI è anche eccitata dal laser UV e la maggior parte delle cellule morte dovrebbe essere fuori scala. Sul lato destro del grafico della fluorescenza del midollo osseo con bufale rosse rispetto a blu, la popolazione G zero G 1 del midollo osseo dovrebbe essere vista come un gruppo ristretto di eventi nel grafico bufala rosso contro blu.

Regolare le tensioni del rivelatore per posizionare il cluster G zero G one in alto a destra del centro sul grafico. Una parte della fase S e l'intero G 2 del ciclo cellulare possono essere fuori scala. In alto a destra del grafico con bufale rosse rispetto a blu, si vedrà la popolazione laterale bassa che si trascina dal lato sinistro del cluster G zero G fino all'angolo inferiore sinistro del grafico.

Ora disegna un cancello attorno al cluster di celle nell'FSC rispetto all'SSC. Tracciare la popolazione di singoletto identificata nel grafico del doppietto e le cellule vive nell'istogramma PI. Quindi assegna il grafico bufala per visualizzare solo queste popolazioni recintate.

Dopo aver recintato il grafico ospite, disegna una regione attorno alla popolazione laterale. Assegna questa regione come porta all'istogramma PC CD 45 A insieme al singoletto di diffusione della luce e alle porte delle celle vive. Ora che il sistema è configurato, rimuovere il campione dalla porta di caricamento e posizionare il campione polmonare nella porta di caricamento.

Non è necessario regolare nuovamente le impostazioni dello strumento per questo campione. Inizia a raccogliere eventi sul complotto della bufala rossa contro blu. Il cluster G zero G one per il campione polmonare di solito appare più allungato nella direzione dell'asse x e assomiglia al simbolo della tilda su una tastiera.

La bufala dell'andatura laterale bassa della popolazione dovrebbe essere in una posizione simile a quella impostata per il campione di midollo osseo. Queste lievi regolazioni verso l'alto o verso il basso potrebbero essere necessarie per garantire una risoluzione rigorosa della popolazione laterale. Mantenere un basso differenziale di pressione durante lo smistamento assicurandosi che la valvola di flusso del campione non sia aperta troppo.

Successivamente, per isolare le MSC, posizionare una piastra di raccolta a 96 pozzetti nella camera di smistamento e impostare i cancelli di smistamento sull'istogramma PC CD 45 A per separare la popolazione positiva da quella negativa. Infine, raccogliere le cellule come popolazione mista in una provetta o singole cellule per isolare i cloni in una piastra a 96 pozzetti dopo la raccolta delle MSC polmonari mediante smistamento delle cellule. Le cellule vengono piastrate in piastre da 30 millimetri utilizzando un MEM integrato con il 20% di FBS. In primo luogo, le cellule ordinate appaiono piccole, rotonde e luminose dopo circa due o tre settimane.

Le colonie con il fenotipo mesenchimale diventano evidenti e la proliferazione è più evidente per ogni preparazione cellulare. Valutare la capacità delle MSC polmonari di differenziarsi nelle linee mesenchimali tradizionali di osteoblasti, adipociti e condrociti e la loro espressione sulla superficie cellulare di marcatori mesenchimali accettati. Eseguire l'analisi di divieto citogenetico per confermare l'assenza di anomalie cromosomiche macroscopiche.

Dopo l'isolamento mediante citometria a flusso e la generazione di cloni di singole cellule, viene eseguito un saggio di formazione di colonie per caratterizzare le cellule MSC e le capacità di differenziazione. Iniziare con le cellule diluite a tre volte 10 delle quattro cellule per millilitro. Cul medium incompleto in piatti da 100 millimetri, eseguire la diluizione dei cereali due, sei volte 10 dei quattro, tre volte 10 dei quattro, 1,5 volte 10 ai quattro e 0,75 volte 10 alle quattro celle per piatto in 10 millilitri di terreno in triplicato.

Quindi posizionare le piastre nell'incubatore dopo 10 giorni di coltura, versare il terreno e sciacquare le cellule con PBS. Quindi fissarli aggiungendo il 100% di metanolo per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo cinque minuti, versare il metanolo.

Quindi, per rilevare la formazione di colonie, aggiungere lo 0,4% in peso in volume di gza diluito da uno a 20 con l'acqua ionizzata incubare per 10-15 minuti. Quindi versare la macchia e risciacquare con l'acqua ionizzata. Lasciare asciugare i campioni all'aria e quantificare il numero di colonie contenenti più di 25 cellule per colonia utilizzando un microscopio invertito o una visualizzazione.

Le colonie sono grandi e composte da poche centinaia di cellule, come mostrato qui, e mostrano un fenotipo mesenchimale. Le MSC sono state isolate come mostrato in questo video e piastrate in piastre a 96 pozzetti per una crescita simulata. Le cellule presentanti l'antigene marcate con CFSE arrestate sono state quindi aggiunte alle MSC polmonari.

La proliferazione di MSC isolate è stata quindi misurata come la diminuzione dell'intensità media di fluorescenza di CFSE rispetto al fondo, che era costituito da solo cellule T marcate con CFSE come mostrato in questa figura, in assenza di SC polmonare e presenza di cellule presentanti l'antigene, A PC più meno O albumina CD 40 cellule T efficaci positive dimostrano una diminuzione dell'intensità di CFSE, che indica la proliferazione cerchiata in rosso. L'intensità della fluorescenza CFSE della membrana delle cellule T diminuisce econometricamente ad ogni divisione cellulare, cioè a metà ad ogni divisione in presenza di M-S-C-A-P-C polmonare più meno OVA CD 40 cellule T positive interessate non dimostrano alcun cambiamento significativo nell'intensità di CFSE, il che indica una mancanza di proliferazione dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia delle cellule staminali polmonari per esplorare il ruolo delle cellule staminali mesenchimali nelle malattie polmonari come l'ipertensione arteriosa polmonare e la fibrosi polmonare.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa cinque ore Dopo questa procedura. Altri metodi, come i saggi di differenziazione, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, tra cui se le cellule staminali mesenchimali del polmone putativo mostrano o meno un'appropriata differenziazione multi-linea, potenziale per il grasso osseo e la cartilagine.