Visualizzazione del sistema nervoso embrionale in Whole-mount Drosophila Embrioni
11 dicembre 2010
Descriviamo la procedura per preparare in scena Drosophila Embrioni per la visualizzazione del sistema nervoso embrionale durante l'embriogenesi.
L'obiettivo generale di questa procedura è preparare embrioni di oph e melanogaster per la visualizzazione in toto del sistema nervoso. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo embrioni dalla linea di moscerini di interesse. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'eliminare il corio con candeggina.
Il terzo passaggio della procedura consiste nell'applicare eptano e metanolo per rimuovere la membrana villosa. L'ultimo passaggio della procedura prevede l'applicazione di anticorpi agli embrioni. Alla fine, è possibile ottenere risultati che mostrano la struttura del sistema nervoso dell'embrione di drosophila mediante microscopia a immunofluorescenza.
Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze, ad esempio quale ruolo possano svolgere le mutazioni nello sviluppo del sistema nervoso. In generale, le persone alle prime armi con questa tecnica potrebbero incontrare difficoltà perché potrebbero aspirare accidentalmente gli embrioni dalla provetta. Iniziare questo protocollo preparando i reagenti necessari, inclusi P-E-M-F-A, il tampone PBC con soluzione salina contenente BSA al 5% e azide di sodio allo 0,01%, nonché il fissativo a base di formaldeide.
Preparare una gabbia per il ceppo di drosophila di interesse anestetizzando le mosche con anidride carbonica e trasferendo quindi almeno 100 mosche in una bottiglia di plastica contenente un adattatore con una piastra di alimentazione in agar agar di succo di mela. Collocare la gabbia con le mosche al buio a temperatura ambiente per 72 ore. Cambiare le piastre di alimentazione in agar agar di succo di mela ogni otto-dodici ore, in modo che le mosche si abituino all'ambiente della gabbia e non trattenano le uova per l'esperimento.
Dopo il periodo di ambientamento di 72 ore, raccogliere gli embrioni a 12 ore dall'ultimo cambio della piastra di alimentazione con agar all'estratto di mela. Rimuovere la piastra di alimentazione con agar all'estratto di mela dalla gabbia di deposizione e sostituirla con soluzione salina. Sciacquare la piastra di alimentazione con agar all'estratto di mela.
Raccogliere gli embrioni in un setaccio fine. Utilizzare un pennello pulito per rimuovere gli embrioni che rimangono attaccati alla piastra. Sciacquare gli embrioni nel setaccio con soluzione salina per eliminare il lievito in eccesso utilizzando una spatola, sollevare delicatamente gli embrioni e posizionarli in un piccolo vial di vetro.
Aggiungere circa un millilitro di soluzione salina. Quindi chiudere la provetta e incubare per cinque minuti per lavare gli embrioni. Successivamente alla raccolta degli embrioni.
Preparare la soluzione fissa di eptano mescolando il 50% di eptano e il 50% di fissativo. La soluzione formerà uno strato di eptano in alto e uno di fissativo in basso. Trascorsi cinque minuti, utilizzare una pipetta da cucina per rimuovere il sale in eccesso dal vial di vetro contenente gli embrioni.
Risciacquare gli embrioni con acqua deionizzata applicando circa un millilitro di acqua deionizzata nel vial di vetro contenente gli embrioni. Lasciare gli embrioni a riposo per un minuto prima di rimuovere l'acqua con una soluzione al 50% di candeggina. Agitare il vial alcune volte a mano, quindi incubare per tre minuti al fine di ricoprire gli embrioni.
Gli embrioni trattati affonderanno sul fondo della provetta. Le COR embrionali galleggeranno. Rimuovere la candeggina e le COR dopo l'incubazione di tre minuti.
Dopo la decorazione, risciacquare accuratamente gli embrioni con acqua deionizzata applicando circa un millilitro di acqua deionizzata al vial di vetro contenente gli embrioni. Lasciare gli embrioni a riposo per un minuto prima di rimuovere l'acqua; i COR residui galleggeranno e dovranno essere rimossi. Aggiungere la soluzione di fissaggio con eptano agli embrioni e incubarli per 30 minuti con agitazione delicata per fissarli dopo la fissazione.
Utilizzare una pipetta Pasteur per rimuovere il fissativo, ovvero lo strato inferiore, lasciando l'eptano nel tubo. Quindi aggiungere di nuovo metanolo fino al fondo del tubo al posto del fissativo e chiudere il tubo con il tappo; agitare vigorosamente a mano per rimuovere la membrana vitellina. Dopo questo passaggio, gli embrioni fissati affonderanno sul fondo del tubo.
