Visualizzazione del modello di proiezione Axonal dei motoni embrionali in

L'obiettivo generale di questo esperimento è analizzare i modelli di proiezione dei motoneuroni negli embrioni di Drosophila melanogaster in stadio avanzato. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dello sviluppo neuronale, come la guida dell'assone motorio e la formazione delle sottounità neurali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce una visualizzazione precisa degli assoni motori negli embrioni in via di sviluppo, consentendo un'analisi affidabile del percorso assonale e dei difetti legati alla condizione bersaglio.

Un giorno dopo aver allestito le piastre per la raccolta delle uova, sostituire le piastre con nuove contenenti una piccola quantità di pasta di lievito appena preparata. Dopo tre ore sulle piastre fresche, trasferire i moscerini su nuove bottiglie di alimento. Incubare quindi le piastre con le uova tutta la notte a 25 gradi Celsius.

Al mattino, aggiungere 1,8 millilitri di soluzione PBT alle piastre. Utilizzare quindi un bastoncino di cotone per staccare gli embrioni. Successivamente, con una pipetta da 1 millilitro, trasferire gli embrioni e la soluzione in un tubo da microcentrifuga.

Una volta che gli embrioni si sono depositati sul fondo, aspirare tutta la soluzione possibile. Quindi risciacquare gli embrioni due volte utilizzando un millilitro di PBT per ogni risciacquo. Per decoronare gli embrioni, sostituire l'ultimo risciacquo con un millilitro di ipoclorito al 50% e agitare il tubo per tre minuti a temperatura ambiente.

Per rimuovere la candeggina, lavare gli embrioni tre volte con PBT. Quindi, sostituire l'ultimo lavaggio con mezzo millilitro di eptano al 00% e mezzo millilitro di paraformaldeide al 4%. A questo punto, incubare gli embrioni per 15 minuti con agitazione delicata.

Dopo l'incubazione, rimuovere lo strato di soluzione sottostante e aggiungere nuovamente 500 microlitri di metanolo al 100%. Ora, agitare vigorosamente il tubo per 30 secondi per devitellinizzare gli embrioni. Successivamente, rimuovere la soluzione sovrastante, aggiungere nuovamente 500 microlitri di metanolo al 100% e agitare il tubo per altri 10 secondi.

Dopo aver agitato il tubo, batterlo leggermente per favorire l'assestamento degli embrioni ed eliminare la maggior quantità possibile di soluzione. Successivamente, sciacquare brevemente gli embrioni con metanolo al 100%. Quindi, sciacquare immediatamente gli embrioni con PBT per tre volte.

Ora, risospendere gli embrioni in un millilitro di PBT fresco. Incubare gli embrioni a 37 gradi Celsius per 15 minuti per prepararli alla colorazione con LacZ. Mentre gli embrioni sono in incubazione, preparare un'aliquote di un millilitro di soluzione di colorazione X-gal.

Riscaldare l'aliquota in un bagno d'acqua a 65 gradi Celsius fino a quando diventa torbida. Successivamente trasferirla in un blocco termoregolato a 37 gradi Celsius. Dopo che gli embrioni sono stati riscaldati per 15 minuti, rimuovere la soluzione PBT e sostituirla con l'aliquota di un millilitro di soluzione colorante.

Quindi aggiungere 20 microlitri di substrato X-gal. Incubare il tubo a 37 gradi Celsius con agitazione delicata per circa due o quattro ore, fino a quando si forma un precipitato blu. Successivamente, rimuovere la soluzione di colorazione e risciacquare gli embrioni tre volte con PBT a temperatura ambiente.

Dopo i lavaggi, utilizzare una sonda aghiata o pinzette per selezionare manualmente gli embrioni sotto un microscopio stereoscopico. Raccogliere gli embrioni colorati di interesse in una microprovetta da mezzo millimetro utilizzando una pipetta da un millilitro. Successivamente, lavare gli embrioni selezionati con 0,4 millilitri di PBT.

Quindi, sostituire il PBT con 0,3 millilitri di soluzione di blocco e lasciare che gli embrioni incubino con agitazione delicata per 15 minuti. Dopo 15 minuti, aggiungere 75 microlitri dell'anticorpo primario e proseguire l'incubazione per tutta la notte. La mattina seguente, lavare gli embrioni con PBT per circa due ore, cambiando la soluzione di lavaggio ogni 30 minuti circa.

