Name: Rilevamento delle interazioni proteiche in pianta utilizzando un gateway compatibile complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC) Sistema (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Scopri il rilevamento delle interazioni proteiche in piante con il sistema BiFC compatibile Gateway. Questo metodo utilizza YFP diviso per visualizzare in tempo reale le interazioni proteiche in vivo.

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Ringraziamo Vi Nguyen per la lettura del manoscritto e l&#39;assistenza di laboratorio in generale.

1. Preparazione della cultura Agrobacterium <ol><li> Tumefaciens ceppo GV3101 precedentemente trasformato compatibile con BiFC Gateway vettore pEarleyGate201-YC e pEarleyGate202-YN, ciascuno contenente una fusione costrutto di governo indiano. </li><li> Inoculare un 5-ml YEB (5g L estratto di manzo -1, 1g L estratto di lievito -1, 5 g L -1 peptone, 5g L Saccarosio -1, 2mM MgSO 4, pH 7,2) cultura della proteina di fusione BiFC costruisce trasformato con l'Agrobacterium selezione appropriato di antibiotici. Crescere la cultura notte a 28 ° C in agitazione a 200 rpm. </li><li> Togliere 1 ml di coltura in una provetta sterile 1,5 ml centrifuga. </li><li> Cellule pellet a 1.000 g per 10 minuti a temperatura ambiente, scartare il surnatante. </li><li> Lavare il pellet con l'aggiunta di 1 ml di infiltrazione dei media (5 g L -1 D-glucosio, 50 mM MES (Sigma), 2 mM Na 3 PO 4, 0,1 mM acetosyringone) 11. Risospendere le sfere pipettando, le cellule pellet di nuovo a 1.000 g per 10 min. </li><li> Ripetere la fase di lavaggio altre due volte. </li><li> Risospendere il pellet in media da 0,5 ml infiltrazione. </li><li> Misurare l'assorbanza a 600 nm e regolare finale OD 600-1,0 a 1,2. </li><li> Aliquota una quantità uguale di sospensione Agrobacterium di ogni costruzione in un nuovo tubo di 1,5 ml, vortex per 10 sec. Per una infiltrazione singole, 100 ml di ogni costrutto è più che sufficiente. </li><li> La miscela Agrobacterium è ora pronto per l'infiltrazione. </li></ol> 2. Infiltrazione <ol start="11"><li> N. benthamiana piante sono coltivate a 21 ° C, con 16-ore di luce e 8-h cicli di buio. Cinque gli impianti di sei settimane di età dovrebbero essere usati per l'infiltrazione. </li><li> Rimuovere le piante dalla camera di crescita e di luogo in luce bianca per 1 ora prima infiltratring permettendo stomi per aprire completamente. </li><li> Elaborare risospeso miscela Agrobacterium in un 1 ml slip-siringa senza ago tubercolina. </li><li> Posizionare la punta della siringa contro la parte inferiore della foglia e delicatamente spingere il pistone mentre direttamente a sostegno della parte superiore della foglia con un dito. Il liquido si diffonderà attraverso la foglia come si riempie gli spazi d'aria mesophyllar. </li><li> Etichetta la zona infiltrata con un pennarello per l'identificazione futuro. </li><li> Per infiltrarsi con diversi costrutti, assicuratevi di cambiare sia i guanti o pulirli con etanolo al 70% tra le infiltrazioni. Se possibile, lasciare uno spazio nervatura centrale tra campioni diversi per evitare la contaminazione crociata. </li><li> Posizionare le piante in un armadio di crescita in condizioni di crescita normale. </li></ol> 3. Osservazione del segnale YFP ricostituito <ol start="18"><li> Accise un segmento di 5mm x 5mm di tessuto di foglie all'interno della zona infiltrata </li><li> Montare il campione, in acqua, su un vetrino di vetro, coprire il campione con un coprioggetto ed esaminare le interazioni con un microscopio confocale o fluorescenza. </li><li> Espressione deve essere monitorata ogni 24 ore dal momento di infiltrazione fino a 5 giorni dopo, come sopra espressione / traffico può comportare la visualizzazione di proteine ​​di fusione fluorescenti diversi luoghi nel corso del tempo. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Un esempio di interazione proteina-proteina testato mediante test BiFC è illustrato nella figura 1. AtTHP1 e AtSAC3A si ritiene siano componenti della Arabidopsis omologo di lievito TREX-2 complessi. Possono interagire con un AtNUP1 nuclearporin e facilitare l'esportazione mRNA 10. AtTHP1 e AtSAC3A sono stati clonati in pEarlyGate201-YC mentre AtNUP1 è stato clonato in pEarlyGate202-YN. I costrutti sono stati successivamente trasformati in GV3101. I tre costrutti sono stati appaiati con 3 possibili combinazioni (AtTHP1 + AtNUP1; AtTHP1 + AtSAC3A; AtNUP1 + AtSAC3A) per l'infiltrazione. Il segnale ricostituito YFP è stata osservata sotto un LCSM 48 ore dopo l'infiltrazione. I segnali sono state osservate nelle cellule epidermiche e localizzato nella periferia nucleare o al plasma nucleare, che è coerente con la localizzazione sub-cellulare di queste proteine. I controlli negativi non hanno mostrato alcun segnale YFP. <img src="/files/ftp_upload/3473/3473fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Arabidopsis TREX-2 componenti esportazione mRNA complesso interagire tra loro. N. benthamiana foglie, co-trasformato con costrutti del GOI fusa pEarleyGate201-YC e pEarleyGate202-YN (come indicato), hanno ripreso 48-72 ore dopo l'infiltrazione, utilizzando un microscopio Leica TCS SP2 confocol. Le immagini sono mostrate come fusi YFP confocale e luminose immagini a campo di epidermica N. benthamiana foglia cellule

