Cattura cellula Utilizzando un dispositivo a microfluidi

I dispositivi, così come li abbiamo preparati, sono confezionati in kit da 10 o 20 e, quando arrivano, vengono spediti freddi in una scatola e il kit contiene tutti i componenti necessari per funzionare. L'esperimento nel kit è, è un pacchetto con tutte le siringhe e i tamponi, che possono rimanere a temperatura ambiente. C'è anche una copia del protocollo che andremo a seguire in questo esperimento.

C'è anche una scatola refrigerata, che contiene i dispositivi effettivi e tutti i tamponi in funzione che devono essere refrigerati. In genere, i kit sono confezionati in gruppi di 10 o 20. Quando non vengono utilizzati, i kit devono essere refrigerati.

Ogni siringa e ogni componente del kit è accuratamente etichettato e le etichette corrispondono alla tabella del protocollo che seguiamo. Quindi non c'è ambiguità su quale siringa o componente del kit debba essere utilizzato nei singoli passaggi. Dopo aver disimballato i dispositivi e averli collocati in una cabina di sicurezza biologica, eseguiremo la procedura di isolamento dei neutrofili e di lisologia per applicazioni genomiche a valle, perché il salvavita che otterremo sarà utilizzato per isolare o, o estrarremo l'RNA dal lisato cellulare.

Per questo motivo, vogliamo assicurarci che la nostra area sia pulita, non solo in senso sterile, ma anche pulita da tutti gli RNA che sono tipicamente presenti nell'ambiente. Quindi è molto importante pulire tutta la tua area e i tuoi dispositivi con la soluzione che distrugge gli RNA. Quindi, in genere, puliremo tutti i nostri strumenti e le nostre superfici di lavoro con RNA SAP o RNA, che puoi ottenere da un certo numero di produttori.

Il dispositivo è stato confezionato in una busta termosaldata. Ogni dispositivo è sigillato e codificato con questo codice a barre. Dovresti, dovresti prendere nota di questo codice a barre se stai lavorando con campioni clinici.

Quindi il dispositivo viene aperto, il coperchio viene rimosso e viene posizionato nel dispositivo del collettore di tenuta della pompa. Il campione di sangue che utilizziamo è un campione di sangue intero. Lo faremo passare attraverso la siringa BD standard da un mil, e questa è etichettata come siringa uno.

In genere ciò che viene fatto è che la siringa viene rimossa dalla confezione e il tappo viene rimosso con cura dal tubo del sangue. E quello che fai è far cadere 700 microlitri o 0,7 mil di sangue e iniettare metà di quello o 350 microlitri in un tubo da 1,5 mil. Grazie. In questo modo il tuo sangue può essere trasmesso per ulteriori elaborazioni.

La tua provetta di sangue può essere trasmessa e tuttavia ti rimane ancora più sangue in caso di guasto di un dispositivo. Quindi ora quello che faremo è caricare la siringa che contiene sangue, su questo ago, che è collegato a un pezzo di tubo con questo dispositivo. Vogliamo essere molto, con, con il dispositivo di isolamento microfluidico.

Vogliamo stare molto attenti a non introdurre bolle d'aria nel, nel dispositivo o, o il dispositivo non funzionerà correttamente. Quindi in genere quello che facciamo è prendere la siringa e spingere verso il basso lo stantuffo e aggiungere il liquido sulla superficie superiore del dispositivo, assicurandoci che sia completamente sposato prima di aver espulso tutto il liquido. Ci fermiamo e rimuoviamo con cura il corpo della siringa dall'ago e sostanzialmente riempiamo la punta dell'ago o, o il, il connettore dell'esca dell'ago con il tampone rimanente che si trova in questa siringa.

Ne disponiamo. Quindi prenderemo la nostra siringa con il sangue e la inseriremo in questo mozzo per esche. Facendo attenzione a non versare il sangue e facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria.

Trova meglio usare un kemo che tiene il corpo della siringa e il tubo nel caso in cui venga versato del sangue. Una volta, una volta che la siringa è collegata all'alloggiamento del tubo o all'ago, le diamo alcuni colpi bruschi per rimuovere eventuali bolle d'aria, che potrebbero trovarsi sul connettore. Questa siringa viene quindi caricata sulla pompa a siringa e poi su, e viene fissata con la vite di bloccaggio.

