Visualizzazione del modello di proiezione Axonal dei motoni embrionali in Drosophila

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di analizzare i modelli di proiezione dei motoneuroni negli embrioni in fase avanzata di Drosophila melanogaster. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello sviluppo neurale, come la guida motoria degli assoni e la formazione delle sottocellule neurali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una visualizzazione precisa dell'assone motorio negli embrioni in via di sviluppo, il che consente un'analisi affidabile del percorso assonale e il targeting del difetto della condizione.

Un giorno dopo l'installazione delle piastre di raccolta delle uova, sostituire le piastre con altre nuove contenenti una piccola quantità di pasta di lievito appena fatta. Dopo tre ore sui piatti freschi, trasferire le mosche in nuove bottiglie di cibo. E incubare i piatti delle uova durante la notte a 25 gradi Celsius.

Al mattino, aggiungere 1,8 millilitri di soluzione PBT alle piastre. E usa un batuffolo di cotone per rimuovere gli embrioni. Quindi, utilizzando una pipetta da 1 millilitro, trasferire gli embrioni e la soluzione in una provetta da microcentrifuga.

Una volta che gli embrioni si sono depositati sul fondo, aspirare quanta più soluzione possibile. Quindi sciacquare gli embrioni due volte utilizzando un millilitro di PBT per risciacquo. Per decorare gli embrioni, sostituire l'ultimo risciacquo con un millilitro di candeggina al 50% e far oscillare il tubo per tre minuti a temperatura ambiente.

Per rimuovere la candeggina, sciacquare gli embrioni tre volte con PBT. Quindi, sostituire l'ultimo risciacquo con mezzo millilitro di eptano al 100% e mezzo millilitro di paraformaldeide al 4%. Ora, incubare gli embrioni per 15 minuti con un leggero dondolio.

Dopo l'incubazione, rimuovere lo strato di soluzione sottostante e aggiungere nuovamente 500 microlitri di metanolo al 100%. Ora, per 30 secondi, agitare energicamente la provetta per devitellinizzare gli embrioni. Quindi, rimuovere la soluzione sovrastante, aggiungere nuovamente 500 microlitri di metanolo al 100% e agitare il tubo per altri 10 secondi.

Dopo aver agitato il tubo, picchiettarlo per aiutare gli embrioni a depositarsi e rimuovere quanta più soluzione possibile. Successivamente, sciacquare brevemente gli embrioni con metanolo al 100%. Quindi, sciacquare immediatamente gli embrioni con PBT tre volte.

Ora, risospendere gli embrioni in un millilitro di PBT fresco. E incubare gli embrioni a 37 gradi Celsius per 15 minuti per prepararli alla colorazione LacZ. Mentre gli embrioni covano, preparare un'aliquota da un millilitro di soluzione colorante X-gal.

Scaldare l'aliquota in un bagnomaria a 65 gradi Celsius fino a quando non diventa torbida. Quindi trasferirlo in un blocco termico a 37 gradi Celsius. Dopo che gli embrioni sono stati riscaldati per 15 minuti, rimuovere la soluzione di PBT e sostituirla con l'aliquota di un millilitro di soluzione colorante.

Quindi aggiungere 20 microlitri di substrato X-gal. Per circa due-quattro ore, incubare la provetta a 37 gradi Celsius con un leggero dondolio fino a formare un precipitato blu. Quindi, rimuovere la soluzione colorante e sciacquare gli embrioni tre volte con PBT a temperatura ambiente.

Dopo i risciacqui, utilizzare una sonda ad ago o una pinza per selezionare manualmente gli embrioni al microscopio da dissezione. Raccogli gli embrioni colorati di interesse in una provetta da microcentrifuga da mezzo millimetro utilizzando una pipetta da un millilitro. Successivamente, lavare gli embrioni selezionati con 0,4 millilitri di PBT.

Quindi, sostituire il PBT con 0,3 millilitri di soluzione bloccante e lasciare incubare gli embrioni con una leggera agitazione per 15 minuti. Dopo 15 minuti, aggiungere 75 microlitri dell'anticorpo primario e continuare l'incubazione durante la notte. La mattina seguente, lavare gli embrioni con PBT per circa due ore, cambiando la soluzione di lavaggio ogni 30 minuti circa.

