Name: Visualizzazione di Caenorhabditis Elegans Strutture cuticola Utilizzando il Dye lipofili Vital, Dii (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Scopri come visualizzare la cuticola di Caenorhabditis elegans utilizzando il colorante lipofilo DiI. Questo metodo semplice e rapido permette di osservare strutture alae e anulari con microscopia a fluorescenza.

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Ringraziamo S. Taneja-Bageshwar, K. Beifuss, S. Kedroske, e HC. Hsiao per le discussioni utili. Questo lavoro è stato finanziato da fondi di start-up del Dipartimento TAMHSC di Medicina Molecolare e Cellulare. L&#39;ambito complesso e disco rotante sono stati acquistati con i fondi messi a disposizione dal Dipartimento e l&#39;Ufficio TAMHSC del Decano. Alcuni ceppi sono stati forniti dalla genetica Caenorhabditis Center, che è finanziato dal National Center for Research Resources. pRF4 (rol-6 (su1006)) era un dono del Fuoco A..

1. Preparazione del Dii macchia <ol><li> Preparare una soluzione madre di 20 mg / mL DII (Biotium, Inc., Hayward, CA) in DMF. DII è sensibile alla luce, in modo da proteggere i Dii dalla luce, avvolgendo in un foglio. </li><li> Creare una diluizione di lavoro di Dii con l'aggiunta di 0,6 microlitri magazzino DII a 399,4 microlitri M9 per ogni popolazione. Questo dovrebbe dare una diluizione finale di lavoro di 30 mcg / ml Dii a M9. Questo può essere scalata per la colorazione popolazioni contemporaneamente. Dii scudo dalla luce, avvolgendo il tubo (s) in un foglio. </li></ol> 2. Preparazione dei nematodi <ol><li> Utilizzare una piastra di 60 millimetri che contiene una popolazione di nematodi incontaminata. Lavare gli animali da lastra con una soluzione di 0,5% Triton X-100 nel buffer M9 rimestando delicatamente liquido in un movimento circolare sulla superficie della piastra per sciogliere tutti gli animali larvali e adulti. Trasferimento lavaggio in un tubo sterile 1,5 ml. </li><li> Immediatamente spin down gli animali a 2000 rpm per 30 sec. Rimuovere e gettare il più supernatant possibile senza disturbare la massa di animali sul fondo della provetta. </li><li> Per ridurre il residuo Triton X-100, lavare gli animali utilizzando M9 tampone, rotazione, e rimuovere il surnatante. Ripetere questa operazione una sola volta. </li><li> Aggiungere 400 ml di soluzione di lavoro DII in M9 al tubo e mescolare brevemente nel vortex per sospendere di nuovo gli animali nella soluzione. </li><li> Agitare tubo a 20 ° C in orizzontale per 3 ore a 350 giri al minuto in una luce-ambiente protetto. Se lo si desidera, gli animali possono essere incubate fino a 16 ore per la colorazione. </li><li> Per ridurre la quantità di colorante, spin down gli animali a 2000 rpm per 20 sec. Rimuovere ed eliminare il più possibile surnatante senza disturbare la massa degli animali. </li><li> Animali risospendere in 400 microlitri di buffer M9 e versare il liquido su una porzione priva di batteri di una piastra di agar NGM seminato con OP50 E. coli. Consentire agli animali di recuperare almeno 30 minuti. Durante il tempo di recupero gli animali devono strisciare via dal liquido colorazione DII e sul cibo. Questo passoriduce la fluorescenza di fondo da DII libero. </li></ol> 3. Montaggio e osservando i campioni <ol><li> Sciogliete il 4% agar-agar in acqua con autoclave o un forno a microonde. </li><li> Crea distanziali riutilizzabili, che può essere utilizzato per garantire spessore uniforme del pad agar, con stratificazione due pezzi di nastro di laboratorio su un vetrino. Fai due diapositive distanziatore totale. </li><li> Organizzare un vetrino pulito di vetro tra due diapositive distanziatore. Pipettare circa 150 microlitri (quattro gocce) di agar fuso 4% sul centro del vetrino pulito. Rapidamente coprire l'agar fuso con un ulteriore scivolo di formare un pad agar. Rimuovere con cautela il vetrino di copertura, mantenendo il pad centrato sulla parte superiore della slitta di montaggio. </li><li> Pipettare circa 5 ml di anestetico nematode (100 mM - 1 levamisolo mM, per esempio) sul pad. </li><li> Monte 8-12 animali in anestesia e coprire con un coprioggetto microscopio. </li><li> Osservare gli animali usando un microscopio confocale o dotati di almeno un obietti 40x ve e un DsRed / TRITC (o compatibili) del filtro. La massima eccitazione di fluorescenza di DII è 549 nm e il suo massimo di emissione è 565 nm per il colorante legato (Biotium, Inc., Hayward, CA). </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Macchie Dii la cuticola del wild-type e mutanti C. elegans. La superficie cuticolare contiene annuli separate