Visualizzazione di Caenorhabditis Elegans Strutture cuticola Utilizzando il Dye lipofili Vital, Dii

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare la cuticola in un'eleganza marina trasparente utilizzando l'occhio colorante lipofilo fluorescente rosso. Ciò si ottiene preparando una popolazione di nematodi per la colorazione. Successivamente, l'occhio colorante diluito viene aggiunto alla popolazione e viene permesso loro di incubare.

Quindi gli animali vengono recuperati dalla soluzione colorante. L'imaging a fluorescenza della cuticola colorata di Dai mostra i dettagli sulla superficie, comprese le strutture riproduttive degli occhi di Ailey e Ann e altre caratteristiche morfologiche esterne. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti per la visualizzazione della cuticola in questo organismo trasparente come l'imaging diretto, la fluorescenza, l'espressione transgenica, la colorazione degli anticorpi, la microscopia elettronica e l'agglutinina marcata con germe di grano è che questa tecnica è facile da eseguire in modo relativamente rapido ed economico e produce una bella risoluzione delle strutture cuticolari negli animali vivi.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in molti campi che utilizzano il sistema modello di eleganza marina e la sua cuticola, come la secrezione cellulare e l'organizzazione delle cuticole, lo sviluppo delle cellule epidermiche, le vie geniche eterocroniche, l'immunità innata, lo sviluppo dei tratti morfologici e l'evoluzione dei nematodi. A dimostrare la procedura sarà Robbie Schultz, uno studente laureato del mio laboratorio. Quando lavori con D Eye, tieni presente che è sensibile alla luce.

Proteggi sempre l'occhio dalla luce avvolgendolo in un foglio. Indossa anche guanti e un camice da laboratorio poiché il DMF è tossico e il DAI è un'auto. Il cianuro Dai è molto potente.

Una diluizione di lavoro standard è di 30 microgrammi per millilitro di DII in M nove e una singola popolazione richiede solo 400 microlitri di diluizione di lavoro. Inizia con una piastra da 60 millimetri popolata da nematodi non contaminati. Lavare gli animali dal piatto in 1,5 millilitri di Triton X 100% allo 0,5%.

Nel tampone M nine, agitare delicatamente il liquido con movimenti circolari per sciogliere tutte le larve e gli animali adulti, quindi trasferire il lavaggio in un tubo da 1,5 millilitri. Far girare immediatamente gli animali a 2000 RRP M per 30 secondi per raccogliere gli animali sul fondo del tubo. Scartare quanto più surnatante possibile senza disturbare gli animali.

Fai attenzione, non avido. Lavare gli animali con un millilitro di M nove. Girare verso il basso e rimuovere il surnatante.

Ripetere il lavaggio. Girare di nuovo verso il basso e rimuovere il surnatante. Prossimo a 400 microlitri di 30 microgrammi per millilitro di Dai in M nove al tubo.

Agitare brevemente il tubo per risospendere gli animali. Quindi agitare il tubo a 20 gradi Celsius in posizione orizzontale per tre-16 ore a 350 RP M in un ambiente protetto dalla luce. La tempistica di questi ultimi passaggi è importante.

Innanzitutto, il Triton X deve essere lavato via prima di rimuovere i lipidi che il dai si lega. In secondo luogo, gli animali devono essere colorati con una soluzione per gli occhi colorante abbastanza a lungo da consentire alla cuticola di essere macchiata uniformemente. Un po' più tardi, gli animali dovrebbero essere lasciati riprendersi dal cibo abbastanza a lungo da rimuovere l'occhio non legato.

Al termine della colorazione, centrifugare gli animali e rimuovere la soluzione colorante. Lavare gli animali con un millilitro di M nove. Per rimuovere il colorante non legato, centrifugare gli animali e rimuovere il surnatante.

