Name: Mappatura eterogeneità di espressione delle proteine nei tumori mediante immunofluorescenza quantitativa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Scopri la mappatura dell'eterogeneità dell'espressione proteica nei tumori mediante immunofluorescenza quantitativa e analisi delle immagini. Questo metodo migliora lo sviluppo di biomarcatori clinici.

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal finanziamento scozzese Consiglio (Grant Numero HR07005; <a href="http://www.sfc.ac.uk/">http://www.sfc.ac.uk/</a> ), Medical Research Scozia ( <a href="http://www.medicalresearchscotland.org.uk/">http://www.medicalresearchscotland.org.uk/</a> ), il Cancro Research UK Cancer Centro di Medicina Sperimentale ( <a href="http://www.cancerresearchuk.org/">http://www.cancerresearchuk.org/</a> ), e Breakthrough Breast Cancer ( <a href="http://breakthrough.org.uk/">http://breakthrough.org.uk/</a> ).

1. Preparazione del tessuto <ol class="lalpha"><li> Microtomia <ol class="lroman"><li> Sezione paraffina fissato in formalina incorporato sezioni tumorali a 4 micron di spessore utilizzando un microtomo rotativo. </li><li> Posizionare le sezioni sulla carica positiva preparati microscopici. </li><li> Incubare i vetrini in un forno a 37 ° C durante la notte. </li></ol></li><li> Conservazione <ol><li> Sezioni Conservare in un -18 ° C a -25 ° C congelatore, al fine di prevenire la perdita di antigenicità. </li></ol></li></ol> 2. Immunofluorescenza di sezioni di tessuto <ol class="lalpha"><li> Deceratura e reidratazione <ol class="lroman"><li> Sparaffinatura diapositive in xilene due volte per 5 min. </li><li> Reidratare diapositive nel 99%, 99%, 80%, 50% di etanolo e acqua corrente per 2 minuti di ciascuno in ordine. </li></ol></li><li> Antigen Retrieval <ol class="lroman"><li> Eseguire la smascheramento dell'antigene di calore, utilizzando citrato di sodio 0,15 mM pH 6.0, buffer in una pentola a pressione per 5 minuti in microwave. </li><li> Raffreddare i vetrini per 20 min. </li><li> Sciacquare i vetrini in PBST 0,05% per 5 minuti sulla sedia a dondolo. </li></ol></li><li> Blocco procedura <ol class="lroman"><li> Trattare le sezioni in perossido di idrogeno al 3% per 10 min. </li><li> Sciacquare i vetrini in PBST 0,05% per 5 minuti sulla sedia a dondolo. </li><li> Aggiungere le sezioni a cremagliera immunocolorazione Sequenza. </li><li> Trattare le sezioni in blocco siero proteine ​​gratuito per 10 min. </li></ol></li><li> Anticorpi incubazione primaria <ol class="lroman"><li> Anticorpi incubare primario diluito diluizione ottimale nel diluente dell'anticorpo Dako per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare a 0,05% PBST tre volte per 5 minuti ciascuno. </li></ol></li><li> Epiteliali maschera (Citocheratina) di incubazione <ol class="lroman"><li> Incubare topo anti-pan citocheratina, diluito 1:50 nel diluente dell'anticorpo Dako notte a 4 ° C. </li></ol></li><li> Maschera di visualizzazione epiteliali <ol class="lroman"><li> Preparare una diluizione 1:25 di capra anti-topo Alexa555 santicorpi econdary nel pre-diluito Immaginate capra-coniglio HRP soluzione di anticorpi. Incubare i vetrini al buio per 1,5 ore a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare a 0,05% PBST tre volte per 5 minuti ciascuno. </li></ol></li><li> Obiettivo di visualizzazione <ol class="lroman"><li> Trasferire le diapositive dalla Sequenza alla camera di umidità. </li><li> Combina segnale diluente target di amplificazione (HistoRx vasca E) e il Cy5 Tyramide (F tubo HistoRx) a 1:50 concentrazione. Vortice di mescolare accuratamente. Incubare i vetrini al buio per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare a 0,05% PBST tre volte per 5 minuti ciascuno. </li><li> Disidratare vetrini in etanolo 80% per 1 min. </li><li> Lasciare asciugare al buio. </li></ol></li><li> Controcolorazione e montavetrini <ol class="lroman"><li> Applicare medio DAPI montaggio sul coprioggetto e posizionare il coprioggetto sopra le sezioni di tessuto. </li><li> Diapositive asciugare per una notte al buio. </li><li> Dopo le diapositive sono asciugati, sicuro con smalto di enche la conservazione a lungo termine e conservare in frigorifero 4 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Acquisizione delle immagini mediante scansione intera sezione <ol class="lalpha"><li> Caricare fino a cinque diapositive nel cassetto della diapositiva Aperio ScanScope scanner FL. </li><li> Per ogni diapositiva, selezionare l'area generale di immagine utilizzando l'interfaccia della console ScanScope. Selezionare la