Visualizzazione della migrazione delle cellule della cresta neurale in un embrione di pesce zebra utilizzando l'imaging time lapse multi-fotone

Inizia con un embrione di pesce zebra transgenico vivo e dechorionato incorporato in agarosio a basso punto di fusione e posto in una camera riempita con terreni embrionali.

L'embrione esprime cellule della cresta neurale marcate con proteina fluorescente verde potenziata (EGFP).

Posizionare la camera sul tavolino del microscopio. Utilizzando l'illuminazione a campo chiaro, regolare l'obiettivo per mettere a fuoco e centrare l'embrione nel campo visivo.

Passa all'obiettivo a immersione in acqua e concentrati nuovamente sull'embrione.

Regola i parametri di imaging per acquisire immagini Z-stack dal bordo laterale a quello mediale, catturando la larghezza dell'occhio.

Disattiva l'illuminazione a campo chiaro, copri il palco e avvia l'imaging time-lapse.

Riempire la camera con il fluido secondo necessità durante l'imaging.

Sotto l'illuminazione laser, le cellule della cresta neurale diventano fluorescenti.

Visualizza la migrazione di queste cellule dal tubo neurale alle regioni craniofacciali, intorno all'occhio in via di sviluppo per popolare il mesenchima perioculare e il processo frontonasale e ventralmente per formare gli archi faringei.

Dopo aver posizionato l'intera configurazione sul tavolino del microscopio, secondo il protocollo di testo, utilizzare l'obiettivo cinque volte per localizzare l'embrione. Quindi sollevare manualmente il tavolino nella posizione più alta e utilizzare la messa a fuoco fine per posizionare l'embrione al centro della portata del microscopio.

Abbassa manualmente il livello e cambia l'obiettivo cinque volte con l'obiettivo di immersione in acqua 25 volte. Solleva con cautela il tavolino per riportare l'embrione a fuoco. Nel software, fare clic sulla modalità xyzt per ottenere più immagini a intervalli di tempo o t nel piano xy su una profondità di z.

Usa l'epifluorescenza o la vista in campo chiaro per trovare la profondità di messa a fuoco nell'area di interesse, che delimiterà lo z-stack. Per questi esperimenti, il bordo laterale dell'occhio è l'inizio dello z-stack. Quando lo stato attivo qui nel software, fai clic sul pulsante Inizia. Dopo aver messo a fuoco la linea mediana dell'embrione, che è la fine della pila z, fai clic sul pulsante Fine.

Un passaggio fondamentale consiste nell'assicurarsi che il passaggio z includa l'area di interesse. Nel nostro caso, vogliamo catturare la larghezza dell'occhio dai bordi laterali a quelli mediali.

Fare clic sul menu per regolare il tempo di acquisizione e la frequenza di imaging. Per un adeguato recupero del fluoroforo e la sopravvivenza dell'embrione, prevedere un rapporto di almeno 1 a 3 tra l'acquisizione dello z-stack quando il laser è acceso e il tempo di recupero quando il laser è spento. Con il tempo appropriato per il recupero dell'embrione, impostare il tempo tra le pile z e la finestra designata. Impostare quindi la durata totale dell'esperimento nella finestra appropriata.

Ora attiva l'impostazione dell'immagine dal vivo per apportare le regolazioni finali alle impostazioni del laser. Regola le barre di scorrimento della trasmissione laser, del guadagno e dell'offset all'interno del software per ottimizzare l'immagine a fluorescenza. Inoltre, regola l'orientamento dell'embrione secondo necessità a seconda della durata dell'esperimento, della crescita prevista dell'embrione, eccetera. Assicurati che l'area di interesse rimanga all'interno dell'inquadratura per tutta la durata dell'esperimento.

Durante l'acquisizione time-lapse, spegnere la sorgente luminosa per epifluorescenza. Coprire il palco con la scatola di sicurezza laser, che è sufficiente per la protezione dalla luce di fondo. Quindi premere Start.

Accedi alla camera del bagno aperta attraverso le porte scorrevoli sulla scatola di sicurezza laser per riempirla con il mezzo embrionale time-lapse ogni 8-12 ore. Dopo l'acquisizione dell'imaging, aprire i file nel software di elaborazione delle immagini. Evidenzia la serie di immagini corretta.

Nel software, scegliere il menu Processo. Fare clic su Deconvoluzione 3D e applicare per deconvolve ogni z-stack. Importa singoli file TIFF nel software di elaborazione video. Quindi seleziona tutti i file TIFF e trascinali nell'editor video. Regola la lunghezza di ogni immagine all'interno del video a 0,1 secondi. Infine, esporta il video come file MOV o MP4.