Name: Lanalisi citofluorimetrica di bimolecular Complementation Fluorescenza: A High Throughput Metodo quantitativo per studiare linterazione proteina-proteina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Scopri un metodo ad alto rendimento per mappare i siti di interazione proteina-proteina utilizzando BiFC e citofluorimetria. Questa tecnica quantitativa analizza le interazioni tra AKAP-Lbc e PDE4D3 in cellule viventi HEK293T.

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Ringraziamo il laboratorio O&#39;Bryan a UIC per la valutazione sperimentale critica e discussione. Questo lavoro è stato sostenuto da American Heart Association Concessione 11SDG5230003 di GKC e National Center for Advancing Science Translational - Centro UIC per Scienze Cliniche e traslazionale sovvenzione UL1TR000050.

1. Trasfezione delle cellule <ol><li> Cellule piastra il giorno prima della transfezione, placcatura meno cellule per immunofluorescenza. <ol><li> Per immunofluorescenza: in un 6-pozzetti, cappotto di vetro coprioggetto (1 per bene) con il 0,02% di gelatina a 37 ° C per almeno 4 ore, lavare una volta con il mezzo, e per ogni bene, piastra 1 x 10 5 HEK 293T cellule in 2 ml di mezzo di crescita completo [mezzi di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) più 10% FBS]. </li><li> Per le analisi di citometria a flusso e Western Blot: piatto 1,2 x 10 5 HEK 293T cellule / pozzetto in 2 ml di terreno di coltura completo in 6 pozzetti (0,3 x 10 5 HEK 293T cellule in 0,5 ml di mezzo di coltura completo per pozzetto in piastra da 24 pozzetti ). </li></ol></li><li> Preparare DNA per trasfezione secondo il protocollo di produzione: Effectene (Qiagen) viene utilizzato per l&#39;immunofluorescenza. Transit-LT1 (Mirus) è utilizzato per le analisi di flusso citometria e Western Blot. Quantità di DNA utilizzato è elencato di seguito. <table border="1"><tbody><tr><td&gt; </td><td> 24-pozzetti (ng) </td><td> 6 pozzetti (ng) </td></tr><tr><td> CFP-vettore </td><td> 10 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> VN N-AKAP-Lbc </td><td> 200 </td><td> 1000 </td></tr><tr><td> VC N-PDE4D3-FL (full-length PDE4D3) </td><td> 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> VC-N-PDE4D3 UCR1 (un frammento N-terminale PDE4D3 contenente il dominio UCR1) </td><td></td><td> 100 </td></tr><tr><td> VC N-PDE4D3-UCR2 + CAT (un frammento C-terminale PDE4D3 contenente i domini UCR2 e catalitici) </td><td></td><td> 100 </td></tr></tbody></table> Trasfezione usando Effectene (6 pozzetti): <ol><li> Aggiungi quantità indicata di DNA plasmidico + 4 pl enhancer a 100 microlitri di buffer CE, mescolare e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 5 Effectene ml, mescolare e incubare per 10 minuti atemperatura ambiente. Aggiungere goccia a goccia per le cellule. </li></ol> Trasfezione utilizzando Transit-LT1 (6-well/24-well): <ol><li> Aggiungere quantità indicata di DNA plasmidico a 250 μl/50 pl di Opti-MEM I mezzo privo di siero in una provetta sterile. </li><li> Aggiungere il reagente Transit-LT1 alla miscela di DNA diluito e pipettare delicatamente per mescolare. (Transito-LT1 reagente: rapporto di DNA è di 3 ml di transito LT1-reagente per 1 mg di DNA). </li><li> Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente ed aggiungere goccia a goccia alle cellule. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione delle cellule per la citometria a flusso, Western Blot, e immunofluorescenza <ol><li> 24 ore dopo la trasfezione, controllare la fluorescenza sotto microscopio a epifluorescenza prima che le cellule raccolta. </li><li> Preparazione delle cellule per l&#39;analisi di citometria a flusso: <ol><li> Lavare le cellule con 0,5 ml / 2 ml PBS freddo per lastre 24-well/6-well. </li><li> Staccare le cellule utilizzano 50 μl/250 microlitri 0,05% tripsina. </li><li> Neutralizzare la tripsina con 200 pl / 1 ml di DMEM. </li><li> Collect 250 cellule microlitri (sia per piastra da 24 pozzetti e 6 pozzetti) per centrifugazione