da solchi circonferenziali e, in alcuni stadi, creste longitudinali chiamati ali. Ogni fase di sviluppo ha strutture cuticolare con composizioni diverse 2. Creste o solchi dei due alae e annuli macchia fluorescente, a seconda della composizione della superficie, in tutta stadi larvali e adulte e rimangono visibili fino ad un giorno dopo il recupero con questo metodo. Macchioline di fondo fluorescente sono a volte osservati (figure 2F, G), ma non di routine (Figura 1, Figura 2A-E, H, I). Tutte le immagini sono state scattate con disco rotante o confocale, quando nota, widefield (wf) microscopio composto. ENT "&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3362/3362fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. DII macchie cuticola e neuroni ambientalmente esposti. L2 stadio animale. Ingrandimento 630x. Parti dell'immagine mosaico sono stati catturati utilizzando ANNULLAMENTO-Mac software (Tecnologie BioVision, Exton, PA). Le immagini sono state unite con Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems, Inc., San Jose, CA). Barra di scala = 10 micron. DII anche fluorescente macchie amphid e fasmide neuroni sensoriali della testa e la coda rispettivamente (frecce indicano alcuni). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3362/3362fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Dii macchie fluorescenti C. cuticola elegans in tutte le fasi della post-embrionale di sviluppo. Ingrandimento 630x. Barra di scala = 10 micron. La colorazione di tipo selvaggio animali in A) L1; B) L2; C) dauer; D) L3; E) L4, e F) Ciclo di adulto. Le dorsali ali e anulare sono macchiati fluorescente negli animali L1 e dauer (A, C). Dii macchie dorsali anulare negli animali L2(B). Anulare solchi macchia di L3 e L4 animali (D, E). I solchi delle ali e annuli sono macchiati negli animali adulti (FH). Ali sono composti da due, cinque, o tre creste (in L1, dauer o animali adulti, rispettivamente) che corrono la lunghezza dell'animale (frecce) 16. Annuli creare creste circonferenziale intorno all'animale (punte di freccia, F e J). La cuticola di adulti animali mutanti visualizzare moderati difetti organizzazione cuticolare (GH). G) Creste di alae sono discontinui (wf). H) creste ali soprannumerari sono fusi e ramificati o biforcato (wf). Mutanti del gene del collagene presentano ali e difetti dell'organizzazione anulare (J). I) In animali transgenici sovraesprimono pRF4 (rol-6 (su1006)), creste di alae giacciono in un angolo della lunghezza dell'animale. J) Annuli in animali transgenici iperespressione pRF4 (rol-6 (su1006)) mostra un pattern irregolare. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3362/3362fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. ExternAl strutture morfologiche sono illuminati dalla colorazione DII. ingrandimento 630x. Barre di scala = 10 micron. Dii evidenzia anche altre caratteristiche esterne, tra cui A) adulti ermafroditi vulva, B) raggi coda maschio adulto e la ventola, e C) ermafrodita punta della coda (biforcuta in questo contesto mutante). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3362/3362fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Cuticola Figura 4. Richiede più tempo per macchiare con DII di neuroni ambientalmente esposti. Ingrandimento 630x. Barra di scala = 10 micron. Dopo due ore di colorazione, amphid (non mostrato) e fasmide neuroni sensoriali (frecce) sono abbastanza colorati. Al contrario, la cuticola dei giovani animali è solo parzialmente macchiato in patch (punta di freccia). <table border="1"><tbody><tr><td> Lavare </td><td> Soluzione di macchia (+ DII) </td><td> Tempo di incubazione </td><td> Cuticola macchiato </td></tr><tr><td> M9 + 0,5% TrIton X-100 </td><td> M9 + 0,5% Triton X-100 </td><td> 2 ore </td><td> no </td></tr><tr><td> M9 + 0,5% Triton X-100 </td><td> M9 + 0,5% Triton X-100 </td><td> 3 ore </td><td> no </td></tr><tr><td> M9 + 0,5% Triton X-100 </td><td> M9 </td><td> 2 ore </td><td> parziale </td></tr><tr><td> M9 + 0,5% Triton X-100 </td><td> M9 </td><td> 3 ore </td><td> sì </td></tr><tr><td> M9 + 0,5% Triton X-100 </td><td> H 2 0 </td><td> 2 ore </td><td> parziale </td></tr><tr><td> M9 + 0,5% Triton X-100 </td><td> H 2 0 </td><td> 3 ore </td><td> sì </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Colorazione cuticolare in condizioni diverse. Soluzioni diverse e tempi di incubazione sono stati testati per ottimizzare la colorazione cuticolare negli animali. H 2 0, acqua distillata sterile. Colorazione parziale indica colorazione irregolare della cuticola larvale (Figura 4), anche se le macchie cuticola adulti consistently.

