Name: Visualizzazione del sistema nervoso embrionale in Whole-mount Drosophila Embrioni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Impara a preparare embrioni di Drosophila per visualizzare il sistema nervoso embrionale con microscopia a immunofluorescenza. Questo metodo consente di studiare lo sviluppo neuronale e gli effetti delle mutazioni genetiche.

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SG è sostenuto da fondi del State University di New York a Buffalo e da John R. Oishei Foundation.

1. Preparazione dei reagenti <ol><li> Preparare il tampone PEMFA utilizzando tubi 100mm, 2mM EGTA, e 1 mM MgSO 4. Regolare il pH del tampone a 7,0. Il buffer è PEMFA filtro sterilizzato e conservato a 4 ° C. </li><li> Preparare PBT con l'aggiunta di 1 ml di Triton X-100 a 100 ml 1x PBS (tampone fosfato) (pH 7,0). Conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare 5% BSA (albumina di siero bovino) con 0,01% NaAcide in 1x PBS (pH 7,0). </li><li> Preparare la soluzione salina con NaCl 0,7% e 0,03% Triton X-100 in acqua deionizzata. </li><li> Preparare il fissativo combinando 4 parti tampone PEMFA con 1 parte di formaldeide al 37%. </li></ol> 2. Raccolta di embrioni <ol><li> Preparare una gabbia per il ceppo di Drosophila interesse mettendo&gt; 100 vola in una bottiglia di plastica contenente un adattatore con piastra di agar alimentazione. </li><li> Lascia la gabbia di mosche al buio a temperatura ambiente per 72 ore, cambiando le piastre ogni 8-12 ore, in modo che le mosche abituarsi alla gabbia e non tenere le loro uova. </li><li> Per l'esperimento raccogliere embrioni per 12 ore. Rimuovere la capsula di Petri dal contenitore e sostituirla. Prendere la piastra Petri rimosso e lavare gli embrioni fuori il piatto usando la soluzione salina e un pennello pulito. </li><li> Raccogliere gli embrioni in un setaccio fine. Sciacquare con soluzione fisiologica per rimuovere ogni eccesso di lievito. </li><li> Con una spatola delicatamente raccogliere gli embrioni e metterli in un flaconcino di vetro con un coperchio. Aggiungere circa 1 ml di soluzione salina. </li></ol> 3. La rimozione delle membrane Chorion e vitellina e Fixation <ol><li> In seguito alla raccolta di embrioni, preparare la Eptano-Fix soluzione combinando eptano 50% e 50% fissativo. La soluzione sarà a strati con eptano in alto e il fissativo sul fondo. </li><li> Nel flacone di vetro lavare gli embrioni in incubazione, in nella soluzione salina per 5 minuti. Rimuovere salina in eccesso con una pipetta Pasteur. </li><li> Sciacquare gli embrioni con acqua deionizzata. </li><li> Dechorionate gli embrioni in incubazione, in nel 50% di candeggina per 3 minuti. </li><li> Sciacquare gli embrioni a fondo con acqua deionizzata. </li><li> Fissare gli embrioni incubando per 30 minuti nel Eptano-Fix soluzione agitando delicatamente. </li><li> Utilizzando una pipetta Pasteur sostituire il fissativo (strato inferiore) con metanolo lasciando il eptano nel tubo. Agitare vigorosamente per rimuovere la membrana vitellina. Gli embrioni devitellinized si depositano sul fondo della provetta. </li><li> Raccogliere gli embrioni in un flacone di vetro nuovo con una pipetta Pasteur. Sciacquare gli embrioni cinque volte con metanolo, ogni volta incubare gli embrioni per 5 minuti. </li></ol> 4. Anticorpi colorazione, montaggio e visualizzazione <ol><li> Reidratare gli embrioni in una miscela di soluzione al 50% PBT e metanolo al 50% per 5 minuti. Poi reidratare in 100% di soluzione di PBT per 5 minuti. </li><li> Blocco degli embrioni in incubazione, in in 5% di BSA con la soluzione NaAcide 0,01% per 1 ora a 4 ° C. </li><li> Gli embrioni sono ora pronti per la colorazione degli anticorpi. Preparare l'anticorpo primario diluendo alla concentrazione adeguata utilizzando 5% di BSA con la soluzione NaAcide 0,01%. Noi usiamo un anticorpo contro la proteina stringa cisteina (CSP), una proteina vescicolare sinaptico e un anti-HRP o cavallo anticorpi perossidasi ravanello, che riconosce un neuronali specifici porzione di carboidrati presenti nel glicoproteine ​​di superficie e le etichette tutti i neuroni. </li><li> Incubare gli embrioni notte a 4 ° C nella soluzione di anticorpo primario. </li><li> Il giorno seguente, lavare gli embrioni 10 volte con PBT nel corso di un'ora. </li><li> Preparare la soluzione secondaria di anticorpi diluendo la concentrazione adeguata. Noi utilizziamo gli anticorpi Alexa secondario ad una concentrazione di 1:200. </li><li> Incubare gli embrioni per due ore a 4 ° C nella soluzione di anticorpo secondario. </li><li> Lavare gli embrioni 10 volte con PBT nel corso di un'ora. </li><li> Incubare gli embrioni pernottamento in Medio Vectashield montaggio. </li><li> Montare gli embrioni su un vetrino e sigillare il coprioggetto con smalto. Visualizza embrioni utilizzando un microscopio a fluorescenza. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1a.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> CSP <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1b.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> HRP-FITC <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1c.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Uniti Figura 1: un rappresentante che mostra le immagini del sistema nervoso centrale in fase embrionale 16-17, utilizzando anticorpi contro CSP (rosso) e HRP (verde). Si noti la colorazione distinta della commessura. <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig2a.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> CSP <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig2b.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> HRP-FITC "/&gt; Uniti Figura 2: immagini rappresentative che mostra il PNS embrionale allo stadio 16-17 utilizzando anticorpi contro CSP (rosso) e HRP (verde). Si noti il ​​pattern ripetuti di neuroni periferici.