a 500 xg per 5 min, utilizzare i restanti cellule (1 ml) per l&#39;analisi Western blot. </li><li> Risospendere le cellule in 250 microlitri tampone FACS [PBS + 0,5% (w / v) di BSA + 2 mM EDTA], negozio su ghiaccio per analisi citofluorimetrica. Le celle possono anche essere fissati in paraformaldeide 1% (in PBS) se l&#39;analisi di citometria a flusso non sarà immediata. </li></ol></li><li> Preparazione delle cellule per l&#39;analisi Western Blot: condotta in parallelo con la preparazione delle cellule per l&#39;analisi di citometria a flusso. <ol><li> Lavare le cellule 1x con 2 ml di PBS ghiacciato, lisare cellule aggiungendo 100 pl di tampone di lisi cellulare [10 mM tampone fosfato di sodio, pH 6,95, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1% Triton X-100] . </li><li> Raccogliere lisato cellulare mediante centrifugazione per 10 min a 21.000 xga 4 ° C. </li><li> Quantificare la concentrazione di proteine ​​mediante test proteina Bradford, caricare la stessa quantità di proteine ​​per ogni corsia per SDS-PAGE, e trasferimento in nitrocellulosa per immunoblotting. </li></ol&gt; </li><li> Preparazione delle cellule per immunofluorescenza. <ol><li> Risciacquare cellule 3x con 2 ml di PBS, fissare le cellule in 1 ml di 3,7% paraformaldeide (in PBS) per 10 min a temperatura ambiente, poi lavare 3x con 2 ml di PBS per 5 min. </li><li> Montare coprire scivolare su un vetrino, con mezzo di montaggio. Sigillare i bordi coprioggetto con smalto per unghie, se necessario. </li><li> Conservare i vetrini a 4 ° C prima dell&#39;esame. </li></ol></li></ol> 3. Citometria a flusso e microscopia di immunofluorescenza <ol><li> Citometria di flusso viene eseguita usando un Beckman Coulter Ciano ADP, dotato di 488 nm, 405 nm e 642 nm laser allo stato solido. Software Summit è utilizzato per l&#39;acquisizione e l&#39;analisi. <ol><li> Calibrare citofluorimetro utilizzando perline standard. </li><li> Diagramma a dispersione in avanti (FSC) / Orientabilità scatter (SSC) su una scala lineare per gating popolazione di cellule vive. </li><li> Trama larghezza di impulso FSC / tensione di gating non aggregata popolazione di cellule vive. </li><li> Trama count/FL6 (PCP fluorescence, 405 nm) su scala logaritmica per gating non aggregati cellule CFP-positive vivi. </li><li> Trama count/FL1 (YFP fluorescenza, 488 nm) su una scala logaritmica per l&#39;intensità BiFC. </li><li> Esegui campioni YFP-CFP-Double Negative, regolare FSC, SSC, FL1 e FL6 tubo foto moltiplicatore (PMT) per impostare la tensione di soglia per ogni segnale. </li><li> Esegui unico positivo (entrambi + + YFP e CFP) i campioni per il futuro di compensazione off-line </li><li> Acquisire almeno 10.000 eventi recintata (+ cellule PCP vivo non aggregati) per l&#39;analisi. </li></ol></li><li> Microscopia ad immunofluorescenza viene eseguita utilizzando un Zeiss LSM 510 microscopio confocale. Nota: è importante mantenere tutte le impostazioni (come ad esempio lo zoom, foro stenopeico, il guadagno del rivelatore, amplificatore offset, dimensione del frame, velocità di scansione, scansione media, e la potenza del laser) coerente tra campioni per una corretta comparazione di tutti i dati. </li></ol> 4. Analisi dei dati (effettuata utilizzando il software Summit) <ol><li> Impostare il protocollo di analisi simile a quella per Acquisizione con una corretta gating: Gate 1 in FSC / SSC dot plot per le cellule vive. Gate 2 in FSC / larghezza di impulso di Gate 1 per le cellule vive non aggregati. Gate 3 nel conteggio / CFP di Gate 3 per CFP non aggregata + cellule vive. </li><li> Compensare YFP e CFP segnale usando + e + PCP cellule positive singole YFP. </li><li> Rideterminare le linee di taglio per le cellule CFP / YFP-positivo. </li><li> Export YFP fluorescenza media (MFI) di PCP + celle in Excel per i dati-stampa. </li><li> Normalizzare YFP IFM ai livelli di espressione di AKAP-LBC PDE4D3, e il caricamento di controllo α-tubulina, come determinato da Western Blot. </li></ol>

