Rilevamento delle interazioni proteiche in pianta utilizzando un gateway compatibile complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC) Sistema

Per verificare l'interazione tra due proteine, i due geni di interesse devono essere clonati nei nostri vettori BF e utilizzando la tecnica di clonaggio Gateway. Questi costrutti vengono trasformati in *Agrobacterium* GV3101. Le colture batteriche GV3101 contenenti i costrutti verranno mescolate e co-infiltrate nelle foglie.

Se le due proteine candidato interagiscono tra loro, il segnale YFP può essere osservato utilizzando outcome focal Mexico. Lo scopo principale della tecnica BFC è verificare l'interazione tra due proteine. In vavo, abbiamo creato una serie di vettori BFC e IS two hybrid compatibili con il sistema gateway, che forniscono ai ricercatori strumenti di facile utilizzo per eseguire sia saggi BFC che saggi ISTO two hybrid.

In questo video, mostreremo la semplicità d'uso del nostro sistema BFC. Per verificare le interazioni tra proteine, in un modo che trascende il sistema di espressione, è necessario prima preparare la coltura batterica GV 3 1 0 1.

È necessario prelevare una singola colonia dalla propria piastra e inoculare cinque millilitri di mezzo YEB contenente gli antibiotici appropriati. Successivamente, occorre agitare queste colture per tutta la notte a 28 gradi. La velocità è di 200 giri al minuto.

Le colture batteriche dovrebbero essere pronte la mattina successiva. Assicurarsi che i batteri D non siano cresciuti eccessivamente. Prelevare le colture dall'incubatrice e trasferire un maschio di ciascuna coltura in un tubo sterile da centrifuga da 1,5 mL.

Inserire i tubi del centrifugato in una centrifuga da banco. Centrifugare i batteri a 1000 G per 10 minuti a temperatura ambiente, scartare il soprannatante. Quindi risospendere il pellet aggiungendo un millilitro di mezzo di infiltrazione e risospendere per pipettaggio ripetuto alcune volte.

Ripetere il passaggio di lavaggio altre due volte. Questo passaggio è importante perché aiuta a rimuovere le tracce di antibiotici nel mezzo batterico, che potrebbero compromettere le piante dopo l'infiltrazione. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere il pellet in 0,5 mL di mezzo di infiltrazione e misurare l'assorbanza a 600 nm di questa sospensione batterica utilizzando un fotometro a dispersione, con il mezzo di infiltrazione come bianco di controllo.

Dopo la misurazione dell'OD, è necessario aggiustare l'OD utilizzando il mezzo di infiltrazione. L'OD finale deve essere compreso tra 1 e 1,2. È consigliabile preparare tutte le sospensioni batteriche prima di passare al passaggio successivo.

Trasferire quantità uguali di sospensioni batteriche corrispondenti alle due proteine candidate e mescolarle in un nuovo tubo da 1,5 ml. La miscela batterica negativa è ora pronta per l'infiltrazione. Preparare tutte le combinazioni e non dimenticare di includere un controllo negativo. Utilizzare piante di Nicotiana benthamiana di cinque-sei settimane, nelle migliori condizioni, per l'infiltrazione.

È possibile rimuovere le piante dalla stanza di crescita e posizionarle sotto luce notturna per un'ora prima dell'infiltrazione, in modo da aprire gli stomi. Questo agevolerà il processo di infiltrazione. Aspirare circa 100 microlitri di batteri sospesi in Resus.

Mescolare con una siringa monouso da un millilitro senza ago. Appoggiare la punta della siringa sulla pagina inferiore della foglia. Sostenere la pagina superiore della foglia con il dito.

Premere generalmente sul pistone. Si dovrebbe vedere il liquido diffondersi attraverso la foglia mentre si percepisce ancora la mesofilla più sottile. Dopo l'infiltrazione, contrassegnare con un pennarello l'area infiltrata. In caso contrario, dopo due giorni non sarà possibile identificare l'area infiltrata. Se è necessario infiltrare con diverse miscele batteriche, assicurarsi di spruzzare i guanti con etanolo al 50% o di cambiare i guanti tra un'infiltrazione e l'altra.

Cercare di lasciare uno spazio di un metro tra le infiltrazioni per evitare contaminazioni incrociate. I segnali di PFA devono essere monitorati ogni 24 ore a partire dall'infiltrazione fino a cinque giorni. È possibile utilizzare due guaine protettive di dimensioni diverse per tenere il campione.

Prima, mettere una goccia di acqua mini su una guaina del tappo scanalata. Quindi tagliare un piccolo pezzo di tessuto di coltello all'interno della zona infiltrata. Tentare di evitare la vena nauseata nel campione.

Posizionare il tessuto di coltello tagliato nell'acqua sul vetrino in basso, coprirlo utilizzando una piccola cuffia corrente e premere delicatamente. Ora il campione può essere osservato al microscopio Mexico. Qui utilizziamo questo NACA T CSS P due microscopio confocale Mexico per visualizzare il segnale BIFC.

Anche un comune microscopio a scansione laser confocale può essere utilizzato. La microscopia confocale fornisce immagini migliori e permette di rilevare segnali deboli. È possibile utilizzare il parametro YFP per rilevare i segnali VFC in questo sistema NCAs P due.

È possibile fare semplicemente doppio clic su questo preset YFP qui, il che attiverà automaticamente l'eccitazione e imposterà l'intervallo di rilevamento dell'emissione. Se si utilizza un sistema diverso, consultare il manuale per impostare correttamente i parametri. Speriamo che, dopo aver visto questo video, siate in grado di eseguire la BFCE per testare le interazioni tra proteine utilizzando il sistema di espressione unbe MI Transcend.

È possibile applicare questo procedimento anche a piante di tabacco e AY. I nostri vettori BFC contengono rispettivamente un marcatore HA e un marcatore flag, quindi è anche possibile eseguire un co-IP per validare le interazioni, se necessario.