Mappatura eterogeneità di espressione delle proteine ​​nei tumori mediante immunofluorescenza quantitativa

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di quantificare accuratamente l'espressione di biomarcatori in intere sezioni di tessuto di cancro umano al fine di assegnare un valore numerico al grado di eterogeneità nell'espressione proteica. Ciò si ottiene scansionando prima sezioni di tessuto tumorale marcate in immunofluorescenza utilizzando uno scanner fluorescente per vetrini interi. Le successive regioni di interesse all'interno del tumore vengono selezionate per la valutazione.

Successivamente viene quantificata l'espressione della proteina di interesse all'interno delle aree tumorali invasive utilizzando il sistema automatizzato di analisi delle immagini aqua analysis. In definitiva, questo metodo può essere utilizzato per mappare l'espressione di biomarcatori nel tessuto tumorale, che è spesso molto eterogeneo in tutta la sezione del tessuto. Il vantaggio principale dell'utilizzo di queste tecniche rispetto ai metodi tradizionali come l'immunoistochimica che utilizza reagenti di visualizzazione metrica e a colori è che l'immunofluorescenza è più quantitativa e più sensibile.

Accoppiando questi metodi analitici con un'intera sezione, la scansione in immunofluorescenza consente una mappatura a grana fine di sottili variazioni nell'espressione dei biomarcatori nei tessuti. Per la prima volta, a dimostrare queste procedure è Mark Gustafson, direttore diretto delle operazioni presso il laboratorio Histo RX. Dopo il microtomo, il sezionamento di una biopsia tissutale tumorale e la colorazione immunofluorescente del campione per l'espressione dei biomarcatori di interesse, caricare fino a cinque vetrini delle sezioni colorate nella cassetta dei vetrini dello scanner per vetrini.

Quindi utilizzando l'interfaccia nella console dell'ambito di scansione. Per ogni vetrino, selezionare una regione che includa tutto il tessuto sul vetrino, indipendentemente dal modello di colorazione o da altri aspetti osservabili del campione. Successivamente, utilizzando la console dell'oscilloscopio di scansione, selezionare innanzitutto una regione di tessuto da valutare idealmente all'interno della regione tumorale del tessuto per fornire la migliore rappresentazione.

Ora utilizzando la funzione di esposizione automatica della console dell'oscilloscopio di scansione, determinare il tempo di esposizione per ciascun canale insieme alla messa a fuoco dell'immagine, utilizzare il diamante blu sull'immagine della console dell'oscilloscopio di scansione per selezionare una regione aggiuntiva lontana dal tessuto, ma ancora all'interno della regione del vetrino sotto il vetrino coprioggetto per definire l'area di sfondo in cui verranno acquisite le immagini di correzione del campo piatto. Per ogni filtro, aggiungere punti di messa a fuoco all'area del tessuto rappresentata da quadrati gialli per ottimizzare l'acquisizione dell'immagine. Se le immagini sembrano avere uno sfondo elevato o altri artefatti dell'immagine, l'area dell'immagine deve essere spostata e le nuove immagini acquisite.

Il tessuto viene quindi scansionato e le immagini digitali dei vetrini acquisite vengono caricate automaticamente nel database Aperio Spectrum. Fare doppio clic sull'immagine in miniatura del programma dello spettro per selezionare il vetrino da analizzare dall'elenco dei vetrini digitali nel database dello spettro. Quindi, utilizzando l'immagine annotata h e D di accompagnamento, annotare la regione di interesse sull'immagine fluorescente.

Su un singolo campione è possibile selezionare più regioni di interesse delineate con singoli cerchi. Le immagini annotate vengono salvate automaticamente nel database dello spettro. Ora seleziona Analizza dalla barra dei menu nella parte superiore dello schermo quando viene visualizzata la finestra di analisi, seleziona histo RX aqua analysis dal menu a discesa.

Quando sei pronto per iniziare, premi il pulsante di analisi, nella barra delle applicazioni di Windows apparirà una finestra della console ridotta a icona che mostra l'avanzamento del trasferimento delle immagini dal database Spectrum al computer locale. Una volta che i dati sono stati trasferiti, l'analisi dell'acqua verrà avviata per generare un punteggio dell'acqua utilizzando un algoritmo di punteggio dell'acqua non supervisionato basato sul clustering dei dati di una prima soglia del campione, il segnale dell'immagine della pan citocheratina sopra il segnale dell'immagine di fondo. Ciò consentirà l'uso dei pixel per definire una maschera tumorale che può poi essere utilizzata per i calcoli successivi.

Usa i pixel di pan citocheratina ad alta espressione per definire anche le regioni citoplasmatiche o non nucleari delle cellule tumorali. Come si vede qui, i pixel con un segnale elevato nel canale DPI che si trovano all'interno della maschera tumorale sono identificati come di natura nucleare. Se al momento della revisione vengono identificati campi che non erano adatti per il punteggio a causa di campioni o artefatti di imaging, tali campi vengono esclusi dal punteggio e produrranno anche un risultato finale di errore.

I risultati dell'aqua scoring sono rappresentati come una tabella di punteggi associati a ciascuna piastrella di 512 x 512 pixel nella regione di interesse all'interno di un intero campione di sezione di tessuto, che può essere salvata e utilizzata per successive analisi statistiche. Queste micrografie fotografiche colorate con ematoe ed ein dimostrano come diverse aree dello stesso carcinoma ovarico possano presentare una morfologia variabile. La vista ad alta potenza in alto a destra della Figura B evidenzia le cellule con pulizia citoplasmatica e un solido modello di crescita nella parte superiore del tumore.

La parte inferiore del tessuto ingrandita nella sezione in basso a destra della Figura C, tuttavia, ha un citoplasma eosinofilo più omogeneo e un pattern di crescita papillare. Qui, le mappe di eterogeneità dell'espressione di ER in una sezione di tessuto del carcinoma ovarico prima e dopo un trattamento chemioterapico sono mostrate rispettivamente nei pannelli superiore e inferiore. Si noti il passaggio dall'espressione variabile dell'ER nella sezione con regioni di espressione sia alta che bassa nella figura superiore a una distribuzione uniforme dell'espressione dell'ER alta illustrata in rosso nella figura inferiore.

La rappresentazione numerica di questo cambiamento è indicata a sinistra dalla diminuzione dell'indice dei Simpson. In questa figura vengono mostrate nuovamente le mappe di calore eterogenee di HER two in una sezione tissutale di carcinoma ovarico, come si vede rispettivamente nei pannelli superiore e inferiore. Si noti ancora una volta, il cambiamento dalla variabile HER two expression in tutta la sezione con regioni di espressione sia alta che bassa nella figura superiore a una distribuzione uniforme dell'alta espressione HER two nella figura inferiore.

Ancora una volta, l'indice dei Simpson è visto diminuire. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la qualità dei dati generati dall'analisi computazionale è buona solo quanto la qualità della colorazione, e questo deve essere di alto livello tecnico.