La pompa a siringa è accesa ed è già preimpostata in base alle nostre condizioni di flusso. Faremo fluire questo sangue attraverso il dispositivo a 30 microlitri al minuto. Una volta che il corpo della siringa è stato caricato nella pompa a siringa, premeremo il pulsante sul braccio mobile dello stantuffo e lo faremo scorrere verso il basso fino a toccare la parte superiore dello stantuffo e iniziare a spingere il fluido fuori attraverso la punta di questo.

È un ago in acciaio inossidabile a punta smussata. Una volta che sappiamo che il sistema è innescato, premeremo il tasto Esegui. Per iniziare il flusso di sangue, si preme stop per fermarlo e poi si prende una provetta da centrifuga pulita da 1,5 mil o una provetta fendor e si scollegherà con cura.

Scollegane solo uno, scollega il tubo da una porta del dispositivo. Una volta scollegato questo tubo, lo inseriremo nel tubo del fandor da 1,5 mil. Premeremo run per ricominciare il flusso sanguigno.

E quando vediamo formarsi una goccia di sangue, fermiamo la pompa e la inseriamo nell'ingresso che abbiamo appena aperto nel dispositivo. Premeremo run per iniziare il flusso di sangue e imposteremo un timer per cinque minuti. Vogliamo assicurarci che il sangue riempia equamente tutte le camere e che non ci siano bolle d'aria evidenti nel dispositivo.

Se ci sono bolle d'aria che bloccano il flusso in una qualsiasi delle camere, puoi prendere un paio di pinzette e farle scorrere lungo i piccoli canali, che portano alle camere di cattura o ai piccoli canali che escono dalle camere di cattura. Questo dispositivo si sta riempiendo bene, quindi dopo cinque minuti, si preme stop sulla pompa a siringa per interrompere il flusso di sangue, si allenta il morsetto per la siringa e lo si estrae dal supporto della pompa a siringa. Quindi useremo la siringa numero tre, che è caricata con PBS privo di nucleasi Utilizzeremo, in pratica, ci assicureremo ancora una volta che la superficie del dispositivo sia sposata per evitare bolle d'aria, toccheremo la siringa per farne qualcuna, assicurandoci che eventuali bolle d'aria siano nella parte superiore del corpo della siringa.

Allentare il braccio della pompa a siringa e inserire la siringa a tre mulini nella pompa. Stringerlo verso il basso e poi spingere lo stantuffo verso il basso fino a quando non tocca lo stantuffo della siringa. Premiamo Esegui e aspettiamo che il liquido adeschi il dispositivo e aspettiamo di vedere una gocciolina sulla punta dell'ago in acciaio inossidabile.

Quando si vede una goccia che si forma, si ferma la pompa. Toglieremo il sangue, la punta di acciaio inossidabile che contiene il sangue. Inseriremo il tampone di lavaggio e premeremo Esegui.

E lo lasceremo andare avanti per cinque minuti. E dovresti prendere una salvietta pulita e asciugare qualsiasi piccola quantità di sangue, che potrebbe essere all'ingresso o all'uscita per Dopo cinque minuti di funzionamento del tampone di lavaggio attraverso il dispositivo, il dispositivo dovrebbe essere completamente ripulito da qualsiasi sangue e puoi vedere che praticamente non ci sarà più sangue rosso nel dispositivo, Il dispositivo apparirà chiaro. Quindi, dopo i cinque minuti, interromperemo l'esecuzione del buffer di lavaggio.

E di nuovo, toglieremo la siringa dalla pompa a siringa. Tapapperemo la provetta per microcentrifuga da 1,5 mil, proprio sul tubo di uscita flessibile. E solleveremo con cautela il tubo, il tubo della microcentrifuga, tirando fuori il tubo di scarico dal dispositivo.

Lo getteremo via in un contenitore a rischio biologico. Nel kit c'è un nuovo tubo di uscita, che in realtà è realizzato in teflon. Ha di nuovo, una punta in acciaio inossidabile.

Sostituiremo il vecchio tubo di uscita con questo nuovo tubo di uscita. Prenderemo quel tubo di uscita e cercheremo di piegarlo attorno a una sorta di forma a U o V. E poi anche con il kit c'è una colonna trituratrice kaya, questo taglia il DNA e fondamentalmente omogeneizza la vita della tua cellula.

Quindi apriremo il tappo viola della colonna del trituratore e posizioneremo il tubo di uscita nella colonna del trituratore Kay. Tireremo fuori dal kit la siringa numero due, che dice, per RLT la useremo. Si tratta di una siringa BD standard da un mil a siringa con punta smussata calibro 22, in acciaio inossidabile.

