Isolamento e caratterizzazione di Hoechst ^Basso CD45 ^Negativo Mouse cellule staminali mesenchimali del polmone

Questo video illustra un protocollo per l'isolamento di cellule staminali mesenchimali polmonari negative per CD45 a bassa espressione di CD45 dell'ospite. Le cellule staminali mesenchimali residenti nei tessuti, o MSC, sono importanti regolatori della riparazione o rigenerazione tissutale, della fibrosi, dell'infiammazione e dell'angiogenesi. Per prima cosa, i polmoni vengono dissecati da un topo sacrificato.

Il tessuto polmonare viene digerito per ottenere una sospensione di singole cellule. Le cellule vengono colorate con il colorante hoax e con CD45 e separate mediante citometria a flusso per ottenere cellule staminali mesenchimali polmonari CD45 negative e a bassa espressione di CD45 di origine ospite. Le cellule staminali mesenchimali polmonari vengono quindi espanse in coltura e viene eseguito un saggio di formazione di colonie per valutarne le capacità di differenziazione.

Possono quindi essere condotti ulteriori studi per esaminare il ruolo delle cellule staminali mesenchimali nell'omeostasi tissutale e nelle malattie. Il metodo qui descritto può essere utilizzato per isolare cellule staminali mesenchimali polmonari di topo o umane e può essere applicato allo studio di malattie polmonari come la fibrosi polmonare, l'ipertensione polmonare e la BPCO. In generale, coloro che si approcciano per la prima volta a questo metodo potrebbero incontrare difficoltà a causa della varietà di metodi disponibili per la preparazione del tessuto, nonché per quanto riguarda l'impostazione del citometro a flusso, i controlli appropriati e l'analisi.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché è difficile descrivere adeguatamente la tecnica corretta per tritare e digerire il tessuto polmonare al fine di ottenere la massima vitalità cellulare usando esclusivamente il linguaggio verbale. Inoltre, la configurazione dello strumento di citometria a flusso e le analisi sono meglio trasmesse attraverso una dimostrazione pratica. Iniziare questo protocollo rimuovendo i polmoni, che verranno utilizzati per ottenere cellule staminali mesenchimali, da un topo adulto sacrificato.

Utilizzare un piccolo paio di forbici affilate per tagliare lateralmente la gabbia toracica da entrambi i lati del topo. Aprire la cavità toracica, quindi rimuovere il diaframma. Inserire una siringa da 10 millilitri con un ago da 20 e mezzo gauge nel ventricolo destro del cuore e premere delicatamente lo stantuffo per perfondere da tre a cinque millilitri di PBS, eliminando il sangue dai polmoni.

Successivamente, utilizzando le forbici, recidere la trachea e i grossi bronchi e scartarli. Poi, usando la pinzetta, prendere i piccoli lobi polmonari bianchi e posizionarli in una piastra di Petri riempita con soluzione salina tamponata di Hank o HBSS.

Quindi rimuovere il cuore e separare i lobi polmonari. Ripetere questo procedimento per tutti i topi dello studio. Trasferire i lobi polmonari sul coperchio della piastra.

Inumidire il tessuto con la quantità minima di HBSS necessaria per evitare che si secchi. Quindi, utilizzando un bisturi monouso, tritare i lobi polmonari per ottenere il midollo osseo da usare come controllo di mantenimento per la citometria a flusso. Usare un paio di forbici affilate per tagliare alla caviglia e alla sommità del femore.

Posizionare l'arto in una nuova capsula di Petri. Quindi recidere il ginocchio, lasciando un segmento lineare di femore e un secondo segmento contenente la tibia e la fibula. Utilizzando pinzette, rimuovere il muscolo per esporre la tibia, la fibula e il femore.