<ol><li>Ohad, N., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+to+assay+protein-protein+interaction+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants.</a> Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).</li>
<li>Fang, Y., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiFC+imaging+assay+for+plant+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">BiFC imaging assay for plant protein-protein interactions.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2, (2010).</li>
<li>Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+to+study+protein-protein+interactions+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells.</a> Methods in molecular biology. 479, 189-202 (2009).</li>
<li>Hiatt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+analysis+of+protein+interactions+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 45, 185-191 (2008).</li>
<li>Barnard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+implementation+of+split-GFP-based+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Development and implementation of split-GFP-based bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays in yeast.</a> Biochemical Society Transactions. 36, 479-482 (2008).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nature. 1, 1278-1286 (2006).</li>
<li>Hu, C. D., Grinberg, A. V., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living cells using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis.</a> Current protocols in cell biology. 21, 3-3 (2006).</li>
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<li>Lu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+homolog+of+the+yeast+TREX-2+mRNA+export+complex%3A+components+and+anchoring+nucleoporin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 61, 259-270 (2010).</li>
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<li>Rackham, O., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+RNA-protein+interactions+in+living+cells%3A+FMRP+and+IMP1+interact+on+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs.</a> The EMBO journal. 23, 3346-3355 (2004).</li>
<li>Demidov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+complementation+of+split+fluorescent+protein+triggered+by+DNA+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fast complementation of split fluorescent protein triggered by DNA hybridization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2052-2056 (2006).</li>
<li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nature. 3, 1693-1702 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Saggio BiFC è un potente strumento per studiare le interazioni delle proteine. A differenza del tradizionale test Y2H, BiFC non solo permette la visualizzazione delle interazioni proteina-proteina, ma fornisce anche ulteriori informazioni del complesso proteico come la localizzazione sub-cellulare. Inoltre, è possibile rilevare le interazioni indirette finché le due proteine ​​candidato può essere portato abbastanza vicino da un terzo partner. Come ogni tecnologia, BiFC ha i suoi limiti. A causa della necessità di ossig...

