Visualizzazione del sistema nervoso embrionale in Whole-mount Drosophila Embrioni

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare embrioni di oph e melanogaster per la visualizzazione dell'intera montatura del sistema nervoso. Ciò si ottiene raccogliendo prima gli embrioni dal ceppo di mosca di interesse. Il secondo passo della procedura consiste nel rimuovere il corium con candeggina.

Il terzo passo della procedura consiste nell'applicare eptano e metanolo per rimuovere la membrana del vilin. La fase finale della procedura consiste nell'applicare gli anticorpi agli embrioni. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano la struttura del sistema nervoso dell'embrione di drosofila attraverso la microscopia a immunofluorescenza.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come ad esempio quale ruolo possono svolgere le mutazioni nello sviluppo del sistema nervoso. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché potrebbero accidentalmente espellere gli embrioni dalla fiala. Iniziare questo protocollo preparando i reagenti necessari, tra cui P-E-M-F-A, tampone PBC 5%BSA con soluzione salina di sodio azide allo 0,01% e fissativo della formaldeide.

Prepara una gabbia per il ceppo di drosophila di interesse mettendo fuori combattimento le mosche con anidride carbonica e poi trasferendo almeno 100 mosche in una bottiglia di plastica contenente un adattatore con una piastra di alimentazione per agar succo di mela. Metti la gabbia delle mosche al buio a temperatura ambiente per 72 ore. Cambia le piastre di alimentazione dell'agar per succo di mela ogni 8-12 ore in modo che le mosche si acclimatino alla gabbia e non trattengano le uova per l'esperimento.

Dopo il periodo di acclimatazione di 72 ore, raccogliere gli embrioni 12 ore dall'ultimo cambio nella piastra di alimentazione dell'agar al succo di mela. Rimuovere la piastra di alimentazione dell'agar succo di mela dalla gabbia di posa e sostituirla con una soluzione salina. Sciacquare la piastra di alimentazione dell'agar al succo di mela.

Raccogli gli embrioni in un setaccio fine. Usa un pennello pulito per rimuovere gli embrioni che rimangono attaccati alla piastra. Sciacquare gli embrioni nel setaccio con soluzione fisiologica per eliminare il lievito in eccesso utilizzando una spatola, raccogliere delicatamente gli embrioni e metterli in una piccola fiala di vetro.

Aggiungere circa un millilitro di soluzione salina. Quindi tappare la fiala e incubare per cinque minuti per lavare gli embrioni. A seguito della raccolta degli embrioni.

Preparare la soluzione fissa di eptano combinando il 50% di eptano e il 50% di fissativo. La soluzione sarà stratificata con l'eptano sopra e il fissativo sul fondo. Trascorsi cinque minuti, utilizzare una pipetta per pasta per rimuovere la soluzione salina in eccesso dalla fiala di vetro degli embrioni.

Sciacquare gli embrioni con acqua deionizzata applicando circa un millilitro di acqua deionizzata sulla fiala di vetro contenente gli embrioni. Lasciare riposare gli embrioni per un minuto prima di rimuovere l'acqua in una soluzione di candeggina al 50%. Agitare la fiala alcune volte a mano e poi incubare per tre minuti in modo da ricoprire gli embrioni.

Gli embrioni ati affonderanno sul fondo della fiala. I COR embrionali galleggeranno. Rimuovere la candeggina e i CORs dopo tre minuti di incubazione.

Dopo la decorazione, sciacquare accuratamente gli embrioni con acqua deionizzata applicando circa un millilitro di acqua deionizzata sulla fiala di vetro contenente gli embrioni. Lasciare riposare gli embrioni per un minuto prima di rimuovere l'acqua che rimane I CORs galleggeranno e dovrebbero essere rimossi. Aggiungere la soluzione di eptano agli embrioni e incubarli per 30 minuti agitandoli delicatamente per fissarli dopo la fissazione.

Utilizzare una pipetta per pasta per rimuovere il fissativo, che è lo strato inferiore, lasciando l'eptano nel tubo. Quindi aggiungere nuovamente il metanolo sul fondo della provetta al posto del fissativo e tappare la provetta, agitare energicamente a mano per rimuovere la membrana vitellina. Seguendo questo passaggio, gli embrioni izzati affonderanno sul fondo della tuba.

Utilizzando una pipetta per pasta, rimuovere il metanolo e l'eruzione dalla fiala lasciando dietro di sé gli embrioni deionizzati. Quindi sciacquare gli embrioni cinque volte con metanolo, rimuovendo il metanolo con una pipetta per pasta tra ogni risciacquo. Per ogni risciacquo, incubare gli embrioni per cinque minuti.

Metti gli embrioni in una miscela di soluzione al 50% di PBT e al 50% di metanolo per cinque minuti per reidratarli. Quindi continuare il processo di reidratazione trasferendoli in una soluzione 100% PBT per cinque minuti. Successivamente, bloccare gli embrioni incubandoli in BSA al 5% con una soluzione di azoturo di sodio allo 0,01% per un'ora a quattro gradi Celsius.

Successivamente, preparare l'anticorpo primario per la colorazione dell'embrione diluendolo alla concentrazione appropriata utilizzando il 5% di BSA con una soluzione di sodio azide allo 0,01%. Gli anticorpi utilizzati qui sono diretti contro la proteina della stringa vescicolare della cisteina e l'anticorpo anti HRP. L'anti HRP riconosce una porzione di carboidrati neuralmente specifica presente nelle glicoproteine di superficie, che etichetta tutti i neuroni.

Incubare gli embrioni durante la notte a quattro gradi Celsius nella soluzione di anticorpi primari. Lavare gli embrioni 10 volte con PBT nel corso di un'ora. Applicando circa un millilitro di PBT sulla fiala di vetro contenente gli embrioni, lasciare riposare gli embrioni per sei minuti prima di rimuovere il PBT.

Ripetere questo processo di applicazione del PBT, incubazione e rimozione del PBT 10 volte. Preparare la soluzione di anticorpi secondari al buio perché è sensibile alla luce diluendo alla concentrazione appropriata. Utilizziamo gli anticorpi secondari di Alexa a una concentrazione di uno su 200.

Incubare gli embrioni per due ore a quattro gradi Celsius nella soluzione di anticorpi secondari. Avvolgere la fiala di vetro degli embrioni e la soluzione di anticorpi secondari in un foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce. Lavare gli embrioni 10 volte con PBT nel corso di un'ora.

Aggiungere il mezzo di montaggio dello scudo vettore agli embrioni e incubarli durante la notte a quattro gradi Celsius per il montaggio. Usa una pipetta pastello per aspirare gli embrioni insieme a parte del terreno di montaggio. Applicare gli embrioni e il terreno su un vetrino.

Applicare un vetrino coprioggetti sugli embrioni e sigillare il vetrino coprioggetti con lo smalto per unghie. Visualizza gli embrioni utilizzando un microscopio a fluorescenza qui. Il SNC embrionale si manifesta allo stadio 16-17.

La proteina della stringa di cistina è mostrata in rosso. I neuroni HRP sono mostrati in verde. Si noti la distinta colorazione della commessura in questa immagine rappresentativa.

Il PNS embrionale si manifesta allo stadio 16-17. Ancora una volta, la proteina della stringa di cistina è mostrata in rosso e i neuroni sono mostrati in verde. Si notino gli schemi ripetuti dei neuroni periferici.

Quando si tenta questa procedura, è importante prestare attenzione agli embrioni in modo da non rimuoverli accidentalmente dalla fiala. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare gli embrioni oph fla per la visualizzazione dell'intera montatura del sistema nervoso.