regione fino a comprendere tutto il tessuto della diapositiva, a prescindere dalla colorazione modello o altri aspetti osservabili del campione. </li><li> Utilizzando la console di ScanScope, per ogni canale (DAPI, Cy3 e Cy5) determinano una esposizione ottimale come segue: <ol class="lroman"><li> Seleziona una regione di tessuto per interrogare - questo settore dovrebbe, idealmente, essere nella regione del tumore del tessuto per fornire la migliore rappresentazione. </li><li> Utilizzando la funzione ScanScope esposizione automatica Console, valutare il tempo di esposizione suggerito per ogni canale, con messa a fuoco dell'immagine. </li><li> Ripetere più fino a 3-5 regioni di ciascun campione di confirm stabilità del valore. </li></ol></li><li> Seleziona una regione addizionale (come mostrato da un diamante blu sulla immagine della console ScanScope) lontano dal tessuto, ma ancora all'interno della regione coprioggetto della diapositiva, per definire un'area pianeggiante immagini di sfondo in cui la correzione di campo saranno acquisite per ogni filtro. </li><li> Recensione queste immagini prima dell'acquisizione delle immagini. Se le immagini sembrano avere elevato background o artefatti altra immagine, la regione immagine deve essere spostata e nuove immagini acquisite. </li><li> Le immagini acquisite diapositive digitali vengono caricati automaticamente nel database Spectrum Aperio. </li></ol> 4. AQUA analisi delle immagini automatico <ol class="lalpha"><li> Visualizzare le immagini digitali scivolare tutto nel database Spectrum e annotare le aree tumorali di interesse nel contesto di tutto il tessuto e pattern di colorazione (s). </li><li> Selezionare la diapositiva da analizzare utilizzando AQUAnalysis dalla lista diapositive digitali nella banca dati Spectrum facendo doppio clic sul pollicechiodo immagine (in alternativa, selezionare la casella di controllo accanto l'immagine e poi selezionare 'Visualizza immagini' dal menu in cima alla lista). Si aprirà automaticamente il software ImageScope e immagini a colori fusi del campione di tessuto. </li><li> Utilizzare questo software per navigare l'immagine utilizzando gli strumenti forniti. </li><li> Utilizzando la accompagna H &amp; E (sia la diapositiva fisico o un'immagine commentata), annotare la regione di interesse sull'immagine fluorescente. Più regioni di interesse, singoli cerchiato aree, possono essere selezionati su un singolo campione. Vi è anche uno strumento di 'negativo' che viene utilizzato per escludere le aree all'interno di una regione selezionata (cioè il tessuto danneggiato, le aree di scarsa istologia, non tumorali aree, detriti, ecc.) </li><li> Salva lo strato annotazione (s) sull'immagine. </li><li> Tornare al menu principale spettro e selezionare la casella di controllo accanto all'immagine che è stato appena annotato. Selezionare 'Analizzare' dalla barra dei menu nella parte superiore della lista. </li><li> Nella finestra di analisi che verrà su, Select "HistoRx AQUA Analisi" dal menu a tendina. </li><li> Se ci sono più livelli di annotazioni, utilizzare le caselle di controllo per selezionare il livello appropriato (s) per l'analisi. </li><li> Premere il pulsante 'Analizza' quando è pronto per iniziare. </li><li> A questo punto, una finestra di console minimizzata apparirà nella barra delle applicazioni di Windows. Questo mostrerà l'avanzamento del trasferimento delle immagini dal database Spectrum al PC locale (l'operazione 'tirare'). </li><li> Una volta che i dati vengono trasferiti, AQUAnalysis lancerà. L'utente può quindi utilizzare tutte le funzioni interne del software per visualizzare, esplorare e analizzare le immagini. </li><li> La regione annotato delle immagini dal database spettro è suddiviso in piastrelle di immagine 512x512 pixel - ognuno dei quali saranno segnati singolarmente. </li><li> Per questo studio, un algoritmo non supervisionato punteggio AQUA, sulla base di clustering dei dati, è stato utilizzato 8. In questo algoritmo, i punteggi AQUA sono generate come segue: <ol class="lroman"><li> Il pan-citocheratina immagine SIgnal è thresholded sopra di fondo e quei pixel sono usati per definire una 'maschera' del tumore, che viene poi utilizzato per i calcoli successivi. L'alta espressione pan-citocheratina pixel definiscono anche le regioni citoplasmatiche / non-nucleare delle cellule tumorali. </li><li> Pixel con segnale alto nel canale DAPI che si trovano all'interno della maschera di tumore sono identificati come nucleare in natura. </li><li> L'algoritmo di clustering, inoltre, esamina