Esecuzione personalizzati Esperimenti di Microarray MicroRNA

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire un esperimento di microarray di micro RNA. Ciò si ottiene acquistando prima vetrini microarray stampati che contengono una libreria di sonde di micro RNA e preparando campioni di RNA con qualità e quantità adeguate. Successivamente, l'RNA e il campione di DNA controllato A vengono etichettati con coloranti fluorescenti.

Quindi gli acidi nucleici marcati vengono aggiunti a un vetrino di microarray per l'ibridazione. Infine, il vetrino del microarray viene lavato e scansionato e il vetrino viene rigenerato. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano l'espressione dei microRNA nell'intero genoma attraverso l'analisi del vetrino per le intensità di ibridazione delle singole sonde di micro RNA.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'espressione genica, come ad esempio come le condizioni fisiologiche normali o le condizioni differenziali patologiche influenzano l'espressione micro esigenze su scala globale. La qualità della fabbricazione di microarray è uno dei fattori più critici per il successo di un esperimento di microarray. Dopo aver isolato l'RNA utilizzando un metodo che preserva piccoli RNA e sospendendolo a una concentrazione uguale o superiore a due milligrammi per millilitro, etichettare l'RNA in un volume di reazione di 20 microlitri mescolando prima circa 25 microgrammi di RNA totale con 0,5 microgrammi di cinque prime P-C-U-D-Y 5 4 7 3 prime in un tampone X HEPs integrato con T quattro RNA Ligasi 1D TT, e un TP. Se è disponibile meno RNA, ridurre la quantità di RNA e la reazione.

Se l'RNA è molto diluito, aggiungere un vettore come il lievito, il TRNA per aiutare con la precipitazione, incubare la reazione sul ghiaccio all'interno di un frigorifero per due o 24 ore. Quindi, aggiungere acetato di sodio a 0,3 molare, quindi tre volumi di etanolo e precipitare l'RNA durante la notte a meno 20 gradi Celsius. Per utilizzare i vetrini per la prima volta, pre-ibridarli in una soluzione filtrata di tre XSSC, 0,1% SDS e 0,2% BSA per 30-60 minuti a 37 gradi Celsius.

Quindi, immergi gli scivoli in acqua alcune volte. Quindi, in isopropanolo, asciugare i vetrini utilizzando una centrifuga con un adattatore per vetrini a 100 volte G per cinque minuti a 22 gradi Celsius. Sciacquare le strisce di sollevamento in acqua.

Quindi, in etanolo prima di essiccare all'aria, posizionare un vetrino all'interno di una base della camera di ibridazione microarray e una slitta di sollevamento sulla parte superiore del vetrino in modo che la slitta di sollevamento copra l'area della sonda e le sue strisce bianche. Toccare il vetrino al buio, far girare l'RNA marcato precipitato, lavarlo una volta con etanolo al 70% e asciugare il pellet all'aria. Il pellet dovrebbe essere di colore rossastro.

Preparare una soluzione di ibridazione utilizzando da un 15° a un 100° del volume del DNA di riferimento marcato purificato per campione di RNA Sciogliere completamente il pellet di RNA con circa 60 microlitri della soluzione di ibridazione per assicurarsi che la soluzione di ibridazione non si asciughi. Durante l'incubazione, aggiungere 20 microlitri di acqua a ciascuno dei pozzetti umidificatori. Nella base della camera di ibridazione microarray.

Aggiungere una miscela di RNA marcato e DNA di riferimento al vetrino. Utilizzando una punta sottile per pipetta, toccare delicatamente il bordo del carrello di sollevamento e attraverso l'aspirazione. Lasciare che la soluzione entri nello spazio tra il carrello di sollevamento e lo scivolo.

Posizionare il coperchio della camera di ibridazione sulla base. Quindi sigillare la camera con clip metalliche. Metti l'intera camera all'interno del sacchetto di plastica fornito con la cassetta della camera.

Infine, posizionare la cassetta della camera all'interno di un contenitore con un tovagliolo di carta bagnato. Quindi coprire il contenitore con pellicola trasparente e posizionarlo all'interno di un incubatore per colture cellulari umido a 37 gradi Celsius per circa 24 ore. Per elaborare i vetrini dopo l'ibridazione, smontare le cassette della camera una per una, immergere un vetrino e il suo sollevatore scivolare in due XSSC a 22 gradi Celsius.

Lo scivolo del sollevatore cadrà naturalmente dallo scivolo, laverà gli scivoli in 0,8 XSSC due volte, poi tre volte in 0,4 XSSC per un totale di uno o due minuti. Asciugare i vetrini utilizzando una centrifuga con un adattatore per vetrini. Quindi, scansiona i vetrini con uno scanner a microarray e utilizza un programma come blue fuse per quantificare le intensità nei file di immagine.

Ispezionare i singoli punti per escludere i punti anomali che di solito derivano dalla stampa dei vetrini dei pori o dalla manipolazione dei vetrini Dopo l'ibridazione. Per l'analisi e la presentazione dei dati, utilizzare programmi come gene springing ed excel per riutilizzare il microarray. Sverniciare il vetrino sciacquandolo in acqua, quindi immergendolo in una lastra colorante di preriscaldare un millimolare di NAOH e 0,1 XSSC a 62 gradi Celsius per 10-20 minuti.

Ripetere l'incubazione una seconda volta. Lavare più volte gli scivoli in acqua per un massimo di 60 minuti agitando delicatamente a 22 gradi Celsius. Asciugare i vetrini con una centrifuga e conservare a 22 gradi Celsius.

Le guide possono essere utilizzate senza pre-ibridazione. Questa figura mostra un'immagine scansionata di un microarray che dimostra segnali di ibridazione molto precisi e forti. Le macchie rosse sono il risultato dell'ibridazione delle macchie verdi del DNA di riferimento dal campione di RNA marcato DY 5 47 e le macchie gialle sono state ottenute dall'ibridazione del DNA e dell'RNA alle stesse sonde.

I coefficienti di correlazione di Pearson tra le repliche tecniche dell'ibridazione di microarray sono di circa 0,99, indicando un'eccellente riproducibilità. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un esperimento personalizzato sui microraggi, non solo per quantificare la micronasi, ma anche per quantificare altri tipi di acido nucleico come gli mRNA.