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<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Il metodo di colorazione DII qui presentata permette un modo relativamente veloce e conveniente per visualizzare la cuticola in C. elegans. Da riproporre e ottimizzare un metodo comunemente usato per l&#39;immagine dell&#39;ambiente neuroni sensoriali esposti 15,17, DII può essere usato per macchiare fluorescente sia ali e le strutture anulare (Figure 1 e 2), così come la vulva, la coda di sesso maschile e ermafrodita coda picco (Figura 3). Abbiamo trovato che la soluzione di incubazione e l&#39;infl...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenti </td><td> Sinonimi </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Dii </td><td> 1,1 &#39;-Dioctadecyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perclorato </td><td> Biotium, Inc. </td><td> 60010 </td><td> Magazzino di diluizione: 20 mg / mL in DMF diluizione di lavoro: 30 mg / mL </td></tr><tr><td> DMF </td><td> Dimetilformammide </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> D4551 </td><td></td></tr><tr><td> Tritone X-100 </td><td> Octylphenoxypolyethoxyethanol </td><td> VWR International, LLC. </td><td> EM-9410 </td><td></td></tr><tr><td> M9 </td><td> 22mm KH 2 PO 4, 42mm Na 2 HPO 4, 86 mm di NaCl, 1 mM MgSO 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NGM &lt;/ Td&gt; <td> Nematode crescita medio </td><td> IPM Scientific, Inc. </td><td> 11006-501 </td><td> Può essere preparato seguendo il protocollo NGM agar 18 </td></tr><tr><td> Agar-agar </td><td></td><td> EMD Chemicals, Inc. </td><td> 1,01614 </td><td> 4% in acqua </td></tr><tr><td> Levamisolo </td><td> Levamisolo cloridrato </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> 31742 </td><td> 100 mM - 1 levamisolo mM come richiesto </td></tr><tr><td> Microscopio diapositive </td><td></td><td> VWR International, LLC. </td><td> 16005-106 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio copertura occhiali </td><td></td><td> VWR International, LLC. </td><td> 16004-302 </td><td></td></tr><tr><td> Composto portata </td><td></td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td> A1M </td><td> Utilizzare gli obiettivi per soddisfare le esigenze della sperimentazione </td></tr><tr><td> TRITC o altri filtro compatibile </td><td> &amp;nbsp; </td><td> Chroma Technology Corp. </td><td> 49005 </td><td> ET - DsRed (TRITC/Cy3) atomizzate set di filtri </td></tr></tbody></table>

visualizzazione di caenorhabditis elegans strutture cuticola utilizzando il dye lipofili vital, dii

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

La cuticola di C. elegans è una struttura molto resistente che circonda l&#39;esterno dell&#39;animale 1-4. La cuticola non solo protegge l&#39;animale dall&#39;ambiente, ma determina anche la forma del corpo e svolge un ruolo nella motilità 4-6. Diversi strati secreto dalle cellule epidermiche comprendono la cuticola, tra cui una strato lipidico esterno 7. Creste circonferenziale nella cuticola chiamato modello annuli la lunghezza dell&#39;animale e sono presenti in tutte le fasi di sviluppo 8. Ali sono creste longitudinali che sono presenti durante le fasi specifiche di sviluppo, tra cui L1, dauer, e le fasi adulti 2,9. Le mutazioni nei geni che influenzano l&#39;organizzazione cuticolare collagene possono alterare la struttura cuticolare e morfologia del corpo animale 5,6,10,11. Mentre l&#39;imaging cuticolare usando la microscopia composto con ottica DIC è possibile, gli attuali metodi che mettono in risalto le strutture cuticolare comprendono fluorescenticento transgene espressione 12, colorazione anticorpale 13, e la microscopia elettronica 1. Etichettati germe di grano agglutinina (WGA) è stato utilizzato anche per visualizzare glicoproteine ​​cuticolare, ma è limitato nella risoluzione dei più fini strutture cuticolare 14. La colorazione della superficie cuticolare con colorante fluorescente è stato osservato, ma mai caratterizzato in dettaglio 15. Vi presentiamo un metodo per visualizzare in vivo cuticola C. elegans con il colorante rosso fluorescente lipofile DII (1,1 &#39;-dioctadecyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perclorato), che è comunemente usato in C. elegans per visualizzare l&#39;ambiente neuroni esposti. Questo protocollo ottimizzato per la colorazione DII è un metodo semplice e robusto per la visualizzazione ad alta risoluzione fluorescenti di annuli, alae, vulva, coda di sesso maschile e ermafrodita coda picco di C. elegans.