i pixel che sono a bassa intensità sia per colorazione DAPI o espressione di citocheratina e tenta di attribuire a loro parzialmente o compartimenti nucleari o citoplasmatici, o lo sfondo. </li><li> Una volta che tutti i pixel sono assegnati ad uno dei comparti tumore o di fondo, l'intensità del segnale proveniente dalla proteina bersaglio (ER o HER2) viene quindi calcolata all'interno di ciascuno dei comparti e normalizzato alle dimensioni dei vani, producendo così i punteggi AQUA. </li><li> Immagini che non hanno una rappresentanza sufficiente tumore non sono stati segnati (come definito da chi ha less del 5% dei pixel che rappresentano tumore). Queste regioni, inoltre, produrre il valore di un 'risultato finale' chiamato 'Fail' e può quindi essere rimosso nelle successive analisi statistiche. </li><li> Inoltre, se a seguito di riesame, un operatore identificato i campi che non erano adatti per il punteggio a causa di campione o artefatti di imaging (es. tessuto ripiegato, detriti), questi campi sono stati redatti da segnare e ha prodotto un 'Final Result' chiamato 'Fail'. </li></ol></li><li> I risultati di punteggio AQUA sono le tabelle dei punteggi associati a ogni piastrella 512x512 pixel nella regione di interesse all'interno di un intero campione sezione di tessuto. Questi file, in formato. CSV, può quindi essere utilizzata per la successiva analisi statistica. </li></ol> 5. Analisi Statistica: Tutte le analisi statistiche vengono effettuate in SPSS (IBM) <ol><li> Ove possibile, per le operazioni di grandi dimensioni, generare file di codice della sintassi SPSS (. Sps) per eseguire manipolazioni di dati e fasi di analisi. Sintassi del codice di esempio viene fornito come file supplementari. </li><li leggi i file di dati in spss. rimuovere le variabili non utilizzate nei grezzi esempio parametri dello strumento specifico punteggi aqua da utilizzati compartimenti><li> In cui le regioni hanno un 'Risultato Finale' di 'Fail' (vedi sopra), segno di questi valori come SYSMIS, che li toglie dalle analisi numeriche. </li><li> Aggregare tutti i dati per tutte le diapositive per ogni marcatore (ER o HER2) in un singolo set di dati master in formato SPSS. Utilizzare questo file master per tutti i calcoli successivi. </li><li> L'utilizzo di un file di sintassi SPSS (uno per ogni marcatore: ER o HER2 (vedi file di sintassi supplementare) i dati sono stati ulteriormente validati e Simpson Indici di diversità calcolato come segue: <ol class="lroman"><li> Generare un file analitico maestro, al fine di impedire la modifica dei dati di base impostata precedentemente generato. </li><li> Validare i dati anagrafici insieme contro i dati grezzi e le immagini generate. </li><li> Produrre statistiche di riepilogo per i punteggi AQUA per ogni campione (numero di campi, media punteggio, punteggio mediano, minimum punteggio, punteggio massimo, e la deviazione standard dei punteggi per il campione). </li><li> Controllare un campione casuale di risultati con l'originale prime file di output dei dati e contro i dati di immagine grezzi segnato. </li></ol></li><li> Per generare le immagini mappa di calore (indicato nelle figure 2 e 3): <ol class="lroman"><li> 'Bin' i dati di punteggio AQUA (utilizzando la funzione 'Categorizzazione visiva' in SPSS) in otto livelli di individuali. Per ER, i punteggi nucleare sono stati utilizzati, per HER2, i punteggi citoplasmatici sono stati utilizzati. </li><li> Derive cassonetti in modo che ogni bin rappresenta una percentuale uguale di casi disponibili presso l'intero set di dati. </li><li> Usare 'Split File' la funzione di SPSS in modo che tutto l'output successivo sarebbe a livello di un 'campione per vetrino /'. </li><li> Plot ogni regione (corrispondente a una piastrella 512x512) per la sua x, y coordinate e colore con un valore corrispondente al raccoglitore in cui è stato allocato (vedi figure 2 e 3). </li></ol></li><li> Per generare punteggi eterogeneità, il codice è stato scritto per generare un Simpsonindice di diversità usando i punteggi AQUA. <ol class="lroman"><li> L'indice di Simpson della diversità, come qui utilizzato, è definito come: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/3334/3334eq1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equazione 1"> Dove N è il numero totale dei punteggi / campi utilizzati per un determinato campione e n è il numero di punteggi / campi in un dato gruppo di punteggi standardizzati (prodotto come descritto di seguito). </li></ol></li><li> Utilizzare il file master di analisi descritto sopra per la sorgente