<ol><li>Collura, V., Boissy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+protein-protein+complexes+to+interactomics%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell+Biochem%22%5BJournal%5D)">From protein-protein complexes to interactomics.</a> Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).</li>
<li>Stumpf, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+size+of+the+human+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Estimating the size of the human interactome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).</li>
<li>Shekhawat, S. S., Ghosh, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-protein+systems%3A+beyond+binary+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).</li>
<li>Dwane, S., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+used+to+study+how+protein+complexes+are+assembled+in+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng.+Bugs%22%5BJournal%5D)">Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades.</a> Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).</li>
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<li>Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+general+principles+and+applications+to+selected+studies+in+tumor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Adv.+Surg.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology.</a> Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).</li>
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<li>Smith, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic confocal microscopy.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11(2008).</li>
<li>Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+drug+discovery+with+contextual+assays+and+cellular+systems+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis.</a> Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).</li>
<li>Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+pharmacology+of+G+protein-coupled+receptor+signaling+complexes+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation.</a> Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

BiFC è un metodo semplice e sensibile per studiare l&#39;interazione proteina-proteina. Questo metodo non può essere usato per identificare nuove interazioni proteina-proteina, tuttavia, è particolarmente conveniente per confermare l&#39;interazione proteina-proteina all&#39;interno delle cellule e per studiare le proprietà funzionali, quali localizzazione subcellulare dei complessi proteici, mappatura dei siti di interazione proteina-proteina, e per lo screening di piccole molecole / peptidi che possono modulare l&#39;...

650.000 interazioni proteina-proteina sono stimati ad esistere nel interattoma umano, gioca un ruolo critico nel mantenimento della normale funzionalità delle cellule 1,2. Oltre co-immunoprecipitazione (co-IP), il gold standard per studiare l&#39;interazione proteina-proteina dal lisato cellulare, parecchi frammenti proteici saggi di complementazione (PCA) sono stati sviluppati per migliorare la sensibilità nella rilevazione di interazione proteina-proteina all&#39;interno delle cellule 3. Le tecniche includono Förster Resonance Energy Transfer (FRET), bioluminescenza Resonance Energy Transfer (BRET), e bimolecular complementazione fluorescenza (BiFC) 4,5. BiFC si basa sull&#39;associazione facilitato dei due frammenti di una proteina fluorescente (qui usiamo Venere; una variante YFP) che sono ognuno fuso ad un potenziale partner proteine ​​interagenti (in questo esempio si usa AKAP-Lbc e PDE4D3). Interazione dei due proteine ​​di interesse all&#39;interno di cellule risultati nella fluorescenza funzionali, che possono essere visualizzati da fmicroscopia luorescence utilizzando sia cellule vive o fissa 6,7,8. Rispetto ad altri APC, BiFC è sensibile e tecnicamente meno impegnativo, con la possibilità di studiare la localizzazione cellulare in cellule vive. Un grave inconveniente di questa tecnica tuttavia è che una volta formato, il complesso proteina fluorescente non può essere invertito. Quindi non è un buon metodo per studiare l&#39;interazione proteina-proteina dinamico. In questo lavoro, si usa BiFC per mappare i siti di interazione di PDE4D3 con AKAP-Lbc monitorando le intensità di fluorescenza di Venere. Rispetto ai tradizionali analisi mediante microscopia a fluorescenza, che richiede tempo e manodopera (se non effettuata con macchine ad alta velocità automatizzato), citometria a flusso fornisce un&#39;analisi quantitativa diretto di migliaia di cellule in una popolazione eterogenea in un breve tempo 9, 10. Qui, effettuando un confronto side-by-side di analisi citofluorimetrica-BiFC e co-IP tradizionale, dimostriamo che i due metodi forniscono dati comparabili, tuttavia, il flusso di analisi BiFC citometria richiede meno tempo e utilizza meno materiale che potrebbe essere più utile quando le cellule di interesse sono limitati.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Dulbecco&#8217; s Aquila modificata&#8217; s media (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Streptomicina (penna/streptococco), 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-bandiera</td><td>Sigma</td><td>M2, F1804</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-HA</td><td>Covance</td><td>16B12, MMS-101R</td><td></td></tr><tr><td>&#945;-tubulina</td><td>Sigma</td><td>DM1A, T9026</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFP</td><td>Clontech</td><td>632569</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari, coltura tissutale a 6 pozzetti trattata</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>cellule HEK 293T ATCC</td><td></td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione plasmidico Maxiprep, alta velocità</td><td>Qiagen</td><td>12663</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#8217; s Soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS), sterile 1x</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA, 0,05% (p/v)</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Provette in polistirene a fondo tondo per colorazione FACS</td><td>BD Biosciences</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S74337MF</td><td></td></tr><tr><td>Reagente antisbiadimento all'oro prolungato con DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P-36931</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio Superfrost plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest vetro di copertura premium</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5P</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>CO2 air-jacketed Incubatore</td><td>NuAIR DH autoflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale LSM510 META</td><td>Carl Zeiss, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unità di trasferimento e elettroforesi</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyan ADP Citometro a flusso</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;analisi citofluorimetrica di bimolecular complementation fluorescenza: a high throughput metodo quantitativo per studiare l&#39;interazione proteina-proteina