Lo useremo per iniettare 350 microlitri di RLT standard da kyogen nel dispositivo. Poiché il dispositivo ha un volume morto di circa 50 microlitri, quello che vogliamo fare è iniettare l'RLT, ma dietro l'RLT, vogliamo iniettare un tappo d'aria, per rilasciare quel volume morto del dispositivo nella colonna del trituratore chi. Quindi il modo in cui lo faremo è prendere la nostra siringa, tirare, aspirare 350 microlitri di aria e poi seguire 350 microlitri o 0,35 mil di RLT e l'RLT è ora sul fondo della siringa.

Resisti alla tentazione di capovolgere la siringa e iniettare l'aria. L'aria è lì per assicurarci di far entrare tutto l'RLT nella nostra colonna di triturazione Kay. Tireremo fuori il tubo che si trova dal tampone di lavaggio.

Inseriremo la nostra siringa con l'RLT e inietteremo lentamente l'RLT nel dispositivo per un periodo di circa 30 secondi, assicurandoci che il tubo di uscita espelle i suoi rifiuti nella colonna del trituratore chi. Una volta che l'aria inizia a essere iniettata nel dispositivo, si preme verso il basso il plumer e si attende che tutto il fluido venga rilasciato nella colonna Kay Shredder. Prendiamo la colonna del trituratore Kay e la facciamo girare su un microcenter fuge con un bilanciamento a 15.000 giri/min o al massimo RPM su un fusibile microcenter da banco per due minuti.

Quindi, dopo aver fatto girare la colonna per due minuti, ne estrarremo il campione, che ora è in RLT e lo metteremo in una delle fiale criogeniche con tappo viola in dotazione. Se stai lavorando con un campione clinico, campiona queste fiale criogeniche, lo etichetterai all'inizio dell'esperimento. Ecco il lisato nella fiala criogenica.

Questa fiala criogenica viene immediatamente posta in un congelatore AC C a meno 80 gradi e conservata per la spedizione o la successiva estrazione dell'RNA. Quindi questo è un protocollo alternativo per l'isolamento dei neutrofili. Invece di lisare le cellule con un tampone RLT, le coloreremo con una colorazione istologica standard.

Una macchia. Quindi estraiamo il dispositivo sigillato dal sacchetto e lo scartiamo di nuovo, annotiamo il numero di lotto sul dispositivo e posizioniamo la capsula di Petri. Nel supporto per piastre di Petri.

Prenderemo la siringa da un millimetro dalla sua siringa numero uno, la caricheremo con 700 microlitri di sangue e ne inietteremo metà 350 microlitri in un tubo DPH a scomparsa. Lo metteremo da parte. Prendi la siringa quattro, che ha il tubo che useremo per selezionare, iniettare il sangue nel dispositivo.

Terrà la base dell'ago dalla punta del tubo in modo chimico. Togli il corpo della siringa e riempi l'esca. L'adattatore tamponerebbe e smaltirebbe quella siringa.

Inseriremo la siringa contenente sangue nell'ago usando la salvietta chimica per raccogliere eventuali fuoriuscite. Picchietteremo la siringa per rimuovere eventuali bolle d'aria nel collegamento tra l'ago e il corpo della siringa. Caricheremo la siringa nella pompa a siringa, adescheremo il tubo spingendo verso il basso il braccio mobile della pompa a siringa.

Scollegheremo il tubo da una delle uscite del dispositivo, il dispositivo di cattura, e lo inseriremo in un tubo da 1,5 mil einor. E poi inizieremo a far scorrere il sangue premendo la pompa a siringa. Aspetteremo che si formi una goccia di sangue sulla punta in acciaio inossidabile.

Una volta che la gocciolina si forma, si preme stop per tamponare il sangue, inserirlo nel dispositivo e premere Esegui. Ora impostiamo un timer per cinque minuti. Ok, dopo aver fatto scorrere il dispositivo per cinque minuti, premere stop sulla pompa a siringa e rilasciare la siringa.

E sostituiremo quella siringa con la siringa da tre mil contenente il nostro tampone di lavaggio, che è solo un XPBS. Ancora una volta, vogliamo assicurarci che la parte superiore del dispositivo sia sposata e poi rimuoveremo la punta dell'ago contenente il sangue o più correre. Inizia a innescare il dispositivo.

Andremo a formare goccioline, le inseriamo nel dispositivo e premiamo il pulsante per tamponare il sangue all'ingresso o all'uscita del tubo e lo lasceremo fluire per cinque minuti dopo la fase di lavaggio. Ancora una volta, fermeremo la pompa a siringa e rimuoveremo la siringa dal supporto della pompa. Per eseguire il mantenimento standard del GIM, per prima cosa fisseremo le cellule e le disidrateremo utilizzando il 100% di metanolo.