dati. Negli esempi mostrati, tutti i calcoli ER utilizzato il punteggio nucleare, AQUA e HER2 calcoli utilizzati il ​​punteggio citoplasmatica AQUA. Eseguire i calcoli che seguono per ogni campione / diapositive. </li><li> Poiché i dati di fluorescenza è soggetta a instabilità della varianza, in modo tale che grandezza errore si propaga con intensità, applicare logaritmica (base 2) normalizzazione di tutti i punteggi AQUA. </li><li> Ulteriori trasformare il normalizzato (log trasformato) dati in z-(standard) punteggi. <ol class="lroman"><li> Lo Z-score trasformazione è calcolato uns segue: Z = (punteggio AQUA - media di tutti i punteggi per un campione) / deviazione standard dei punteggi per il campione. Questo si traduce la distribuzione dei punteggi in una distribuzione di deviazioni attorno al valore centrale della deviazione zero. </li></ol></li><li> Bin queste Z-score i valori in sei gruppi (&lt;-2, -2 - -1, -1 - 0, 0 - 1, 1 - 2,&gt; 2). </li><li> Calcolare il numero dei valori assegnati in ogni bin e somma per ogni bin. Utilizzare questo valore, insieme al numero totale di campi, di calcolare un valore per ciascuna delle sei cassonetti utilizzati per l'indice. </li><li> Somma di questi valori e sottrarre da uno a produrre l'indice di diversità. </li><li> L'indice di diversità fornisce un indicatore della diffusione dei punteggi intorno alla media di un campione particolare. Così, gli indici più elevati indicano una diffusione più ampia dei punteggi, o maggiore eterogeneità di espressione. Al contrario, gli indici più bassi, indicano una minore variazione nella misurazione di espressione e di espressione omogenea nel campione. Questo è illustrato nella FigurES 2 e 3. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Terapia mirata con farmaci tossicità relativamente bassa, come il tamoxifene e trastuzumab, non sono standard di cura per i pazienti con tumore ovarico. Ci sono buone evidenze che il platino, taxani chemioterapia di prima linea è superiore ad altri regimi di chemioterapia per il cancro ovarico 9-13, e mentre il 70-80% dei pazienti risponde inizialmente, la maggior parte delle ricadute e muoiono della loro malattia. Misura di biomarcatori che potrebbero predire la risposta alle terapie alternative sarebbero utili nella scelta di una terapia individualizzata per ogni paziente, e poiché la pressione chemioterapia selezione esercita su un tumore, sopravvivono cellule tumorali può possedere caratteristiche diverse e rappresentano una sottopopolazione del tumore prima della terapia; quantificare questo cambiamento potrebbe quindi essere utile. Abbiamo applicato il nostro metodo di associazione eterogeneità di espressione di ER e HER2 in campioni di cancro ovarico, prima e dopo la chemioterapia, in Order per misurare le variazioni quantitative di espressione, e valutare la relazione tra biomarker espressione prima e dopo la terapia. Sia ER e HER2 dimostrare marcata eterogeneità all'interno del tumore individuale e, in alcuni tumori, le variazioni dell'indice di Simpson dopo la terapia di eterogeneità relativamente alto di eterogeneità bassa, rappresentata dalla diminuzione Simpson punteggi indice (vedi figure 2 e 3). Ciò supporta la nozione che la selezione clonale si verifica in risposta alla chemioterapia citotossica, ancora più importante, questo può essere sfruttata utilizzando terapia mirata contro la popolazione residua, al fine di meglio personalizzare la terapia per i pazienti oncologici. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Microfotografie ematossilina e eosina macchiato di diverse aree del cancro alle ovaie stesse mostrando morfologia variabile. (A) x40 microfotografia mostra due aree adiacenti di tumore con diversi morfologia. Viste ad alta potenza (x200) rivelano cellule con citoplasma di compensazione e un modello solido di crescita nella parte superiore del tumore (B), mentre la parte inferiore del tessuto (C) è più omogeneo citoplasma eosinofilo e un modello di crescita papillare. Questo tumore, tuttavia, essere classificato come sottotipo sieroso papillifero istologico ai fini di una gestione ulteriore. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Heatmaps L'eterogeneità di espressione proteica in citocheratina ER-positivi tessuto ovarico cancro, prima (pannello superiore) e dopo (pannello inferiore) la terapia. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Heatmaps L'eterogeneità di espressione della proteina HER2-positivo in citocheratina tessuto ovarico cancro, prima (pannello superiore) e dopo (pannello inferiore) la terapia.

