Visualizzazione dei modelli di proiezione assonale dei motoneuroni embrionali in Drosophila

Inizia con un tubo contenente embrioni di Drosophila in fase avanzata 16 in un terreno di montaggio.

I motoneuroni di Drosophila sono immunomarcati.

Trasferire un embrione su un vetrino e rimuoverlo dal mezzo di montaggio.

Quindi, posiziona l'embrione con il lato ventrale rivolto verso l'alto e sezionalo.

Orientare la sezione anteriore contenente i motoneuroni con il lato dorsale rivolto verso l'alto.

Usando un ago di tungsteno, taglia lungo la linea mediana dorsale e allarga la parete del corpo. Sposta l'embrione nel terreno di montaggio. Quindi, rimuovere gli organi interni per esporre i

neuroni

Trasferire l'embrione su un nuovo vetrino, quindi montarlo e sigillarlo.

Osservare con un microscopio a contrasto di interferenza differenziale mentre la luce passa attraverso l'embrione, generando un'immagine ad alta risoluzione.

I neuroni marcati con modelli di proiezione assonale appaiono marrone scuro su uno sfondo chiaro.

I motoneuroni si ramificano in due nervi principali: i nervi intersegmentali e segmentali e un ramo minore, il nervo trasverso, che innerva i muscoli.

Per filettare gli embrioni, metterli in scena su un vetrino

Per prima cosa, spostarli in una goccia di glicerolo con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Successivamente, al microscopio da dissezione, tagliare la parte anteriore a 1 quarto della lunghezza del corpo. E rimuovi la regione più posteriore, che è priva di assoni motori.

Ora, utilizzando una sonda ad ago, spostare il preparato fuori dal glicerolo, orientato con il lato dorsale rivolto verso l'alto, e posizionarlo orizzontalmente nel campo visivo. Il passaggio successivo richiede un ago di tungsteno sottile che è stato inserito nella regione cava di una sonda ad ago e poi piegato all'estremità. Usando l'ago di tungsteno, fai un piccolo taglio all'estremità posteriore dell'embrione e continua a tagliare la linea mediana dorsale.

Assicurarsi che la punta dell'ago di tungsteno non tocchi la superficie del vetrino durante la dissezione, perché l'ago si piegherà facilmente contro il vetro.

Quindi, con la sonda, riportare il preparato nella goccia di glicerolo e posizionarla con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Lì, stacca l'intestino dalla parete del corpo dispiegando ciascuna parete del corpo in una direzione laterale ventrale. Le due pareti del corpo dovrebbero separarsi. Ora, utilizzando la sonda, spostare con cautela le alette della parete del corpo su un vetrino. Sul vetrino, utilizzare un ago di tungsteno per rimuovere gli organi interni spingendoli lateralmente.

Per stabilizzare l'ago di tungsteno ed evitare che venga danneggiato, mantenere le sonde dell'ago cavo che tengono l'ago di tungsteno rinforzate contro la superficie del vetrino mentre si manipola l'ago di tungsteno.

Ora monta i preparati e 8 microlitri di soluzione di montaggio su un nuovo vetrino. Attacca un vetrino coprioggetti e sigilla i bordi con un normale smalto per unghie. Quindi, acquisisci immagini ad alta risoluzione utilizzando l'ottica DIC.