<table><tbody><tr><td>Acetosiringone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>Idrato di MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>Siringa tubercolina da 1 mL con punta liscia</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr></tbody></table>

rilevamento delle interazioni proteiche in pianta utilizzando un gateway compatibile complementazione fluorescenza biomolecolare (bifc) sistema

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Abbiamo sviluppato una tecnica BiFC per testare l&#39;interazione tra due proteine ​​in vivo. Ciò si ottiene dividendo una proteina fluorescente gialla (YFP) in due frammenti non si sovrappongono. Ogni frammento viene clonato in-frame ad un gene di interesse. Questi costrutti possono essere co-trasformato in Nicotiana benthamiana tramite trasformazione mediata da Agrobacterium, consentendo l&#39;espressione di proteine ​​di fusione di transito. La ricostituzione del segnale YFP si verifica solo quando le proteine ​​interagiscono inchiesta 1-7. Per testare e convalidare il interazioni proteina-proteina, BiFC possono essere utilizzati insieme con il lievito due ibridi (Y2H) test. Questo può rilevare le interazioni indirette che può essere trascurato nel Y2H. La tecnologia Gateway è una piattaforma universale che consente ai ricercatori di navetta il gene di interesse (GOI), in quanto espressione di molti e sistemi di analisi funzionale possibile 8,9. Sia l&#39;orientamento e la cornice di lettura può essere mantenuta senza l&#39;utilizzo di enzimi di restrizione o la legatura di rendere l&#39;espressione-ready cloni. Come risultato, si può eliminare tutte le re-sequencing misure per garantire risultati costanti nel corso degli esperimenti. Abbiamo creato una serie di vettori Gateway compatibile BiFC e Y2H che fornire ai ricercatori un facile da usare strumenti per eseguire test sia BiFC e Y2H 10. Qui, dimostriamo la facilità di utilizzo il nostro sistema BiFC per testare interazioni proteina-proteina in N. benthamiana piante.

Abbiamo sviluppato una tecnica per testare interazioni proteina-proteina in pianta. Una proteina fluorescente gialla (YFP) è divisa in due frammenti non si sovrappongono. Ogni frammento viene clonato in-frame ad un gene di interesse attraverso il sistema Gateway, consentendo l&#39;espressione di proteine ​​di fusione. Ricostituzione del segnale YFP si verifica solo quando le proteine ​​interagiscono inchiesta.

Rilevamento delle interazioni proteiche in pianta utilizzando un gateway compatibile complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC) Sistema

Abbiamo sviluppato una tecnica BiFC per testare l'interazione tra due proteine in vivo. Ciò si ottiene suddividendo una proteina fluorescente gialla...

Per verificare l'interazione tra due proteine, i due geni di interesse devono essere clonati nei vettori BF e utilizzando la tecnica di ricombinazione Gateway. Questi costrutti vengono trasformati in *Agrobacterium tumefaciens* GV3101. Le colture batteriche GV3101 contenenti i costrutti verranno quindi mescolate e con-infiltrate nelle foglie.Se le due proteine candidato interagiscono tra loro, il segnale YFP può essere osservato utilizzando outcome focale Mexico. Lo scopo principale della tecnica BFC è verificare l'interazione tra due proteine. In vavo, abbiamo creato una serie di vettori BFC e IS two hybrid compatibili con il sistema gateway, che forniscono ai ricercatori strumenti di facile utilizzo per eseguire sia saggi BFC che saggi ISTO two hybrid.In questo video, mostreremo la semplicità d'uso del nostro sistema BFC. Per verificare le interazioni tra proteine in un sistema di espressione trascendentale, è necessario prima preparare la coltura batterica GV3101.È necessario prelevare una singola colonia dalla propria piastra e inoculare in cinque millilitri di mezzo YEB con antibiotici appropriati. Successivamente, occorre agitare queste colture tutta la notte a 28 gradi. La v

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In questo articolo viene illustrato come utilizzare correttamente il BioRad Helios Gene Gun per introdurre DNA plasmidico in cellule epidermiche di cipolla e come test per interazioni proteina-proteina in cellule di cipolla in base al principio della complementazione bimolecolare fluorescenza...

Biomolecolare fluorescenza complementazione (BiFC) Assay per interazione proteina-proteina nelle cellule Cipolla Utilizzando la Helios Gun Gene

La localizzazione subcellulare delle proteine ​​è importante nel determinare la regolazione spazio-temporale di segnalazione cellulare. Qui, descriviamo biomolecolare complementazione fluorescenza (BiFC) come un metodo semplice per il monitoraggio delle interazioni spaziali delle proteine ​​all'interno della cellula.

Bimolecolari complementazione fluorescenza

L'analisi citofluorimetrica di bimolecular complementazione fluorescenza fornisce un alto metodo quantitativo di throughput per studiare l'interazione proteina-proteina. Questa metodologia può essere applicata a siti di legame della proteina di mappatura e per lo screening di fattori che regolano l'interazione proteina-proteina.