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</ol>

JC, MG, CJ e CS sono dipendenti di HistoRx, Inc.

Il metodo descritto qui di quantificazione permette di eterogeneità molecolare in standard fissati in formalina, incluse in paraffina, sezioni istologiche di materiale tumorale. Il metodo permette un valore da assegnare al grado di eterogeneità in una sezione di tessuto, in modo che questa possa poi essere preso in considerazione come una variabile nello sviluppo di biomarker e analisi. Mentre in generale è preferibile che i biomarcatori del tessuto sono omogenei rispetto a espressione, in modo che il saggio è meno soggetto a errori di campionamento o pregiudizi, potrebbe in alcune circostanze essere utile per quantificare l&#39;eterogeneità come parametro. Per esempio, come mostrato nell&#39;esempio illustrativo per ER e HER2, biomarcatori comuni mostrano una notevole eterogeneità di espressione ed è attualmente noto se questo rappresenta un fattore prognostico indipendente predittivo o riguardo al risultato clinico o la risposta alla terapia, rispettivamente. Allo stesso modo, come illustrato, la terapia si potrebbe modificare dinamicamente lapopolazioni costituente delle cellule, e quindi la misura di arricchimento obiettivo potrebbe essere utile nel guidare le decisioni terapeutiche. Tuttavia, la tecnica è limitata dagli stessi fattori che limitano la tradizionale analisi istopatologica o biomarker (come la immunoistochimica). Il risultato dipende dal tipo, dimensione e qualità del tessuto in fase di analisi, e quindi una sezione di tessuto unico non può essere rappresentativo l&#39;intero tumore. Infatti, l&#39;indice di Simpson può essere indebitamente influenzati dalla dimensione del tessuto (numero di fotogrammi catturati e punteggi AQUA misurato). L&#39;immunogenicità del epitopi misurato può essere soggetto a incontrollabili pre-analitica artifactually fattori che alterano la loro espressione attraverso la sezione di tessuto (come il tempo di ischemia fredda, o la lunghezza di fissazione, e artefatto bordo). Ciò è particolarmente un problema per fosfo-epitopi, che sono notoriamente labili 14, 15. Pertanto la tecnica potrebbe essere più adattoagli esemplari resezione piuttosto che piccole biopsie, ed eseguito su più sezioni piuttosto che uno solo. In ultima analisi, tecniche di imaging 3D può offrire l&#39;opportunità di quantificare meglio questo parametro. La tecnica come presentato può anche essere limitata da fattori biologici, come la variabilità nella espressione della citocheratina epitopo mascheramento. Questo potrebbe essere di particolare preoccupazione in quei tumori, tra cui il cancro al seno e alle ovaie, che subiscono epiteliali a mesenchimali transizione (EMT) o sono arricchiti per i non-epiteliali componenti o le cellule staminali 16, come è stato recentemente dimostrato che si verificano in chemioterapia trattamento del cancro ovarico in vitro 17, e nei pazienti con carcinoma mammario in risposta alla terapia 18. Questa limitazione può essere superata utilizzando anticorpi mascheramento alternativi (o un cocktail di anticorpi), come citocheratina più vimentina, che è upregulated in EMT 16. Inoltre, poiché gli altri componenti del tessuto (il microfonoroenvironment), come fibroblasti o cellule endoteliali vascolari sono sempre più presi di mira da terapie biologiche, la tecnica può anche essere ampliato per segnare questi componenti, utilizzando maschere specifiche per i comparti di interesse, come PECAM / CD31 a macchia di cellule endoteliali vascolari . Anche se l&#39;adattamento dell&#39;indice della Simpson è stata utilizzata come misura di eterogeneità nel protocollo attuale grazie alla sua semplicità, altre misure di eterogeneità potrebbero essere utilizzati, come ad esempio semplici misure di tendenza centrale (media, varianza, mediana, ecc.) Inoltre, la Simpson calcoli dell&#39;indice potrebbe essere modificato per adattarsi meglio una particolare popolazione di prova. L&#39;uso di Z-score trasformazioni permette il punteggio di essere più applicabile per i marcatori multipli in quanto l&#39;eterogeneità si basa sulla deviazione intorno alla media di un insieme di dati. Tuttavia, la gamma complessiva di punteggio può essere limitato in questo tipo di trasformazione. Alcuni progetti potrebbero essere più adattisemplicemente bin i punteggi AQUA reale per tutti i campioni di un insieme particolare marcatore. La scelta del numero di cassonetti e di tagli è anche una limitazione nella gamma di valori che può provocare e può essere ottimizzato per l&#39;alternativa disegni sperimentali. Abbiamo usato ER e HER2 in questo studio come biomarcatori candidato, dal momento che sono già utilizzati in clinica, aiutare a rispondere a quesiti clinici rilevanti rispetto alla efficacia delle terapie mirate, e sono noti per esibire notevole eterogeneità e il cambiamento nella scuola primaria e distanti malattia 19. Tuttavia, l&#39;indicatore ottimale di eterogeneità Resta da stabilire. Altre possibilità possono includere i marcatori di clonalità citogenetica, come quelli già utilizzati negli studi PESCE interfase 20. L&#39;approccio richiede la convalida ulteriormente in grandi coorti ben annotato cliniche o studi clinici al fine di stabilire ulteriormente la rilevanza di questo parametro nella biologia del cancro.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> ScanScope FL </td><td> Aperio </td><td> ScanScope FL </td><td> Usato come corredato da fornitore </td></tr><tr><td> Spettro </td><td> Aperio </td><td> Spettro </td><td> Valori di configurazione e catalogo variano su come le istituzioni locali a creare il proprio database e struttura IT. </td></tr><tr><td> AQUAnalysis, in collaborazione con AQUAjustment </td><td> HistoRx </td><td> V2.3 </td><td> Il pacchetto AQUAjustment AQUAnalysis permette di utilizzare le immagini memorizzate in Spectrum. </td></tr><tr><td> HER2 </td><td> Dako </td><td> A0485 </td><td> 1 su 400 di diluizione </td></tr><tr><td> topo anti-pan citocheratina </td><td> Dako </td><td> M3515 </td><td> 1 su 50 di diluizione </td></tr><tr><td> Anticorpi diluente </td><td> Dako </td&gt; <td> S0809 </td><td></td></tr><tr><td> Immaginate capra-coniglio HRP </td><td> Dako </td><td> K4003 </td><td></td></tr><tr><td> Proteine ​​blocco </td><td> Dako </td><td> X0909 </td><td></td></tr><tr><td> Capra anti-topo Alexa555 </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI montaggio medio </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td> Cy5 Tyramide </td><td> HistoRx </td><td> AQ-EMR1-00001 </td><td></td></tr><tr><td> Sequenza immunocolorazione Centro </td><td> Thermo Scientific Shandon </td><td> 73300001 </td><td> Usato qui per banco immunofluorescenza </td></tr></tbody></table>