Dopo il lavaggio, aggiungere 0,3 millilitri di soluzione bloccante contenente l'anticorpo secondario e incubare la provetta con un leggero oscillazione a temperatura ambiente per una notte. La mattina successiva, lavare gli embrioni con PBT per circa tre ore. Sostituire il PBT almeno cinque volte durante il periodo di lavaggio.

Dopo il lavaggio, risospendere gli embrioni in 0,3 millilitri di soluzione di dab e aggiungere due microlitri di perossido di idrogeno al 3%. Quindi, incubarli al buio con un leggero dondolio a temperatura ambiente fino a quando non viene prodotto abbastanza precipitato. Questo richiede generalmente dai 30 ai 60 minuti.

Quindi, sciacquare gli embrioni con PBT quattro volte e risospenderli in 0,2 millilitri di soluzione di montaggio. Ora, lascia che gli embrioni si equilibrino al buio a 4 gradi Celsius. Per filettare gli embrioni, metterli in scena su un vetrino.

Per prima cosa spostali in una goccia di glicerolo con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Successivamente, sotto un microscopio da dissezione, tagliare la parte anteriore e 1/4 della lunghezza del corpo e rimuovere la regione più posteriore, che è priva di assoni motori. Ora, utilizzando una sonda ad ago, spostare il preparato fuori dal glicerolo, orientato con il lato dorsale rivolto verso l'alto e posizionarlo orizzontalmente nel campo visivo.

Il passaggio successivo richiede un ago di tungsteno sottile che è stato inserito nella regione cava di una sonda ad ago e quindi piegato all'estremità. Usando l'ago di tungsteno, fai un piccolo taglio all'estremità posteriore dell'embrione e continua a tagliare la linea mediana dorsale. Assicurarsi che la punta dell'ago di tungsteno non tocchi la superficie del vetrino durante la dissezione, perché l'ago si piegherà facilmente contro il vetro.

Quindi, con la sonda, riportare la preparazione alla goccia di glicerolo e posizionarla con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Lì, stacca l'intestino dalla parete del corpo dispiegando ciascuna parete del corpo in direzione ventrale-laterale. Le due pareti del corpo dovrebbero separarsi.

Ora, utilizzando la sonda, spostare con cautela le alette della parete del corpo su un vetrino. Sul vetrino, utilizzare un ago di tungsteno per rimuovere gli organi interni spingendoli lateralmente. Per stabilizzare l'ago di tungsteno ed evitare che venga danneggiato, mantenere l'ago cavo sondato e tenere l'ago di tungsteno rinforzato contro la superficie del vetrino mentre si manipola l'ago di tungsteno.

Ora, montare i preparati in otto microlitri di soluzione di montaggio su un nuovo vetrino. Attacca un vetrino coprioggetti e sigilla i bordi con un normale smalto per unghie. Quindi, acquisisci immagini ad alta risoluzione utilizzando l'ottica DIC.

Utilizzando il metodo descritto, gli embrioni allo stadio 16 sono stati colorati con l'anticorpo Fas2 e preparati per la visualizzazione dei motoneuroni e degli emisegmenti addominali A3 e A4. Normalmente, almeno sette motoneuroni estendono e fascicolano i loro assoni per formare un ramo nervoso ISNb. In questa preparazione erano identificabili anche molti fasci nervosi circostanti. Quando il fascio nervoso intersegmentale raggiunge il punto di scelta nei muscoli 6 e 7, due assoni defascicolano selettivamente e snervano i muscoli 6 e 7.

Lo stesso accade in altri punti di scelta quando il fascio si estende dorsalmente. Quindi, all'ultimo punto di scelta, due assoni snervano il muscolo 12. Al contrario, negli embrioni mutanti Sema-1a gli stessi assoni non riescono a defascicolare nei punti di loro scelta.

Questo non è inaspettato in quanto il prodotto Sema-1 aegean è noto per aiutare a formare connessioni tra gli assoni motori e i muscoli bersaglio durante lo sviluppo neurale. Pertanto, il metodo descritto può essere utilizzato per analizzare i fenotipi mutanti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ordinare gli embrioni mutanti desiderati, come immunocolorare i modelli di proiezione assonale dei motoneuroni e come sezionare gli embrioni fissati per una preparazione piatta.