Vi presentiamo un metodo per visualizzare in vivo cuticola<em&gt; C. elegans</em&gt; Con il colorante rosso fluorescente lipofile DII (1,1 &#39;-dioctadecyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perclorato), che viene comunemente usato in<em&gt; C. elegans</em&gt; Per visualizzare l&#39;ambiente neuroni esposti. Con questo protocollo ottimizzato, le strutture e le ali anulare cuticolare sono macchiati da DII e osservate al microscopio composto.

Visualizzazione di Caenorhabditis Elegans Strutture cuticola Utilizzando il Dye lipofili Vital, Dii

La cuticola di C. elegans è una struttura altamente resistente che avvolge l'esterno dell'animale1-4. La cuticola non solo protegge l'animale da...

L'obiettivo generale di questo procedimento è visualizzare l'esoscheletro nei nematodi marini trasparenti e vivi utilizzando il colorante lipofilico fluorescente rosso dye eye. Questo viene ottenuto preparando una popolazione di nematodi per la colorazione. Successivamente, il colorante dye eye viene aggiunto in forma diluita alla popolazione e lasciato incubare.Successivamente, gli animali vengono recuperati dalla soluzione di colorazione. L'immagine di fluorescenza del tegumento colorato con Dai mostra dettagli sulla superficie, inclusi le strutture riproduttive oculari di Ailey e Ann e altre caratteristiche morfologiche esterne. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti per la visualizzazione del tegumento in questo organismo trasparente, come l'imaging diretto, la fluorescenza, l'espressione di transgeni, la colorazione con anticorpi, la microscopia elettronica e il germe di grano marcato con agglutinina, è che questa tecnica è facile da eseguire, relativamente rapida ed economica, e fornisce un'ottima risoluzione delle strutture cuticole in animali vivi.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali in molti settori che utilizzano il sistema modello *C. elegans* e il suo tegumento, come la secrezione cellulare e l'organizzazione del tegumento, lo sviluppo delle cellule epidermiche, i percorsi genici eterocronici, l'immunità innata, lo sviluppo di caratteri morfologici e l'evoluzione dei nematodi. A dimostrare la procedura sarà Robbie Schultz, uno studente laureato del mio laboratorio. Quando si lavora con *C. elegans*, tenere presente che è sensibile alla luce.Proteggere sempre l'occhio D dalla luce avvolgendolo nella stagnola. Indossare inoltre guanti e camice da laboratorio poiché il DMF è tossico e il DAI è un cancerogeno. Il cianuro Dai è molto potente.Un diluizione di lavoro a concentrazione standard è di 30 microgrammi per millilitro di DII in M nine, e una singola popolazione richiede soltanto 400 microlitri di diluizione di lavoro. Iniziare con una piastra da 60 millimetri popolata da nematodi non contaminati. Lavare gli animali dalla piastra con 1,5 millilitri di Triton X 100 allo 0,5%.Nel buffer M nine, ruotare delicatamente il liquido con movimenti circolari per staccare tutti gli animali larvali e adulti, quindi trasferire il lavaggio in un tubo da 1,5 millilitro. Centrifugare immediatamente gli animali a 2000 RRP M per 30 secondi per raccoglierli sul fondo del tubo. Rimuovere il più possibile il soprannatante senza disturbare gli animali.Procedere con attenzione, senza essere troppo avidi. Lavare gli animali con un millilitro di M nine. Centrifugare e rimuovere il sopranatante.Ripetere il lavaggio. Centrifugare nuovamente ed eliminare il soprannatante. Successivamente, aggiungere 400 microlitri di Dai a 30 microgrammi per millilitro in M9 nel tubo.Vortexare brevemente il tubo per risospendere gli animali. Quindi agitare il tubo a 20 gradi Celsius in posizione orizzontale per tre fino a 16 ore a 350 RP M in un ambiente protetto dalla luce. La tempistica di questi ultimi passaggi è importante.Prima di tutto, il Triton X deve essere lavato via prima che rimuova i lipidi a cui si lega il dai. In secondo luogo, gli animali devono essere colorati nella soluzione di colorante per occhi a sufficienza da permettere una colorazione uniforme della cuticola. Poco dopo, gli animali dovrebbero essere lasciati riprendere sul cibo a sufficienza per rimuovere l'occhio non legato.Al termine della colorazione, centrifugare gli animali ed eliminare la soluzione di colorante. Lavare gli animali con un millilitro di M nine. Per rimuovere il colorante non legato, centrifugare nuovamente gli animali ed