mappatura eterogeneità di espressione delle proteine ​​nei tumori mediante immunofluorescenza quantitativa

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Eterogeneità morfologica all&#39;interno di un singolo tumore è ben riconosciuta da istopatologi nella pratica chirurgica. Anche se questo spesso assume la forma di aree di differenziazione riconosciuti distinte in sottotipi istologici, o differente grado patologico, spesso ci sono differenze più sottili nel fenotipo che sfidano classificazione accurata (Figura 1). In definitiva, poiché la morfologia è dettata dal fenotipo molecolare alla base, aree con differenze visibili sono suscettibili di essere accompagnata da differenze nell&#39;espressione delle proteine ​​che orchestrano le funzioni cellulari e di comportamento, e quindi, l&#39;aspetto. Il significato del visibile e invisibile (molecolare) eterogeneità per la prognosi non è nota, ma studi recenti dimostrano che, almeno a livello genetico, l&#39;eterogeneità esistente nel 1,2 tumore primario, e alcuni di questi sub-cloni dar luogo a metastasi ( e quindi letale) della malattia. Inoltre, alcune proteine ​​sonomisurata come biomarcatori perché sono gli obiettivi della terapia (ad esempio ER e HER2 per tamoxifene e trastuzumab (Herceptin), rispettivamente). Se queste proteine ​​mostrano espressione variabile all&#39;interno di un tumore poi risposte terapeutiche può essere anche variabile. Gli schemi ampiamente utilizzato punteggio istopatologici per immunoistochimica o ignorano, o numericamente omogeneizzare la quantificazione di espressione della proteina. Allo stesso modo, nelle tecniche distruttive, dove vengono omogeneizzati i campioni tumorali (come ad esempio profili di espressione genica), informazioni quantitative possono essere chiarito, ma le informazioni spaziali è perduto. Eterogeneità genetica approcci mappatura nel cancro del pancreas hanno fatto affidamento sia sulla generazione di una sospensione singola cella 3 o il 4 macrodissection. Un recente studio ha utilizzato punti quantici per mappare l&#39;eterogeneità morfologica e molecolare nel tessuto cancro alla prostata 5, fornendo prova di principio che la mappatura morfologica e molecolare è fattibile, ma cadendo short di quantificare l&#39;eterogeneità. Dal immunoistochimica è, nella migliore delle ipotesi, solo semi-quantitative e soggetti a bias intra-ed inter-osservatore, più sensibili e metodologie quantitative sono necessarie per mappare con precisione e quantificare l&#39;eterogeneità dei tessuti in situ. Abbiamo sviluppato e applicato una metodologia sperimentale e statistico per quantificare sistematicamente l&#39;eterogeneità di espressione della proteina in sezioni di tessuto di tumori tutto, sulla base dell&#39;analisi automatica quantitativa (AQUA) del sistema 6. Sezioni di tessuto sono etichettati con anticorpi specifici diretti contro citocheratine e gli obiettivi di interesse, accoppiato al fluoroforo marcati con anticorpi secondari. Le diapositive vengono esposte con un tutto-slide scanner fluorescenza. Le immagini sono suddivise in centinaia di migliaia di piastrelle, ed ogni tessera viene quindi assegnato un punteggio AQUA, che è una misura della concentrazione di proteine ​​all&#39;interno del epiteliale (tumore), componente del tessuto. Heatmaps sono generati per rappresentare l&#39;espressione delle proteine ​​dei tessuti e eterogeneità assegnato un punteggio, utilizzando una misura statistica di eterogeneità originariamente utilizzato in ecologia, in base indice di biodiversità del Simpson 7. Ad oggi non ci sono stati tentativi di mappare sistematicamente e quantificare questa variabilità in tandem con l&#39;espressione della proteina, in preparati istologici. Qui illustriamo il primo utilizzo del metodo applicato per ER e HER2 espressione biomarcatori nel carcinoma ovarico. Usando questo metodo apre la strada per analizzare l&#39;eterogeneità come variabile indipendente negli studi di espressione dei biomarcatori negli studi traslazionali, al fine di stabilire il significato di eterogeneità nella prognosi e la previsione di risposte alla terapia.

