Rilevamento delle interazioni proteiche in pianta utilizzando un gateway compatibile complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC) Sistema

Per testare l'interazione tra due proteine, i due geni di interesse devono essere clonati nel nostro BF e nei vettori utilizzando la tecnica del gateway longing. Questi costrutti vengono trasformati in aerium GV 3 1 0 1. Le colture batteriche GV 3 1 0 1 contenenti per costruire saranno mescolate e co-infiltrate nelle foglie.

Se le due proteine candidate interagiscono tra loro, il segnale YFP può essere osservato utilizzando l'esito focale Mexico. Lo scopo principale della tecnica BFC è quello di testare l'interazione tra due proteine. In vavo, abbiamo creato una serie di due vettori ibridi BFC e IS compatibili con il gateway che forniscono ai ricercatori strumenti di facile utilizzo per eseguire sia i saggi ibridi BFC che ISTO two.

In questo video, dimostreremo la facilità di utilizzo del nostro sistema BFC. Per testare la proteina, le interazioni proteiche in modo incerto trascendono il sistema di espressione. Per prima cosa è necessario preparare la coltura batterica GV 3 1 0 1.

È necessario prelevare una singola colonia dal piatto e inoculare in cinque maschi di terreno YEB con antibiotici appropriati. Quindi è necessario agitare queste colture durante la notte a 28 gradi. La velocità è di 200 corse al minuto.

Le colture batteriche dovrebbero essere pronte la mattina successiva. Assicurati che i batteri D siano cresciuti eccessivamente. Estrarre le colture dall'incubatore e trasferire un maschio di ciascuna coltura in una provetta da centrifuga sterile da 1,5 maschi.

Metti le provette da centrifuga in una centrifuga da tavolo. Centrifugare i batteri a 1000 G per 10 minuti a temperatura ambiente, scartare la rete. Quindi osserva il penato aggiungendo un pasto di mezzo di infiltrazione e la rivalutazione per Petting un paio di volte.

Ripetere la fase di lavaggio per altre due volte. Questo è importante perché aiuta a rimuovere la traccia di antibiotici nel mezzo batterico, che ti fanno piantare le foche dopo l'infiltrazione. Dopo il lavaggio finale, sospendere nuovamente il pallet in 0,5 misure di mezzo di infiltrazione maschile dovute a 600 di queste sospensioni batteriche utilizzando uno spettrofotometro utilizzando il mezzo di infiltrazione come controllo della banca.

Dopo la misurazione del diametro esterno, è necessario regolare il diametro esterno utilizzando il mezzo di infiltrazione. L'OD finale dovrebbe essere compreso tra uno e 1,2. È necessario preparare tutte le sospensioni batteriche prima di procedere al passaggio successivo.

Trasferisci la stessa quantità di sospensioni batteriche corrispondenti alle tue due proteine candidate e mescolale in una nuova provetta maschio da 1,5 La miscela di batteri negativi è ora correlata all'infiltrato. Prepara tutte le combinazioni e non dimenticare di includere un controllo negativo. Dovresti usare il codice da cinque a sei settimane e le piante migliori per l'infiltrazione.

Puoi rimuovere le piante dalla stanza di crescita e posizionarle su We night per un'ora prima dell'infiltrazione per aprire l'attacco della tempesta. Questo aiuterà con il processo di infiltrazione. Prelevare circa 100 microlitri di batteri sospesi Resus.

Mescolare vicino a una siringa con punta maschio senza ago. Posizionare la punta della siringa contro la parte inferiore della foglia. Sostieni la parte superiore del ginocchio con il dito.

Generalmente premere sullo stantuffo. Dovresti essere in grado di vedere il liquido che si diffonde attraverso la foglia come ancora sente il Meso più sottile Gli spazi d'aria dopo l'infiltrazione consentono l'aero infiltrato con un pennarello. In caso contrario, dopo due giorni, non sarai in grado di identificare l'A infiltrato. Se hai bisogno di infiltrarti con una miscela di miscele batteriche diversa, assicurati di spruzzare il guanto con etanolo al 50% o di cambiare i guanti G tra le infiltrazioni.

Cerca di lasciare uno spazio di un metro tra le infiltrazioni per evitare la contaminazione incrociata. I segnali PFA devono essere monitorati ogni 24 ore dall'infiltrazione fino a cinque giorni. È possibile utilizzare due manicotti di copertura di diverse dimensioni per contenere il campione.

Per prima cosa, metti una goccia di mini acqua su una manica di copertura della tacca. Quindi tagliare un piccolo pezzo di tessuto a coltello all'interno della zona infiltrata. Cerca di evitare la nausea e la vena nel campione.

Mettere il fazzoletto del coltello tagliato nell'acqua sul vetrino sotto il set, coprirlo con un manicotto di corrente più piccolo e premere delicatamente. Ora il campione può essere osservato nell'ambito del Messico. Qui usiamo questo NACA T CSS P due confocali Mexico per visualizzare il segnale BIFC.

Può essere utilizzato anche il normale profumo Messico. Il confocale fornisce immagini migliori e rileva i segnali deboli. È possibile utilizzare il parametro YFP per rilevare i segnali VFC in questo sistema P two di NCA.

Puoi semplicemente fare doppio clic su questo preset YFP qui, che attiverà automaticamente l'eccitazione e imposterà l'intervallo di rilevamento delle emissioni. Se si utilizza un sistema diverso, fare riferimento al manuale per impostare correttamente i parametri. La nostra speranza è che dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di condurre il BFCE per testare le interazioni proteiche utilizzando il sistema di espressione unbe MI Transcend.

È possibile applicare questa procedura anche alle piante di tabacco e AY. I nostri vettori BFC contengono anche un tag HA e flag rispettivamente, quindi puoi anche eseguire co IP per convalidare le interazioni, se necessario.