L&#39;analisi citofluorimetrica di bimolecular Complementation Fluorescenza: A High Throughput Metodo quantitativo per studiare l&#39;interazione proteina-proteina

Formazione di complessi proteici in vivo può essere visualizzato da bimolecular fluorescenza complementazione. Partner di interazione sono fusi a parti complementari tag fluorescenti e transitoriamente espressi in foglie di tabacco, risultando in un segnale fluorescente ricostituito upon vicinanza delle due proteine.

Interazioni proteina-proteina visualizzati tramite bimolecular complementazione fluorescenza in protoplasti di tabacco e foglie

Le interazioni proteina-proteina vengono visualizzate in cellule con risoluzione spaziale nanometrica combinando la complementazione a fluorescenza bimolecolare (BiFC) con la microscopia a localizzazione fotoattivata (PALM). Qui viene descritto l'uso di BiFC-PALM per l'imaging delle interazioni Ras-Raf nelle cellule U2OS per visualizzare il clustering e la diffusione su scala nanometrica di singoli complessi Ras-Raf.

Fotoattivato localizzazione Microscopia con complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC-PALM)

Questo manoscritto descrive una facile e rapida procedura sperimentale per la determinazione di interazioni proteina-proteina basate sulla misurazione dell'attività luciferasica.

Analisi di Imaging di complementazione di luciferase in foglie di Nicotiana benthamiana per transitoriamente determinare dinamiche di interazione proteina-proteina

Abbiamo sviluppato un nuovo metodo per cheesprimono più proteine di fusione fluorescenti chimerico in piante per superare le difficoltà dei metodi convenzionali. Essa si avvale dell'utilizzo di un plasmide di espressione singola che contiene più proteine funzionalmente indipendente esprimendo cassette per ottenere co-espressione della proteina.

Co-espressione delle proteine chimeriche fluorescenti Fusion Multiple in modo efficiente nelle piante

Questo protocollo dimostra l'uso del saggio di legatura di prossimità per sondare le interazioni proteina-proteina in situ nella germinale C. elegans.

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly nella C. elegans Germline utilizzando Proximity Ligation Assay

Qui presentiamo un metodo per visualizzare la formazione di complessi ternari tra tre partner proteici utilizzando proteine fluorescenti marcate dal test FRET-FLIM basato su BiFC. Questo metodo è prezioso per studiare i complessi di interazione proteina-proteina in vivo.

Determinazione dell'interazione tripartita tra due monomeri di un fattore di trascrizione MADS-box e una proteina sensore di calcio mediante saggio BiFC-FRET-FLIM

Qui, presentiamo un protocollo passo-passo per eseguire l'esperimento di marcatura di prossimità (PL) nel cetriolo (Cucumis sativus L.) utilizzando AT4G18020 proteina (APRR2)-AirID come modello. Il metodo descrive la costruzione di un vettore, la trasformazione di un costrutto attraverso l'agroinfiltrazione, l'infiltrazione di biotina, l'estrazione di proteine e la purificazione di proteine marcate con biotina attraverso la tecnica di purificazione per affinità.

Etichettatura di prossimità basata su AirID per l'interazione proteina-proteina nelle piante

Il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) è una tecnica di imaging per rilevare le interazioni proteiche nelle cellule viventi. Qui viene presentato un protocollo FRET per studiare l'associazione di enzimi modificanti gli istoni con fattori di trascrizione che li reclutano nei promotori bersaglio per la regolazione epigenetica dell'espressione genica nei tessuti vegetali.

Studio delle interazioni tra enzimi modificanti gli istoni e fattori di trascrizione in vivo mediante trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza

Scopri il rilevamento delle interazioni proteiche in piante con il sistema BiFC compatibile Gateway. Questo metodo utilizza YFP diviso per visualizzare in tempo reale le interazioni proteiche in vivo.

Rilevamento delle interazioni proteiche in pianta utilizzando un gateway compatibile complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC) Sistema (Video) | JoVE Journal

Rilevamento delle interazioni proteiche in pianta utilizzando un gateway compatibile complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC) Sistema

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