Ora prendere una siringa da cinque millilitri con un ago da 26 e mezzo e inserire l'ago nell'apertura del midollo osseo. All'estremità di una tibia, tenere l'osso con l'altra estremità diretta verso un tubo conico da 50 millilitri riempito con 15 millilitri di HBSS e premere lo stantuffo per erogare HBSS e lavare il midollo osseo nel tubo. Ripetere questo procedimento con una fibula e un femore.

Colorare il midollo osseo con l'ospite 3 3 3 4 2 a una concentrazione finale di cinque microgrammi per millilitro in DMEM ad alto glucosio supplementato. Successivamente, verrà ottenuta una sospensione monocellulare di tessuto polmonare dal tessuto isolato. Posizionare ciascun polmone in un tubo contenente prewarmed 0,2% Worthington.

Preparare la collagenasi di tipo due in HBSS sterile, quindi immergere il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e incubare per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, utilizzare la pipetta da 10 millilitri per tritare il campione finché il digestato scorre facilmente attraverso la pipetta. Eseguire circa 10 ripetizioni e incubare ulteriormente per 15 minuti a 37 gradi Celsius per completare la digestione del tessuto.

Una volta completata la digestione, diluire la sospensione cellulare con HBSS e utilizzare una pipetta da cinque millilitri per tentare nuovamente di disperdere eventuali frammenti di tessuto residui. Successivamente, per rimuovere i frammenti di tessuto non digeriti, versare la sospensione attraverso un filtro cellulare da 70 micromolari in un tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere la sospensione un po' alla volta per consentire al campione di fluire attraverso il filtro cellulare.

Se frammenti di tessuto non digeriti bloccano completamente il flusso della sospensione cellulare, versare attraverso un nuovo filtro cellulare in un nuovo tubo. Centrifugare la sospensione cellulare per 10 minuti a 450 RCF.

Dopo la centrifugazione, decantare il soprannatante e risospendere delicatamente il pellet cellulare a temperatura ambiente nel buffer per la lisi dei globuli rossi; incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi aggiungere un volume uguale di HBSS per inattivare il buffer di lisi.

Versare la sospensione cellulare in un filtro cellulare da 40 micromolari per rimuovere detriti e aggregati cellulari, raccogliendo il flusso in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Successivamente, utilizzando un emocitometro, determinare il numero di cellule sia per i campioni di polmone che di midollo osseo. Registrare la concentrazione e il volume totale della sospensione cellulare.

Quindi, centrifugare la sospensione cellulare singola del polmone a 450 RCF per 10 minuti per ottenere il pellet. Per mantenere vive le cellule, risospendere contemporaneamente le cellule del polmone e del midollo osseo a una concentrazione di 10⁶ cellule per millilitro in DMEM ad alto contenuto di glucosio, supplementato e preriscaldato.

Per colorare il DNA, aggiungere il colorante HOAXED 3 3 3 4 2 a una concentrazione finale di cinque microgrammi per litro. Successivamente, mescolare le cellule mediante inversione delicata e incubare in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius esattamente per 90 minuti. Quindi, centrifugare per 10 minuti a 450 G a quattro gradi Celsius dopo la centrifugazione.

Procedere con la colorazione del tessuto polmonare e del midollo osseo con anti-CD45 e ioduro di propidio in preparazione per l'analisi mediante citometria a flusso. Una volta che le cellule sono state colorate, conservare le provette sul ghiaccio al riparo dalla luce fino all'esecuzione dell'analisi mediante citometria a flusso. Prepararsi per la citometria a flusso assicurandosi che i laser dello strumento siano allineati e che lo strumento sia configurato per il sorting cellulare.

Lo strumento utilizzato deve essere dotato di laser blu a 488 nanometri, rosso a 635 nanometri e UV compresi tra 350 e 355 nanometri, con due rilevatori sul percorso del laser UV provvisti di filtri blu 45/65 e rosso 675/50. Inoltre, il rilevatore UV-rosso deve avere un'elevata sensibilità per il segnale rosso e lo strumento deve essere equipaggiato con un'unità refrigerante per mantenere il campione a 10 gradi Celsius. Nel software dello strumento, configurare istogrammi per visualizzare lo scattering lineare anteriore rispetto a quello laterale e un grafico di discriminazione dei doppietti adeguato allo strumento.