Risospendere gli animali in 400 microlitri di tampone M nine e versarli su una porzione priva di batteri di una micropiastra NGM. I semi con OP 50 E Coli consentono agli animali di riprendersi al buio per almeno 30 minuti, ma non più di un giorno perché la fluorescenza del colorante svanisce durante il tempo di recupero. Gli animali dovrebbero strisciare via dal liquido colorante e sul cibo.

Questi animali sono più facili da immaginare in quanto hanno meno fluorescenza di fondo dall'occhio a tintura libera. Inizia preparando un agri pad su uno scivolo per garantire uno spessore uniforme dell'agri pad utilizzato. Due distanziali.

Un distanziatore è realizzato sovrapponendo due pezzi di nastro adesivo da laboratorio su un vetrino. I distanziatori possono essere utilizzati a tempo indeterminato. Quindi, disporre un vetrino pulito nel senso della lunghezza tra due vetrini distanziatori, pipettare circa 150 microlitri di agar quattro fusi.

Al centro del vetrino pulito. Coprire rapidamente l'AER fuso con un vetrino aggiuntivo posizionato perpendicolarmente sopra l'AER ed entrambi i distanziatori per formare un tampone di agar. Sfilare con cautela la guida del coperchio, mantenendo il cuscinetto centrato sulla parte superiore della guida di montaggio.

Ora pipettare cinque microlitri di anestetico nematode sul tampone, montare da otto a 12 animali nell'anestetico e coprire delicatamente con un vetrino coprioggetti per microscopio. Osservare gli animali utilizzando un microscopio composto o confocale dotato di almeno un obiettivo 40x e di un filtro trissy o altro filtro compatibile. L'eccitazione massima fluorescente dell'occhio colorato è di 549 nanometri e la sua massima emissione è di 565 nanometri.

Per i die legati, l'imaging è la parte più impegnativa di questo protocollo. Mostriamo come montare gli animali per l'imaging, ma è necessario essere adeguatamente addestrati sul cannocchiale composto o confocale che utilizzerai. Abbiamo scoperto che l'utilizzo di un obiettivo con un ingrandimento di almeno 60 x è il migliore per risolvere i dettagli illuminati con il metodo di colorazione.

Ciascuna delle immagini di questa sezione è stata scattata utilizzando un obiettivo 63 x in poster embryonic seal elegance. La superficie della cuticola contiene annualmente separati da solchi circonferenziali e in alcuni stadi creste longitudinali chiamate ailey. Ciascuna delle immagini di questa sezione è stata scattata con un obiettivo 63 x in eleganza C post embrionale.

La superficie della cuticola contiene annualizzati separati da solchi circonferenziali e in alcuni stadi creste longitudinali chiamate aley. Ogni fase di sviluppo ha strutture cuticolari con composizioni e motivi distinti, creste o solchi sia di aley che di Aly Fluorescently color. A seconda della composizione della superficie.

Durante tutte le fasi della larva e dell'adulto che utilizzano questo metodo di esposizione della tintura, rimangono visibili fino a un giorno dopo il recupero. A volte si osservano macchie fluorescenti di fondo, ma non di routine. Questa è la cuticola di animali mutanti adulti che mostrano moderati difetti di organizzazione della cuticola.

Le creste di Ailey sono discontinue e soprannumerarie. Le creste di Ailey sono fuse e ramificate o biforcate, un comune marcatore transgenico. Un allele dominante del sesto rotolo provoca la torsione della cuticola, che può essere vista nell'ailey e può causare un modello irregolare degli anelli.

Dai colora anche altre strutture esterne della cuticola, tra cui l'ermafrodito adulto, la vulva e il sollevamento della coda del maschio adulto e il ventaglio Dai può anche evidenziare sottili difetti nella morfologia esterna come questa coda biforcuta, colorazione insufficiente. Ad esempio, una colorazione di due ore porta a una colorazione cuticolare a chiazze, anche se i neuroni esposti all'ambiente possono macchiarsi Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore, escluso l'imaging se viene eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come macchiare l'eleganza del mare con l'occhio per l'osservazione della cuticola e di altre strutture morfologiche esterne.