<ol><li>Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+sensory+organs+by+mutations+of+the+cut+locus+of+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster.</a> Cell. 51, 293-307 (1987).</li>
<li>Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+of+the+peripheral+nervous+system+in+Drosophila+embryos%3A+DNA+replication+patterns+and+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis of the peripheral nervous system in Drosophila embryos: DNA replication patterns and cell lineages.</a> Neuron. 3, 21-32 (1989).</li>
<li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+JA+%22The+Embryonic+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Embryonic Development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer-Verlag. New York. (1985).</li>
<li>Carroll, S. B., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+fushi+tarazu+protein+during+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of the fushi tarazu protein during Drosophila embryogenesis.</a> Cell. 43, 47-57 (1985).</li>
<li>Dambly-Chaudière, C., Ghysen, A., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+connections+between+imaginal+discs+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Muscle connections between imaginal discs in Drosophila.</a> Developmental Biology. 113, 288-294 (1986).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;embrione Drosophila è un potente sistema per indagare i cambiamenti molecolari e cellulari durante lo sviluppo neuronale. In questo protocollo abbiamo dimostrato come preparare gli embrioni montare tutto per immunoistochimica. Abbiamo adattato questo protocollo dal protocollo descritto a Carroll e Scott, 1985. Questo protocollo può essere adattato anche a test altri anticorpi neuronali, ma l&#39;ottimizzazione degli anticorpi dovrebbe essere fatto. Inoltre, difetti di sviluppo embrionale del SNP e del SNC...

<table><tbody><tr><td>Formaldeide al 37%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-25</td><td></td></tr><tr><td>CSP</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HRP-FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>323-095-021</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Capra Anti-Mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizzazione del sistema nervoso embrionale in whole-mount drosophila embrioni

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

L&#39;embrione Drosophila è un sistema modello interessante per studiare le basi cellulari e molecolari dello sviluppo neuronale. Qui si descrive la procedura per la visualizzazione del sistema nervoso embrionale Drosophila utilizzando anticorpi alle proteine ​​neuronali. Dal momento che l&#39;intero sistema nervoso periferico embrionale e nervoso centrale sono ben caratterizzati a livello delle singole cellule (Dambly-Chaudière et al, 1986;.. Bodmer et al, 1987;. Bodmer et al, 1989), eventuali aberrazioni di questi sistemi possono essere facilmente identificati utilizzando anticorpi per diverse proteine ​​neuronali. Gli embrioni di sviluppo sono raccolti in certi orari per garantire che gli embrioni sono in fase di sviluppo per la corretta visualizzazione. Dopo la raccolta, gli strati esterni dell&#39;embrione, la membrana corion e la busta vitellina che circonda l&#39;embrione, vengono rimosse prima fissazione. Gli embrioni vengono poi incubate con anticorpi neuronali ed è visualizzato mediante fluorescente anticorpi secondari. Gli embrioni in fasi 12-17 sono visualizzate per accedere al sistema nervoso embrionale. Nella fase 12 il germe SNC band inizia dalla fase di accorciamento e 15, il modello definitivo della commessura è stato raggiunto. Dal palco 17 i contratti SNC e del SNP è completamente sviluppato (Campos-Ortega et al. 1985). Così i cambiamenti nel modello del SNP e del SNC possono essere facilmente osservati durante questi stadi di sviluppo.