Un grafico istogramma di PI utilizzando un segnale logaritmico, un grafico rosso contro blu utilizzando segnali lineari e un grafico istogramma di CD45 APC utilizzando un segnale logaritmico. Una volta che lo strumento è pronto, inserire il campione di midollo osseo colorato nel portello di caricamento dello strumento. Questo campione viene utilizzato come controllo della colorazione e della configurazione dello strumento.

Iniziare a raccogliere gli eventi e regolare i segnali lineari di scattering anteriore. Per visualizzare chiaramente la popolazione cellulare, le cellule devono trovarsi approssimativamente al centro in basso nel grafico di scattering anteriore sull'asse x. Poiché il colorante nucleare PI è permeabile alle membrane IMP, verrà escluso dalle cellule vive.

Disegnare una regione di gating sulla popolazione di cellule morte PI positive nell'istogramma del PI. Istruire il software dello strumento a colorare le cellule morte con questo colore di gating: rosso.

È utile utilizzare le cellule morte colorate come riferimento per identificare la popolazione G zero G uno dell'ospite. La colorazione con PI viene eccitata anche dal laser UV e la maggior parte delle cellule morte dovrebbe risultare fuori scala. Sul lato destro del grafico di fluorescenza rosso contro blu hoecsato, la popolazione G zero G uno del midollo osseo dovrebbe apparire come un gruppo compatto di eventi nel grafico rosso contro blu hoecsato.

Regolare le tensioni del rivelatore in modo da posizionare l'aggregato G0-G1 nell'angolo superiore destro del centro del grafico. Una porzione della fase S e l'intera fase G2 del ciclo cellulare potrebbero risultare fuori scala. Nella parte superiore destra del grafico rosso contro blu, la popolazione laterale a basso segnale sarà visibile come una scia che parte dal lato sinistro dell'aggregato G0-G1 e si estende fino all'angolo inferiore sinistro del grafico.

Ora tracciare un'area di selezione intorno al cluster cellulare nel grafico FSC rispetto a SSC. Riportare la popolazione di cellule singole identificata nel grafico doppio e le cellule vitali nell'istogramma del PI. Assegnare quindi il grafico hoax in modo da visualizzare solo queste popolazioni selezionate.

Dopo aver delimitato il tracciato dell'ospite, tracciare una regione attorno alla popolazione laterale. Assegnare questa regione come un gate all'istogramma CD45 APC, insieme ai gate relativi allo scatter laterale dei singoletti e alle cellule vitali. Ora che il sistema è configurato, rimuovere il campione dal portello di caricamento e inserire il campione polmonare nel portello di caricamento.

Le impostazioni dello strumento non dovrebbero necessitare ulteriori aggiustamenti per questo campione. Iniziare la raccolta degli eventi sul grafico rosso contro blu. L'agglomerato G zero G uno per il campione polmonare di solito appare più allungato nella direzione dell'asse x e assomiglia al simbolo tilde su una tastiera.

Il valore impostato per il segnale laterale dovrebbe essere posizionato in modo simile a quello impostato per il campione di midollo osseo. Potrebbero essere necessari piccoli aggiustamenti verso l'alto o verso il basso per garantire una risoluzione nitida della popolazione laterale. Mantenere una bassa differenza di pressione durante l'ordinamento assicurandosi che la valvola di flusso del campione non sia aperta eccessivamente.

