Qual è la principale applicazione di questo protocollo?

Il protocollo viene utilizzato per analizzare i cambiamenti nell'espressione proteica relativi al ciclo cellulare.

Come influenza il trattamento con microRNA i livelli proteici?

Il trattamento con microRNA può alterare significativamente l'espressione delle proteine coinvolte nel ciclo cellulare.

Quali sono i passaggi chiave nella preparazione del microarray?

I passaggi chiave includono la biotinilazione delle proteine, il blocco dello slide e l'incubazione con buffer di rilevamento.

Perché il blocco è importante in questo protocollo?

Il blocco previene il legame non specifico degli anticorpi, garantendo risultati accurati.

Quale tecnologia viene utilizzata per analizzare il microarray?

Un microscopio per microarray viene utilizzato per rilevare i segnali fluorescenti dalle proteine legate.

Come vengono quantificati i risultati?

I risultati sono quantificati in base all'intensità dei segnali fluorescenti rilevati dallo scanner.

Microarray di anticorpi: una tecnica per studiare l'espressione proteica delle cellule di cancro del polmone trattate con miRNA

JoVE Encyclopedia of Experiments

Cancer Research

0 views • 3:02 min • April 30th, 2023

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- Inizia aggiungendo una soluzione di biotina e un tampone di marcatura al campione proteico. Incubare per facilitare l'adesione della biotina alle proteine. Aggiungere un reagente di arresto e un vortice. Quindi, posizionare un vetrino per microarray di anticorpi in un piatto contenente un reagente bloccante per prevenire il legame non specifico degli anticorpi. Lavare il vetrino con acqua distillata doppia per rimuovere la soluzione bloccante. Posizionare il vetrino del microarray in una camera. Mescolare il campione di proteina biotinilata con una soluzione di accoppiamento e aggiungerlo al vetrino per facilitare il legame delle proteine bersaglio agli anticorpi corrispondenti. Trasferire il vetrino in una piastra contenente un tampone di lavaggio e sostituirlo con acqua distillata doppia. Successivamente, posizionare il vetrino in un tampone di rilevamento contenente streptavidina marcata in fluorescenza per promuoverne il legame con le proteine biotinilate.

Incubare la capsula al buio per mantenere l'intensità della fluorescenza. Rimuovere il vetrino e inserirlo in uno scanner per microarray. Lo scanner cerca segnali fluorescenti dalla streptavidina legata alla proteina bersaglio. Sulla base dell'intensità della fluorescenza, il software analizza l'entità dell'espressione proteica. Nel seguente protocollo, eseguiamo un microarray di anticorpi per analizzare le alterazioni dell'espressione genica associate al ciclo cellulare.

- Questo esperimento ha lo scopo di identificare tutti i cambiamenti di espressione delle proteine del ciclo cellulare mediante il trattamento con microRNA. Raccogliere campioni di proteine secondo la procedura descritta nella sezione sulla trasfezione e quantificare con il dosaggio dei BCA. Rimuovere i vetrini da meno 4 gradi Celsius un'ora prima dell'esperimento per portarli a temperatura ambiente e rimuovere l'umidità. Prelevare 70 microgrammi di campioni di proteine e preparare i vetrini dei campioni secondo le istruzioni del produttore, descritte anche passo dopo passo nella sezione di testo.

Da notare che un corretto lavaggio dei vetrini con acqua deionizzata ultrapura è un altro passo importante in quanto ciò contribuirà a ridurre lo sfondo dei vetrini. Inoltre, in questo esperimento è molto importante non asciugare i vetrini del campione fino alla fase finale. Infine, scansiona il vetrino utilizzando la macchina per microarray e analizza i dati.