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Tra i metodi per studiare l&#39;interazione proteina-proteina all&#39;interno delle cellule, bimolecular complementazione fluorescenza (BiFC) è relativamente semplice e sensibile. BiFC è basato sulla produzione di fluorescenza con due frammenti non fluorescenti di una proteina fluorescente (Venere, una variante Proteina Fluorescente Giallo, è usato qui). Non fluorescenti frammenti Venus (VN e VC) sono fusi a due proteine ​​interagenti (in questo caso, AKAP-Lbc e PDE4D3), cedendo fluorescenza dovuto all&#39;interazione VN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3 e la formazione di una proteina fluorescente funzionale all&#39;interno delle cellule. BiFC fornisce informazioni sulla localizzazione subcellulare di complessi proteici e la forza delle interazioni proteina basati sull&#39;intensità di fluorescenza. Tuttavia, l&#39;analisi BiFC utilizzando microscopia a quantificare la forza di interazione proteina-proteina è lunga e alquanto soggettiva causa di eterogeneità nell&#39;espressione della proteina e di interazione. Con flusso citometria accoppiamentoanalisi con metodologia BiFC, il segnale di interazione proteina-proteina fluorescente BiFC può essere misurata con precisione per una grande quantità di cellule in breve tempo. Qui, dimostriamo una applicazione di questa metodologia per mappare le regioni in PDE4D3 che sono necessari per l&#39;interazione con AKAP-Lbc. Questa metodologia throughput elevato può essere applicata a fattori di screening che regolano l&#39;interazione proteina-proteina.

AKAP-Lbc e PDE4D3 costrutti (Figura 1B) sono state fuse a VN e frammenti VC, rispettivamente. Interazione di AKAP-Lbc e PDE4D3 risultati in funzionale YFP fluorescenza (Figura 1A). Qui usiamo il metodo BiFC per mappare i siti AKAP-LBC-vincolanti in PDE4D3. Regione a monte conservata 1 (UCR1), regione a monte conservato 2 (UCR2) e regione catalitica (CAT) sono conservati tra PDE4 proteine ​​della famiglia, quindi, tutta la lunghezza (FL), UCR1 e UCR2 più CAT sono stati utilizzati per lo ...

L&#39;analisi citofluorimetrica di bimolecular complementazione fluorescenza fornisce un alto metodo quantitativo di throughput per studiare l&#39;interazione proteina-proteina. Questa metodologia può essere applicata a siti di legame della proteina di mappatura e per lo screening di fattori che regolano l&#39;interazione proteina-proteina.