Successivamente, per isolare le MSC, posizionare una piastra di raccolta a 96 pozzetti nella camera di sorting e impostare le finestre di selezione sull'istogramma CD45 APC per separare le popolazioni positive e negative. Infine, raccogliere le cellule come popolazione mista in un tubo oppure singole cellule per isolare cloni in una piastra a 96 pozzetti. Dopo il sorting cellulare per l'isolamento delle MSC polmonari, le cellule vengono seminate in piastre da 30 millimetri utilizzando MEM-A integrato con FBS al 20%. Inizialmente, le cellule ordinate appaiono piccole, rotonde e brillanti dopo circa due o tre settimane.

Le colonie con fenotipo mesenchimale diventano evidenti e la proliferazione è più marcata per ogni preparazione cellulare. Valutare la capacità delle cellule staminali mesenchimali polmonari di differenziarsi nelle tradizionali linee mesenchimali di osteoblasti, adipociti e condrociti e la loro espressione superficiale di marcatori mesenchimali accettati. Eseguire un'analisi citogenetica per confermare l'assenza di anomalie cromosomiche grossolane.

Dopo l'isolamento mediante citometria a flusso e la generazione di cloni monocellulari, viene eseguito un saggio di formazione di colonie per caratterizzare le cellule MSC e le loro capacità differenziative. Iniziare con cellule diluite a tre volte 10 alla quattro cellule per millilitro. In piastre da 100 millimetri con mezzo di coltura incompleto, effettuare diluizioni seriali di due, sei volte 10 alla quattro, tre volte 10 alla quattro, 1,5 volte 10 alla quattro e 0,75 volte 10 alla quattro cellule per piastra in 10 millilitri di mezzo, in triplice replicato.

Trascorsi 10 giorni di coltura, posizionare le piastre nell'incubatore, rimuovere il mezzo e lavare le cellule con PBS. Quindi fissarle aggiungendo metanolo al 100% per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo cinque minuti, rimuovere il metanolo.

Quindi, per rilevare la formazione di colonie, aggiungere gza al 0,4% peso/volume diluito uno a 20 con acqua ionizzata e incubare per 10-15 minuti. Successivamente, eliminare il colorante e risciacquare con acqua ionizzata. Lasciare asciugare i campioni all'aria e quantificare il numero di colonie contenenti più di 25 cellule per colonia utilizzando un microscopio invertito o un metodo di visualizzazione.

Le colonie sono grandi e costituite da alcune centinaia di cellule, come mostrato qui, e presentano un fenotipo mesenchimale. Le MSC sono state isolate come illustrato in questo video e seminate in piastre a 96 pozzetti per simulare la crescita. Successivamente, sono state aggiunte alle MSC polmonari cellule presentatrici di antigene marcate con CFSE e bloccate.

La proliferazione delle MSC isolate è stata quindi misurata come diminuzione dell'intensità media di fluorescenza di CFSE rispetto al fondo, costituito da linfociti T marcati con CFSE da soli, come mostrato in questa figura, in assenza di SC polmonari e in presenza di cellule presentanti l'antigene, APC più o meno OVA. Linfociti T effettori CD40 positivi mostrano una diminuzione dell'intensità di CFSE, che indica proliferazione, evidenziata in rosso. L'intensità di fluorescenza di CFSE sulla membrana dei linfociti T diminuisce in modo equimolare con ogni divisione cellulare, ovvero si dimezza ad ogni divisione. In presenza di MSC polmonari APC più o meno OVA, i linfociti T effettori CD40 positivi non mostrano alcun cambiamento significativo nell'intensità di CFSE, il che indica assenza di proliferazione dopo il loro sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia delle cellule staminali polmonari per esplorare il ruolo delle cellule staminali mesenchimali in malattie polmonari come l'ipertensione arteriosa polmonare e la fibrosi polmonare.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa cinque ore seguendo questa procedura. Altri metodi, come i saggi di differenziamento, possono essere effettuati per rispondere ad ulteriori domande, inclusa la verifica se le presunte cellule staminali mesenchimali polmonari mostrano un appropriato potenziale di differenziamento multilinaggio verso osso, grasso e cartilagine.