Fissazione dell'etanolo e colorazione DAPI: un metodo per visualizzare il DNA in C. elegans

- Iniziare con una goccia di soluzione tampone su un vetrino da microscopio e trasferire i vermi intatti nella gocciolina. Una volta che i vermi sono in posizione, usa un fazzoletto privo di lanugine per assorbire e rimuovere il tampone. Fissare il campione bagnando più volte i campioni con etanolo al 90%, lasciandolo evaporare dopo ogni applicazione.

Una volta che l'etanolo è evaporato dopo il risciacquo finale, aggiungere al campione una soluzione contenente il colorante dell'acido nucleico, DAPI. DAPI si lega preferenzialmente alle basi dell'adenina e della timina nel solco minore del DNA. Quando è legato, il complesso DAPI-DNA assorbe la luce UV ed emette luce blu visibile.

Successivamente, aggiungere un conservante anti-sbiadimento per prolungare la durata di conservazione del campione. Applicare un vetrino coprioggetti e sigillarlo sul vetrino. Quindi utilizzare un microscopio a fluorescenza con un filtro blu per visualizzare i corpi DAPI, che, a seconda della cellula e del suo stato di ciclo, possono rappresentare singoli cromosomi, coppie di cromatidi fratelli o interi nuclei. In questo esperimento, conteremo coppie di cromatidi fratelli colorati con DAPI negli ovociti, per identificare ceppi tetraploidi di Caenorhabditis elegans.

- I ceppi tetraploidi hanno 12 coppie di cromosomi, che possono essere convalidate contando i corpi colorati con DAPI in ovociti non fecondati. Per fare ciò, far cadere da cinque a dieci microlitri di tampone M9 su un vetrino e trasferire da sei a 10 tetraploidi putativi nella goccia. Sotto un microscopio da dissezione, immergere con cura la maggior parte dell'M9 in un panno per la pulizia privo di lanugine.

Quindi versa 10 microlitri di etanolo al 90% sui vermi e osserva l'etanolo evaporare completamente. Non appena l'evaporazione termina, ripeti il processo di aggiunta di etanolo e guardalo evaporare. In totale, aggiungere 10 microlitri in quattro applicazioni. Dopo che l'ultima goccia è evaporata, aggiungere sei microlitri di DAPI a due nanogrammi per microlitro, o una macchia simile.

Per la conservazione a lungo termine dei vetrini, montare i vermi in un anti-sbiadimento disponibile in commercio o fatto in casa. Quindi aggiungere un vetrino coprioggetti e sigillare i bordi con lo smalto. Dopo che lo smalto si è asciugato, le diapositive possono essere incise. Utilizzare un microscopio a fluorescenza e un ingrandimento 100x.

Per prima cosa, trova l'ovocita non fecondato più maturo, che è immediatamente adiacente alla spermateca e non è ancora entrato né nella spermateca né nell'utero. I corpi DAPI qui sono presumibilmente coppie di cromosomi singoli. Successivamente, concentrati sul nucleo dell'ovocita e usa la messa a fuoco fine del microscopio per scansionarlo lentamente, dall'alto verso il basso, contando i corpi DAPI. Quindi racconta i corpi DAPI nello stesso nucleo spostando il fuoco dal basso verso l'alto.

Gli ovociti wild type hanno in media sei corpi DAPI. La presenza di 12 corpi DAPI indica che gli animali di questo ceppo sono tetraploidi parziali o completi. Analizza almeno 10 animali per ceppo. Spesso le coppie di cromosomi sono molto vicine o si toccano, quindi il numero di corpi DAPI è spesso inferiore al numero effettivo di coppie di cromosomi.