Qui si descrive un metodo per quantificare l&#39;eterogeneità molecolare in sezioni istologiche di materiale tumorale mediante immunofluorescenza quantitativa, analisi di immagine, e una misura statistica di eterogeneità. Il metodo è destinato ad essere utilizzato nello sviluppo di biomarker clinici e analisi.

Mappatura eterogeneità di espressione delle proteine ​​nei tumori mediante immunofluorescenza quantitativa

L'eterogeneità morfologica all'interno di un singolo tumore è ampiamente riconosciuta dagli istopatologi nella pratica chirurgica. Sebbene ciò si presenti spesso sotto forma di...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quantificare con precisione l'espressione di biomarcatori su sezioni intere di tessuto tumorale umano, al fine di assegnare un valore numerico al grado di eterogeneità nell'espressione proteica. Questo risultato si ottiene innanzitutto scansionando sezioni di tessuto tumorale marcate con immunofluorescenza mediante un lettore fluorescente per intere diapositive. Successivamente, vengono selezionate le regioni di interesse all'interno del tumore per la valutazione.Successivamente, l'espressione della proteina di interesse all'interno delle aree tumorali invasive viene quantificata utilizzando il sistema automatizzato di analisi delle immagini aqua analysis. In definitiva, questo metodo può essere impiegato per mappare l'espressione dei biomarcatori nel tessuto tumorale, che spesso risulta molto eterogeneo lungo la sezione del tessuto. Il vantaggio principale dell'utilizzo di queste tecniche rispetto ai metodi tradizionali, come l'immunohistochimica con reagenti colorimetrici e di visualizzazione metrica, è che l'immunofluorescenza è più quantitativa e più sensibile.Accoppiando questi metodi analitici a una scansione su sezione intera mediante immunofluorescenza, è possibile ottenere una mappatura dettagliata delle variazioni sottili nell'espressione dei biomarcatori nei tessuti. Per la prima volta, la dimostrazione di queste procedure è affidata a Mark Gustafson, direttore operativo diretto del laboratorio Histo RX. Dopo il taglio al microtomo di un campione bioptico di tessuto tumorale e la colorazione immunofluorescente del campione per rilevare l'espressione dei biomarcatori di interesse, caricare fino a cinque vetrini con le sezioni colorate nella cassetta portavetrini dello scanner.Quindi, utilizzando l'interfaccia della console dello scan scope. Per ogni vetrino, selezionare una regione che comprenda tutti i tessuti presenti sul vetrino, indipendentemente dal pattern di colorazione o da altri aspetti osservabili del campione. Successivamente, utilizzando la console dello scan scope, selezionare innanzitutto una regione di tessuto da valutare, idealmente all'interno della zona tumorale del tessuto, per ottenere la rappresentazione migliore possibile.Ora, utilizzando la funzione di esposizione automatica della console dello scan scope, determinare il tempo di esposizione per ogni canale insieme al fuoco dell'immagine; utilizzare il diamante blu nell'immagine della console dello scan scope per selezionare un'area aggiuntiva lontana dal tessuto, ma comunque all'interno della regione del vetrino sotto il coprioggetto, al fine di definire l'area di fondo dove verranno acquisite le immagini per la correzione del campo piatto. Per ciascun filtro, aggiungere punti di messa a fuoco nell'area del tessuto rappresentata dai quadrati gialli per ottimizzare l'acquisizione delle immagini. Se le immagini presentano un fondo elevato o altri artefatti, la regione dell'immagine deve essere spostata e nuove immagini devono essere acquisite.Il tessuto viene quindi scansionato e le immagini digitali degli strisci acquisite vengono automaticamente caricate nel database Aperio Spectrum. Fare doppio clic sull'immagine in miniatura affinché il programma Spectrum selezioni lo striscio da analizzare dall'elenco degli strisci digitali presenti nel database Spectrum. Successivamente, utilizzando l'immagine annotata con h e D, annotare l'area di interesse sull'immagine fluorescente.È possibile selezionare più aree di interesse delimitate con cerchi singoli su un singolo campione. Le immagini annotate vengono salvate automaticamente nel database degli spettri. A questo punto, quando appare la finestra di analisi, selezionare Analyze dalla barra del menu nella parte superiore dello schermo e quindi scegliere l'analisi histo RX aqua dal menu a discesa.Quando si è pronti per iniziare, premere il pulsante di analisi. Nella barra delle applicazioni di Windows apparirà una finestra della console ridotta a icona che mostra l'avanzamento del trasferimento delle immagini dal database Spectrum al computer locale. Una volta trasferiti i dati, verrà avviata l'analisi aqua per generare un punteggio aqua mediante un algoritmo di scoring aqua non supervisionato, basato sul clustering dei dati di una prima soglia del campione, ovvero il segnale dell'immagine della pan-citocheratina superiore al segnale di fondo dell'immagine. Questo permetterà di utilizzare i pixel per definire una maschera tumorale che potrà poi essere impiegata per calcoli successivi.Utilizzare i pixel ad alta espressione di pan-citokeratina per definire anche le regioni citoplasmatiche o non nucleari delle cellule tumorali. Come mostrato qui, i pixel con un segnale elevato nel canale DPI che si trovano all'interno della maschera tumorale vengono identificati come di natura nucleare. Se durante il controllo vengono individuati campi non adatti alla valutazione a causa di artefatti del campione o dell'immagine, tali campi vengono esclusi dalla valutazione e produrranno anche un risultato finale di fallimento.I risultati della valutazione aqua sono rappresentati come una tabella di punteggi associati a ciascuna porzione di 512 per 512 pixel nella regione di interesse all'interno di un campione completo di sezione tessutale, che può essere salvata e utilizzata per analisi statistiche successive. Queste microfotografie colorate con ematossilina ed eosina dimostrano come diverse aree dello stesso carcinoma ovarico possano presentare una morfologia variabile. L'ingrandimento riportato in alto a destra nella Figura B evidenzia cellule con chiarificazione citoplasmatica e un modello di crescita solido nella parte superiore del tumore.La parte inferiore del tessuto ingrandita nella sezione in basso a destra della Figura C, tuttavia, presenta un citoplasma eosinofilo più omogeneo e un pattern di crescita papillare. Qui, le mappe termiche dell'espressione di ER in una sezione di tessuto di cancro ovarico prima e dopo un trattamento chemioterapico sono mostrate rispettivamente nei pannelli superiore e inferiore. Si noti il passaggio da un'espressione variabile di ER lungo la sezione, con aree di espressione sia alta che bassa nella figura superiore, a una distribuzione uniforme di alta espressione di ER illustrata in rosso nella figura inferiore.La rappresentazione numerica di questo cambiamento è indicata a sinistra dalla diminuzione dell'indice di Simpson. In questa figura vengono mostrate nuovamente le mappe termiche di eterogeneità di HER2 in una sezione di tessuto di cancro ovarico prima e dopo la terapia, come visibile rispettivamente nei pannelli superiore e inferiore. Si noti nuovamente il passaggio da un'espressione variabile di HER2 lungo la sezione, con aree di espressione sia alta che bassa nella figura superiore, a una distribuzione uniforme di alta espressione di HER2 nella figura inferiore.Anche in questo caso, si osserva una diminuzione dell'indice di Simpson. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che la qualità dei dati generati dall'analisi computazionale è pari alla qualità della colorazione, la quale deve rispettare un elevato standard tecnico.