Dopo il lavaggio, aggiungere 0,3 millilitri di soluzione bloccante contenente l'anticorpo secondario e incubare il tubo con movimento lento a temperatura ambiente per tutta la notte. La mattina seguente, lavare gli embrioni con PBT per circa tre ore. Cambiare il PBT almeno cinque volte durante il periodo di lavaggio.

Dopo il lavaggio, risospendere gli embrioni in 0,3 millilitri di soluzione dab e aggiungere due microlitri di perossido di idrogeno al 3%. Quindi, incubarli al buio con agitazione delicata a temperatura ambiente fino a quando non si è formato un quantitativo sufficiente di precipitato. Ciò richiede generalmente da 30 a 60 minuti.

Quindi, lavare gli embrioni con PBT quattro volte e risospendere in 0,2 millilitri di soluzione di montaggio. A questo punto, lasciare equilibrare gli embrioni al buio a 4 gradi Celsius. Per filettare gli embrioni, posizionarli su un vetrino.

Posizionarli innanzitutto in una goccia di glicerolo con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Successivamente, sotto un microscopio stereoscopico, rimuovere la parte anteriore e un quarto della lunghezza del corpo, eliminando anche la regione più posteriore, priva di assoni motori. Ora, utilizzando una sonda a forma di ago, spostare il preparato fuori dalla glicerolo, orientandolo con il lato dorsale verso l'alto, e posizionarlo orizzontalmente nel campo visivo.

Il passaggio successivo richiede un sottile ago di tungsteno inserito nella regione cava di una sonda per ago e successivamente piegato all'estremità. Utilizzando l'ago di tungsteno, praticare un piccolo taglio all'estremità posteriore dell'embrione e continuare a tagliare lungo la linea mediana dorsale. Assicurarsi che la punta dell'ago di tungsteno non tocchi la superficie del vetrino durante la dissezione, poiché l'ago si piegherebbe facilmente a contatto con il vetro.

Quindi, con la preparazione del ritorno della sonda, tornare alla goccia di glicerolo e posizionarla con il lato dorsale rivolto verso l'alto. A questo punto, staccare l'intestino dalla parete corporea dispiegando ciascun lato della parete corporea in direzione ventro-laterale. I due lembi della parete corporea dovrebbero separarsi.

Ora, utilizzando la sonda, spostare con attenzione i lembi della parete corporea su un vetrino. Sul vetrino, usare un ago di tungsteno per rimuovere gli organi interni spingendoli lateralmente. Per stabilizzare l'ago di tungsteno ed evitare che si danneggi, mantenere la sonda con l'ago cavo inserita e tenere l'ago di tungsteno appoggiato contro la superficie del vetrino mentre lo si manovra.

Ora, montare i preparati in otto microlitri di soluzione di montaggio su un nuovo vetrino. Applicare un coprioggetto e sigillare i bordi con normale smalto per unghie. Successivamente, acquisire le immagini ad alta risoluzione utilizzando ottiche DIC.

Utilizzando il metodo descritto, gli embrioni allo stadio 16 sono stati colorati con l'anticorpo Fas2 e preparati per la visualizzazione dei neuroni motori e degli emisegmenti addominali A3 e A4. Normalmente, almeno sette neuroni motori estendono e fascicolano i loro assoni per formare un ramo del nervo ISNb. In questa preparazione erano inoltre identificabili numerosi fasci nervosi circostanti. Quando il fascio nervoso intersegmentale raggiunge il punto di scelta a livello dei muscoli 6 e 7, due assoni si defascicolano selettivamente e innervano i muscoli 6 e 7.

Lo stesso avviene in altri punti di scelta man mano che il fascio si estende in direzione dorsale. Successivamente, all'ultimo punto di scelta, due assoni innervano il muscolo 12. Al contrario, negli embrioni mutanti per Sema-1a, gli stessi assoni non riescono a defascicolare ai loro punti di scelta.

Questo non è inaspettato poiché si sa che il prodotto Sema-1 aegean contribuisce a formare connessioni tra assoni motori e muscoli bersaglio durante lo sviluppo neurale. Pertanto, il metodo descritto può essere utilizzato per analizzare i fenotipi mutanti. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come selezionare gli embrioni mutanti desiderati, come immunomarcare i modelli di proiezione assonale dei neuroni motori e come dissezionare embrioni fissati per la preparazione in piano.