eliminare il soprannatante.Risospendere gli animali in 400 microlitri di tampone M9 e versarli su una porzione libera da batteri di una piastra microscopica NGM. Dopo aver seminato OP50 E. coli, lasciare che gli animali si riprendano al buio per almeno 30 minuti, ma non più di un giorno, poiché la fluorescenza del colorante si attenua durante il tempo di recupero. Gli animali dovrebbero spostarsi strisciando dal liquido di colorazione verso il cibo.Questi animali sono più facili da immagine poiché presentano una fluorescenza di fondo minore derivante dal colorante libero nell'occhio. Iniziare preparando un pad di agar su un vetrino per garantire uno spessore uniforme del pad di agar utilizzato. Due distanziatori.Uno spaziatore viene realizzato sovrapponendo due pezzi di nastro adesivo da laboratorio su un vetrino. Gli spaziatori possono essere utilizzati all'infinito. Successivamente, posizionare un vetrino pulito longitudinalmente tra due vetrini spaziatori e aggiungere circa 150 microlitri di agarosio fuso al 4%.Al centro del vetrino pulito. Coprire rapidamente l'AER fuso con un ulteriore vetrino posizionato perpendicolarmente sopra l'AER e entrambi gli spaziatori per formare un cuscinetto di agar. Rimuovere con attenzione il vetrino coprioggetto, mantenendo il cuscinetto centrato sulla parte superiore del vetrino di montaggio.Ora pipettare cinque microlitri di anestetico per nematodi sul vetrino, posizionare dallo otto al dodici animali nell'anestetico e coprire delicatamente con un coprioggetto per microscopio. Osservare gli animali utilizzando un microscopio composto o confocale dotato di un obiettivo di almeno 40x e di un filtro trissy o di un altro filtro compatibile. Il massimo di eccitazione fluorescente del colorante eye è di 549 nanometri e il suo massimo di emissione è di 565 nanometri.Per campioni fissati, l'imaging rappresenta la parte più complessa di questo protocollo. Illustreremo come montare gli animali per l'imaging, ma è necessario aver ricevuto un'adeguata formazione sull'uso del microscopio composto o confocale che si intende utilizzare. Abbiamo riscontrato che l'utilizzo di un obiettivo con un ingrandimento di almeno 60 x è il migliore per risolvere i dettagli evidenziati mediante il metodo di colorazione.Ognuna delle immagini in questa sezione è stata acquisita utilizzando un obiettivo 63x in C. elegans embrionico posteriore. La superficie della cuticola presenta solchi circonferenziali separati annualmente e, in alcuni stadi, creste longitudinali chiamate ailey. Ognuna delle immagini in questa sezione è stata acquisita con un obiettivo 63x in C. elegans post-embriogenico.La superficie della cuticola presenta anelli annuali separati da solchi circonferenziali e, in alcuni stadi, creste longitudinali chiamate aley. Ogni stadio dello sviluppo presenta strutture cuticolari con composizioni e modelli distinti, e sia le creste che i solchi degli aley e degli Aly vengono colorati in modo fluorescente, a seconda della composizione della superficie.Durante tutte le fasi larvali e adulte utilizzando questo metodo di colorazione in sospensione, essi rimangono visibili fino a un giorno dopo il recupero. A volte si osservano granuli fluorescenti di fondo, ma non in modo abituale. Questa è la cuticola di animali adulti mutanti che mostrano difetti moderati nell'organizzazione della cuticola.Le creste di Ailey sono discontinue e sovranumerarie. Le creste di Ailey sono fuse e ramificate o biforcute, un marcatore transgenico comune. Un allele dominante di roll six provoca una torsione della cuticola, che può essere osservata nell'ailey e può causare un pattern irregolare degli anelli.Dai colora anche altre strutture del cuticolo esterno, inclusi il vulva dell'adulto ermafrodita e la coda del maschio adulto; inoltre, dai può evidenziare difetti sottili nella morfologia esterna, come questa coda forcellata, causati da una colorazione insufficiente. Ad esempio, una colorazione di due ore porta a una colorazione cuticolare irregolare, sebbene i neuroni esposti all'ambiente possano essere colorati. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore, esclusa l'acquisizione delle immagini, se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come colorare C. elegans con il colorante dieye per l'osservazione del cuticolo e di altre strutture morfologiche esterne.

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