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Questo video dimostra una tecnica di imaging multispettrale a fluorescenza in situ per analizzare diverse sottopopolazioni di cellule T infiltranti nel tessuto tumorale. Una criosezione tissutale di carcinoma a cellule renali viene trattata con anticorpi per marcare le cellule T CD8+ che esprimono specifici recettori inibitori e mostrano un fenotipo resistente all'immunoterapia. La sezione marcata viene visualizzata utilizzando un microscopio multispettrale per identificare le distinte...

Imaging a immunofluorescenza multiplexato per analizzare sottopopolazioni di cellule T resistenti all'immunoterapia

L'immunoistochimica è una potente tecnica di laboratorio per valutare la localizzazione e l'espressione delle proteine all'interno dei tessuti. Gli attuali metodi semi-automatici per la quantificazione introducono soggettività e spesso creano risultati irriproducibili. In questo articolo, descriviamo i metodi per l'immunoistochimica multiplexata e la quantificazione oggettiva dell'espressione proteica e della co-localizzazione mediante imaging multispettrale.

La quantificazione di espressione della proteina e co-localizzazione Usando multiplex immunoistochimica di colorazione e multispettrale Imaging

Studiando il microambiente tumorale può identificare biomarcatori prognostici o predittivi della risposta clinica all'immunoterapia. Presentato qui, è un metodo innovativo basato su in situ di fluorescenza multispectral imaging per analizzare e contare automaticamente varie sottopopolazioni di CD8+ T cellule. Questa tecnica riproducibile ed affidabile è adatta per analisi di grande gruppo.

Multiplexed immunofluorescenza analisi e quantificazione di Intratumoral PD-1+ + Tim-3 CD8+ T cellule

Distribuzione eterogenea delle cellule HER2-positive può essere osservato in un sottogruppo di tumori al seno e genera dilemmi clinici. Qui, presentiamo un protocollo affidabile ed economico per definire, quantificare e confrontare eterogeneità genetica intra-tumore di HER2 in un'ampia serie di cancri al seno eterogeneo trasformati.

Costruire una piattaforma di High-throughput Screening per valutare l'eterogeneità dell'amplificazione del Gene HER2 nei cancri al seno

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Pannello di immunofluorescenza Multiplex automatizzato per gli studi di Immuno-oncologia su campioni di tessuto in formalina Carcinoma

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