Utilizzando una pipetta per pasta, rimuovere il metanolo e gli eteri dalla provetta, lasciando indietro gli embrioni disionizzati. Quindi risciacquare gli embrioni cinque volte con metanolo, rimuovendo il metanolo con una pipetta per pasta tra ogni risciacquo. Per ogni risciacquo, incubare gli embrioni per cinque minuti.
Posizionare gli embrioni in una miscela di soluzione PBT al 50% e metanolo al 50% per cinque minuti per reidratarli. Proseguire quindi il processo di reidratazione trasferendoli in soluzione PBT al 100% per cinque minuti. Successivamente, bloccare gli embrioni incubandoli in soluzione di BSA al 5% con azoturo di sodio allo 0,01% per un'ora a quattro gradi Celsius.
Successivamente, preparare l'anticorpo primario per la colorazione dell'embrione diluendolo alla concentrazione appropriata utilizzando una soluzione di BSA al 5% con azoturo di sodio allo 0,01%. Gli anticorpi utilizzati in questo caso sono diretti contro la proteina legante la cisteina vescicolare e l'anticorpo anti HRP. L'anti HRP riconosce una molecola carboidratica neurale specifica presente nei glicoproteine di superficie, che etichetta tutti i neuroni.
Incubare le uova durante la notte a quattro gradi Celsius nella soluzione di anticorpo primario. Lavare le uova 10 volte con PBT nell'arco di un'ora. Applicando circa un millilitro di PBT nel vial di vetro contenente le uova, lasciare riposare le uova per sei minuti prima di rimuovere il PBT.
Ripetere questo processo di applicazione di PBT, incubazione ed eliminazione di PBT per 10 volte. Preparare la soluzione dell'anticorpo secondario al buio perché è sensibile alla luce, diluendola alla concentrazione appropriata. Utilizziamo anticorpi secondari Alexa a una concentrazione di uno a 200.
Incubare gli embrioni per due ore a quattro gradi Celsius in soluzione con l'anticorpo secondario. Avvolgere il vial di vetro contenente gli embrioni e la soluzione con l'anticorpo secondario in un foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce. Lavare gli embrioni 10 volte con PBT nell'arco di un'ora.
Aggiungere mezzo di montaggio con vettore protettivo agli embrioni e incubarli durante la notte a quattro gradi Celsius per il montaggio. Utilizzare una pipetta pastello per aspirare gli embrioni insieme ad un po' del mezzo di montaggio. Applicare gli embrioni e il mezzo su un vetrino di vetro.
Applicare un coprioggetto sugli embrioni e sigillare il coprioggetto con smalto per unghie. Visualizzare gli embrioni utilizzando un microscopio a fluorescenza qui. Il sistema nervoso centrale embrionale è mostrato allo stadio 16-17.
La proteina del filamento di cistina è mostrata in rosso. I neuroni HRP sono mostrati in verde. Si noti la colorazione distinta del commissura in questa immagine rappresentativa.
Il SNP embrionale è mostrato allo stadio 16-17. Ancora una volta, la cistina proteica è mostrata in rosso e i neuroni sono mostrati in verde. Si notino i modelli ripetuti di neuroni periferici.
Quando si tenta questa procedura, è importante fare attenzione agli embrioni per non rimuoverli accidentalmente dal flacone. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare embrioni oph fla per la visualizzazione in toto del sistema nervoso.
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Panoramica
Questo articolo descrive una procedura dettagliata per preparare embrioni di Drosophila in diversi stadi allo scopo di visualizzare il sistema nervoso embrionale durante l'embriogenesi. Il metodo comprende diverse fasi, tra cui il prelievo degli embrioni, la fissazione e la colorazione con anticorpi, permettendo infine l'osservazione delle strutture neuronali mediante microscopia a immunofluorescenza.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Embriologia
Sfondo
- Comprendere il sistema nervoso embrionale è fondamentale per ottenere informazioni sui processi dello sviluppo.
- La visualizzazione delle strutture neuronali può contribuire a chiarire gli effetti delle mutazioni genetiche.
- La microscopia a immunofluorescenza è una tecnica potente per lo studio dei componenti cellulari.
- Una corretta preparazione degli embrioni è essenziale per ottenere risultati di imaging soddisfacenti.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo affidabile per la visualizzazione del sistema nervoso negli embrioni di Drosophila.
- Facilitare la ricerca sul ruolo delle mutazioni nello sviluppo del sistema nervoso.