Quindi noi, abbiamo una siringa, una siringa da tre mil precaricata con metanolo. Ancora una volta, adescheremo la siringa, ci assicureremo che il metanolo scorra, fermeremo la pompa a siringa, la inseriremo nel dispositivo e premeremo Esegui. Li fisseremo in questa soluzione di metanolo per due o quattro minuti.

Quindi, dopo due o quattro minuti di fissaggio e metanolo, fermiamo la pompa, rilasciamo la siringa con metanolo, e qui andremo a caricare una siringa, tre siringhe da mil contenenti eem sustain standard eem sustain di Sigma diluite da uno a cinque in acqua deionizzata. Dopo aver diluito, abbiamo caricato nella siringa e all'estremità della siringa abbiamo attaccato un filtro da 0,8 micron per filtrare tutte le particelle che entreranno, che finirebbero per intasare il dispositivo. La macchia per cinque-10 minuti.

E poi ci sciacquieremo con l'acqua di Deion i. Quindi, dopo 5-10 minuti di colorazione, fermeremo la pompa a siringa e sostituiremo la siringa con il tampone di colorazione con la siringa che contiene acqua deionizzata, in pratica laveremo fino a quando non vedremo che il colore blu del SAI è stato lavato dal dispositivo. Una volta che il supporto in eccesso è stato risciacquato dal dispositivo, interrompiamo la soluzione di lavaggio.

E poi quello che faremo è rimuovere la siringa dell'acqua dall'ingresso. Quindi prenderemo il tubo di uscita del dispositivo. Afferreremo quel tubo alla fine con le nostre pinzette.

Questo è un tubo tigon flessibile e lo reinseriremo nell'ingresso del dispositivo. Questo sigilla il dispositivo e mantiene le cellule idratate e la loro morfologia intatta. Ora il mio collega, il Dr. John Hong Chang, mostrerà un protocollo alternativo per l'isolamento dei linfociti positivi alla CD quattro, seguito dalla colorazione immunofluorescente direttamente all'interno del dispositivo microfluidico.

Quindi il mio nome è Shong Hong e oggi vi dimostrerò la colorazione delle cellule in un dispositivo microfluidico in questa fase e posso già mostrarvi come utilizzare un dispositivo di isolamento di immunoaffinità micro flic per isolare in modo specifico le cellule del sangue da sangue intero senza precedenti. Per il suo scopo, vuole pidacciare le cellule e ottenere il contenuto di proteine e DNA da quelle cellule isolate. Beh, ai fini della mia ricerca, sono interessato a ottenere le cellule e poi ottenere la conta cellulare, per esempio, per ottenere la conta di quattro cellule CD dal sangue intero e, e usarla come indicatore per scopi diagnostici.

Quindi il dispositivo che utilizza è molto simile al dispositivo di Ken. È realizzato in camera diritta P-D-M-S-A. La geometria è leggermente diversa, quindi i parametri di funzionamento sono leggermente diversi mentre, in generale, la procedura operativa complessiva è molto simile.

Quindi salterò tutte le fasi di cattura e risciacquo delle cellule e passerò direttamente alla fase di colorazione delle cellule nelle procedure di conteggio delle cellule. Quindi qui ho un dispositivo che è già composto da mezze cellule catturate dal sangue intero e il dispositivo è già risciacquato con PBS. Quindi le cellule in uscita sono già state lavate via dal dispositivo e ho preparato in anticipo una miscela di anticorpi che viene utilizzata specificamente per etichettare le cellule e che vengono isolate nel dispositivo.

Quindi la concentrazione di anticorpi che abbiamo usato qui è stata ottimizzata per colorare le cellule con un'intensità fluorescente molto elevata al microscopio a fluorescenza. Quindi la procedura è abbastanza semplice. Carichiamo la siringa riempita con la soluzione anticorpale sulla pompa a siringa e poi ci assicuriamo che la portata sia impostata sui parametri corretti di cui abbiamo bisogno.

E poi avvieremo la pompa a siringa, osserveremo l'estremità del tubo, ci assicureremo che la soluzione esca già in modo che non ci siano più bolle nel tubo. E poi possiamo collegare il tubo al dispositivo microfluidico che abbiamo catturato le cellule. Quindi ora l'anticorpo sta fluendo nel dispositivo per colorare le cellule che abbiamo isolato nel, nel dispositivo, la velocità di flusso qui, sto usando cinque microlitri al minuto, ma a seconda della geometria del dispositivo, potrebbero esserci diversi parametri di flusso che si desidera utilizzare per il proprio scopo.