Descriviamo la procedura per preparare in scena<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni per la visualizzazione del sistema nervoso embrionale durante l&#39;embriogenesi.

Visualizzazione del sistema nervoso embrionale in Whole-mount Drosophila Embrioni

L'embrione di Drosophila è un sistema modello interessante per indagare le basi cellulari e molecolari dello sviluppo neuronale. In questo lavoro descriviamo il...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare embrioni di oph e melanogaster per la visualizzazione in toto del sistema nervoso. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo embrioni dalla linea di moscerini di interesse. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'eliminare il corio con candeggina.Il terzo passaggio della procedura consiste nell'applicare eptano e metanolo per rimuovere la membrana villosa. L'ultimo passaggio della procedura prevede l'applicazione di anticorpi sugli embrioni. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la struttura del sistema nervoso dell'embrione di drosophila mediante microscopia a immunofluorescenza.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze, ad esempio quale ruolo possano svolgere le mutazioni nello sviluppo del sistema nervoso. In genere, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà, poiché potrebbe accidentalmente aspirare gli embrioni dal flacone. Iniziare questo protocollo preparando i reagenti necessari, inclusi P-E-M-F-A, il tampone PBC con soluzione salina contenente BSA al 5% e azide di sodio allo 0,01%, nonché il fissativo a base di formaldeide.Preparare una gabbia per la ceppa di drosophila di interesse anestetizzando le mosche con anidride carbonica e trasferendo quindi almeno 100 mosche in una bottiglia di plastica contenente un adattatore con una piastra di coltura a base di agar e succo di mela. Collocare la gabbia con le mosche al buio a temperatura ambiente per 72 ore. Cambiare le piastre di coltura a base di agar e succo di mela ogni otto-dodici ore in modo che le mosche si abituino alla gabbia e non trattengano le uova per l'esperimento.Dopo il periodo di ambientamento di 72 ore, raccogliere gli embrioni a distanza di 12 ore dall'ultimo cambio della piastra di alimentazione con agar all'acqua di mela. Rimuovere la piastra di alimentazione con agar all'acqua di mela dalla gabbia di deposizione e sostituirla utilizzando soluzione salina. Sciacquare la piastra di alimentazione con agar all'acqua di mela.Raccogliere gli embrioni in un setaccio fine. Utilizzare un pennello pulito per staccare eventuali embrioni rimasti attaccati alla piastra. Sciacquare gli embrioni nel setaccio con soluzione salina per rimuovere qualsiasi lievito in eccesso utilizzando una spatola, sollevare delicatamente gli embrioni e posizionarli in un piccolo vial di vetro.Aggiungere circa un millilitro di soluzione salina. Quindi chiudere la provetta e incubare per cinque minuti per lavare gli embrioni. Dopo il prelievo degli embrioni.Preparare la soluzione fissa di eptano combinando il 50% di eptano e il 50% di fissativo. La soluzione formerà uno strato di eptano in alto e uno di fissativo in basso. Trascorsi cinque minuti, utilizzare una pipetta da cucina per rimuovere il sale in eccesso dal vial di vetro contenente gli embrioni.Risciacquare gli embrioni con acqua deionizzata applicando circa un millilitro di acqua deionizzata al vial di vetro contenente gli embrioni. Lasciare riposare gli embrioni per un minuto prima di rimuovere l'acqua con una soluzione di candeggina al 50%. Agitare il vial alcune volte a mano, quindi incubare per tre minuti al fine di rivestire gli embrioni.Gli embrioni trattati affonderanno sul fondo della provetta. Le COR embrionali galleggeranno. Rimuovere la candeggina e le COR dopo l'incubazione di tre minuti.Dopo la decorazione, risciacquare accuratamente gli embrioni con acqua deionizzata applicando circa un millilitro