- Migliorare la comprensione della struttura neuronale embrionale attraverso tecniche avanzate di imaging.
Metodi Utilizzati
- Prelevamento di embrioni da ceppi specifici di Drosophila.
- Utilizzo di candeggina e eptano per la rimozione della membrana e la fissazione.
- Applicazione di anticorpi primari e secondari per la colorazione specifica.
- Visualizzazione degli embrioni mediante microscopia a fluorescenza.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita del sistema nervoso embrionale allo stadio 16.
- Dimostrazione dell'efficacia del protocollo di marcatura con anticorpi.
- Informazioni sull'organizzazione strutturale dei neuroni negli embrioni in via di sviluppo.
- Individuazione delle potenziali difficoltà del protocollo per i nuovi ricercatori.
Conclusioni
- Il protocollo descritto fornisce un metodo completo per lo studio del sistema nervoso embrionale di Drosophila.
- La microscopia a immunofluorescenza è validata come strumento efficace per questa ricerca.
- Studi futuri possono sfruttare questo metodo per esplorare l'influenza genetica sullo sviluppo del sistema nervoso.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La visualizzazione del sistema nervoso embrionale in embrioni di Drosophila interi consente un'analisi ad alta risoluzione dello sviluppo neuronale e delle perturbazioni genetiche. Questo flusso di lavoro supporta la validazione precoce degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico fornendo una visualizzazione diretta dell'architettura neuronale e delle conseguenze fenotipiche delle mutazioni. L'approccio è strategicamente posizionato per il triage del portafoglio e per garantire un'elevata affidabilità predittiva nei percorsi di ricerca sullo sviluppo neurologico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente una valutazione diretta dei fenotipi neuronali in risposta a modifiche genetiche.
- Permette la validazione funzionale di bersagli nello sviluppo neurologico mediante visualizzazione basata su anticorpi.
- Semplifica la riduzione del rischio meccanicistico rivelando pattern anomali del sistema nervoso con risoluzione a singola cellula.
- Fornisce una piattaforma solida per l'indagine guidata da ipotesi sui percorsi dello sviluppo.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Stabilisce un sistema riproducibile per la visualizzazione quantitativa di strutture neuronali.
- Standardizza il rilevamento basato su anticorpi per lo screening successivo di perturbazioni genetiche o chimiche.
- Permette una preparazione scalabile di embrioni per flussi di lavoro di imaging ad alto contenuto.
- Fornisce output quantitativi adatti per analisi comparative tra diverse condizioni sperimentali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli rilevanti per le malattie consentendo la visualizzazione di difetti dello sviluppo neurologico.
- Permette un percorso continuo dalla scoperta genetica alla validazione preclinica in neurobiologia.
- Fornisce endpoint fenotipici per il progresso mirato a ridurre i rischi di composti neuroattivi.
- Migliora il valore predittivo per l'identificazione di biomarcatori traslazionali nelle neuroscienze dello sviluppo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla verifica iniziale delle ipotesi genetiche fino all'identificazione dei composti promettenti e alla validazione di modelli preclinici nella ricerca neurosviluppativa.
- Biologia della scoperta: Supporta il test dell'ipotesi nulla consentendo la visualizzazione dei cambiamenti nei modelli neuronali a seguito di manipolazione genetica.
- Screening: Fornisce output di imaging standardizzati e riproducibili per lo screening comparativo degli effetti fenotipici.
- Analisi: Offre letture quantitative basate su anticorpi per un'analisi statistica robusta dello sviluppo neuronale.
- Ricerca traslazionale: Collega le fasi di scoperta e preclinica allineando gli output fenotipici con endpoint rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma riutilizzabile per diversi studi sullo sviluppo neurologico in diversi contesti genetici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione di target nello sviluppo neurologico.
- Valore operativo: Fornisce flussi di lavoro standardizzati, scalabili e riproducibili per la visualizzazione neuronale basata su anticorpi.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione dei progetti e l'efficienza nell'uso del capitale, fornendo una chiarezza fenotipica precoce.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione dei target e dei composti nello sviluppo neurologico in base a un adeguamento del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione di Drosophila e nella microscopia a immunofluorescenza.
- Richiede l'accesso a infrastrutture per l'immagine a fluorescenza e a reagenti anticorpali validati.
- Necessita di una rigorosa standardizzazione tra i gruppi di lavoro per lo stadio degli embrioni e i protocolli di colorazione.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diversi background genetici o stadi di sviluppo.
- Una manipolazione accurata degli embrioni è fondamentale per evitare la perdita di campioni e garantire la riproducibilità.