E lapperemo il flusso della soluzione anticorpale per cinque minuti, che è sufficiente per un volume sufficiente a sostituire tutta la soluzione all'interno del canale micropho. Quindi, dopo l'iniezione di anticorpi, interromperemo il flusso. Quindi, facciamo galleggiare l'anticorpo a cinque microlitri al minuto per cinque minuti per sostituire tutta la soluzione all'interno del microcanale.

Successivamente interrompiamo il flusso e lasciamo che il dispositivo incubi e lo temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi questo dovrebbe essere fatto al buio in modo che l'anticorpo non venga spento mentre le cellule, gli anticorpi fluorescenti possono essere spenti mentre le cellule sono incubate con un anticorpo colorante. Quindi, dopo aver colorato per 15-30 minuti, scollegheremo semplicemente il tubo dal dispositivo e sostituiremo la siringa anticorpale con una siringa tampone per lavare via l'anticorpo non legato dal dispositivo.

Quindi la soluzione di lavaggio qui contiene l'1% di BSA in soluzione PBS. La BSA viene utilizzata per bloccare il non legame degli anticorpi sulla superficie e noi faremo la stessa cosa. Quindi, per prima cosa, regoliamo la portata della pompa a siringa per assicurarci che sia la portata giusta che volevamo, quindi avviamo la pompa a siringa e ci assicuriamo che ci sia effettivamente del liquido che fuoriesce dal tubo prima di collegarlo al dispositivo.

Lo scopo di farlo è che non rimangono bolle come avanzi nel tubo. Quindi, quando iniettiamo, nessuna bolla entra nel nostro dispositivo. Quindi basta collegare il tubo al dispositivo e lasciarlo scorrere per altri cinque minuti per sostituire tutto il lavaggio, tutti gli anticorpi non legati dal dispositivo.

Dopo la fase di lavaggio, fisseremo le celle con l'1% di PFA. Lo scopo di farlo è che il dispositivo possa essere conservato per alcune settimane fino a poche settimane se l'imaging può essere eseguito immediatamente. Quindi la procedura è abbastanza semplice.

È simile a quello che abbiamo fatto prima. Carichiamo la siringa sulla pompa, regoliamo la portata su quella che vogliamo, quindi avviamo la pompa a siringa e colleghiamo il tubo al nostro dispositivo per iniettare la soluzione IDE paraforma, che è il fissativo nel nostro dispositivo per fissare le cellule. Anche in questo caso, lo lasciamo scorrere per circa cinque minuti.

Quindi il PFA sostituisce tutto il buffer nel dispositivo per fissare tutte le celle nel dispositivo. Quindi, dopo la fase di fissaggio del PFA, togliamo semplicemente la siringa di PFA e ora il dispositivo è pronto per l'imaging. In alcuni casi, le persone vogliono avere una colorazione del nucleo da mostrare da sovrapporre alla colorazione del marcatore della superficie cellulare.

Quindi, a tale scopo, eseguirò la colorazione del nucleo utilizzando DPI alla fine. Quindi carichiamo semplicemente la siringa DPI all'accensione, accendiamo la pompa a siringa e fluiamo DPI nel nostro dispositivo. Quindi ora il nucleo sarà colorato in quelle cellule per mostrare la posizione delle cellule.

E questo, l'immagine di colorazione DPI può essere successivamente sovrapposta alla colorazione del marcatore di superficie per mostrare dove si trovano le cellule. Quindi, alla fine della colorazione DPI, dobbiamo nuovamente lavare via la banda L DPI P con una soluzione tampone. Quindi, ancora una volta, stiamo usando PBS contenente l'1% di BSA per lavare via il dpi in uscita.

E l'operazione è simile a quella che abbiamo fatto prima. Inseriamo semplicemente la siringa tampone nel nostro dispositivo e lasceremo che il tampone fluisca nel dispositivo per lavare via il dap non legato. Quindi questa è l'intera procedura di colorazione delle cellule nel dispositivo a microfluido.

E dopo tutte le procedure di colorazione, i dispositivi sono pronti per l'imaging. E poiché abbiamo eseguito il fissaggio PFA, i dispositivi possono anche essere conservati per alcune settimane. Se non è stato possibile eseguire immediatamente l'imaging delle immagini.