di acqua deionizzata al vial di vetro contenente gli embrioni. Lasciare riposare gli embrioni per un minuto prima di rimuovere l'acqua; i COR residui galleggeranno e dovranno essere rimossi. Aggiungere la soluzione fissante eptano a gli embrioni e incubarli per 30 minuti con agitazione delicata per fissarli dopo la fissazione.Utilizzare una pipetta di plastica per rimuovere il fissativo, che è lo strato inferiore, lasciando l'eptano nel tubo. Quindi aggiungere di nuovo metanolo nella parte inferiore del tubo al posto del fissativo e chiudere il tubo; agitare vigorosamente a mano per rimuovere la membrana vitellina. Dopo questo passaggio, gli embrioni fissati affonderanno sul fondo del tubo.Utilizzando una pipetta per pasta, rimuovere il metanolo e gli eterozigoti dal vial, lasciando indietro gli embrioni disionizzati. Quindi risciacquare gli embrioni cinque volte con metanolo, rimuovendo il metanolo con una pipetta per pasta tra ogni risciacquo. Per ogni risciacquo, incubare gli embrioni per cinque minuti.Posizionare gli embrioni in una miscela di soluzione PBT al 50% e metanolo al 50% per cinque minuti per reidratarli. Proseguire quindi il processo di reidratazione trasferendoli in soluzione PBT al 100% per cinque minuti. Successivamente, bloccare gli embrioni incubandoli in soluzione di BSA al 5% con azoturo di sodio allo 0,01% per un'ora a quattro gradi Celsius.Successivamente, preparare l'anticorpo primario per la colorazione dell'embrione diluendolo alla concentrazione appropriata utilizzando una soluzione di BSA al 5% con azoturo di sodio allo 0,01%. Gli anticorpi utilizzati in questo caso sono diretti contro la proteina vesicolare con catena di cisteina e l'anticorpo anti HRP. L'anti HRP riconosce una molecola carboidratica neurale specifica presente nei glicoproteine di superficie, che etichetta tutti i neuroni.Incubare le uova durante la notte a quattro gradi Celsius nella soluzione di anticorpo primario. Lavare le uova 10 volte con PBT nell'arco di un'ora. Applicando circa un millilitro di PBT al vial di vetro contenente le uova, lasciare riposare le uova per sei minuti prima di rimuovere il PBT.Ripetere questo processo di applicazione di PBT, incubazione ed eliminazione di PBT per 10 volte. Preparare la soluzione dell'anticorpo secondario al buio perché è sensibile alla luce, diluendola alla concentrazione appropriata. Utilizziamo anticorpi secondari Alexa a una concentrazione di uno a 200.Incubare gli embrioni per due ore a quattro gradi Celsius nella soluzione di anticorpo secondario. Avvolgere il vial di vetro contenente gli embrioni e la soluzione di anticorpo secondario in un foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce. Lavare gli embrioni 10 volte con PBT nell'arco di un'ora.Aggiungere mezzo di montaggio con vettore protettivo agli embrioni e incubarli durante la notte a quattro gradi Celsius per il montaggio. Utilizzare una pipetta pastello per aspirare gli embrioni insieme a un po' del mezzo di montaggio. Applicare gli embrioni e il mezzo su un vetrino di vetro.Applicare un coprioggetto sugli embrioni e sigillare il coprioggetto con smalto per unghie. Visualizzare gli embrioni utilizzando un microscopio a fluorescenza qui. Il SNC embrionale è mostrato allo stadio 16-17.La proteina con stringa di cistina è mostrata in rosso. I neuroni HRP sono mostrati in verde. Si noti la colorazione distinta del commissura in questa immagine rappresentativa.Il SNP embrionale è mostrato allo stadio 16-17. Ancora una volta, la cistina proteica è mostrata in rosso e i neuroni sono mostrati in verde. Si notino i modelli ripetuti di neuroni periferici.Quando si tenta questa procedura, è importante fare attenzione agli embrioni per non rimuoverli accidentalmente dal vial. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare embrioni oph fla per la visualizzazione in toto del sistema nervoso.

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