L&#39;analisi citofluorimetrica di bimolecular Complementation Fluorescenza: A High Throughput Metodo quantitativo per studiare l&#39;interazione proteina-proteina

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

L'obiettivo generale di questa procedura è mappare i siti di interazione tra ACAP LBC e PDE4D3. Ciò avviene misurando l'intensità media di fluorescenza della complementazione della fluorescenza biomolecolare o del BC mediante citometria a flusso. A tal fine, le cellule vengono trasfettate con frammenti di ACAP LBC e PDE4D3 fusi alla porzione terminale N o C della proteina reporter fluorescente.Successivamente, viene eseguita la citometria a flusso Venus per valutare la fluorescenza nel caso in cui i frammenti proteici interagiscano, completando così la proteina Venus e generando fluorescenza. Se i frammenti proteici non interagiscono, nessuna fluorescenza viene rilevata. Viene inoltre eseguita un'analisi complementare del sangue mediante western blot per determinare i livelli relativi di espressione proteica.La forza delle interazioni proteina-proteina viene quindi calcolata normalizzando l'intensità media della fluorescenza YFP con i livelli di espressione proteica. I dati ottenuti indicano che il legame di PDE 43 ad ACAP LBC è mediato da più regioni all'interno di PDE 43, principalmente attraverso la regione conservata a monte uno o UCR uno. I principali vantaggi di questa tecnic

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La localizzazione subcellulare delle proteine ​​è importante nel determinare la regolazione spazio-temporale di segnalazione cellulare. Qui, descriviamo biomolecolare complementazione fluorescenza (BiFC) come un metodo semplice per il monitoraggio delle interazioni spaziali delle proteine ​​all'interno della cellula.

Bimolecolari complementazione fluorescenza

Abbiamo sviluppato una tecnica per testare interazioni proteina-proteina in pianta. Una proteina fluorescente gialla (YFP) è divisa in due frammenti non si sovrappongono. Ogni frammento viene clonato in-frame ad un gene di interesse attraverso il sistema Gateway, consentendo l'espressione di proteine ​​di fusione. Ricostituzione del segnale YFP si verifica solo quando le proteine ​​interagiscono inchiesta.

Rilevamento delle interazioni proteiche in pianta utilizzando un gateway compatibile complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC) Sistema

In questo video, abbiamo dimostrato la purificazione dell'affinità di complementazione bimolecolare, BiCAP, per rilevare e isolare specifici dimeri proteici utilizzando anticorpi a dominio singolo specifici per la conformazione.

Purificazione di affinità di complementazione bimolecolare per isolare due proteine interagenti

Formazione di complessi proteici in vivo può essere visualizzato da bimolecular fluorescenza complementazione. Partner di interazione sono fusi a parti complementari tag fluorescenti e transitoriamente espressi in foglie di tabacco, risultando in un segnale fluorescente ricostituito upon vicinanza delle due proteine.

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Descriviamo una tecnica per misurare contemporaneamente la cinetica di legame del singolo recettore-ligando regolata dalla forza e l'imaging in tempo reale della segnalazione del calcio in un singolo linfocita T.

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aritmie cardiache ereditarie sono spesso causate da mutazioni che alterano la consegna di superficie di uno o più canali ionici. Qui, ci adattiamo citometria a flusso saggi di fornire una quantificazione della espressione proteica totale e superficie cellulare relativa dei canali ionici ricombinanti espressi in TSA-201 cellule.

Determinazione del relativo cellulari di superficie e di espressione totale di canali ionici ricombinante in citometria a flusso

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Dissezione multiproteici segnalazione di purificazione di affinità di complementazione bimolecolare (BiCAP)

Questo protocollo descrive un approccio di basato su spettroscopia di fluorescenza fluttuazione per indagare le interazioni tra proteine che mediano interazioni cellula-cellula, cioè proteine localizzate nelle giunzioni delle cellule, direttamente nelle cellule viventi. Forniamo le linee guida dettagliate sulla calibrazione dello strumento, acquisizione dati e analisi, comprese le correzioni al fonti possibili manufatto.

Un'analisi di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione delle interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula

Questo articolo descrive un protocollo di citometria di flusso basato su FRET per quantificare l'autoassemblaggio delle proteine nelle cellule S. cerevisiae e HEK293T.

Rilevamento e caratterizzazione dell'autoassemblaggio proteico in vivo da parte della Cytometria di flusso

Qui, descriviamo una serie di metodi per caratterizzare l'interazione delle proteine con membrane di cellule o microvescicole.

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Questo protocollo combina la fotometria di massa con un nuovo sistema microfluidico per studiare le interazioni proteina-proteina a bassa affinità. Questo approccio si basa sulla rapida diluizione di complessi altamente concentrati in soluzione, che consente misurazioni a bassa affinità e amplia l'applicabilità della fotometria di massa.

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