L'analisi citofluorimetrica di bimolecular Complementation Fluorescenza: A High Throughput Metodo quantitativo per studiare l'interazione proteina-proteina

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di mappare i siti di interazione di ACAP LBC con la PDE quattro D tre. Misurando l'intensità media della fluorescenza di biomolecolare, fluorescenza, complementazione o BC utilizzando la citometria a flusso. Per fare ciò, le cellule vengono trasfettate con ACAP LBC e PDE quattro frammenti D tre fusi alla porzione terminale N o C della proteina reporter fluorescente.

Viene quindi eseguita la citometria a flusso di Venere per valutare la fluorescenza se i frammenti proteici interagiscono con Venere è completata e la fluorescenza. Se i frammenti proteici non interagiscono, non viene rilevata alcuna fluorescenza. L'analisi del sangue occidentale complementare viene eseguita per determinare i livelli relativi di espressione proteica.

La forza delle interazioni proteina-proteina viene quindi calcolata normalizzando l'intensità media della fluorescenza YFP con i livelli di espressione proteica. I dati risultanti indicano che il legame della PDE 43 all'ACAP LBC è mediato da più regioni all'interno della PDE 43, principalmente attraverso la prima regione conservata a monte o UCR one. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la co-immunoprecipitazione e la BP C al microscopio o che è relativamente semplice, è sensibile e facilita lo screening rapido di un gran numero di cellule.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle interazioni proteina-proteina, può anche essere utilizzato per lo screening dei fattori che regolano le interazioni proteina-proteina per la scoperta di farmaci. Generalmente gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché è necessario determinare una risposta lineare B. Un'espressione di costrutto dovrebbe essere simile in modo che i risultati utilizzino diversi frammenti proteici possano essere confrontati tra loro.

Negli esperimenti qui descritti, le cellule sono trasfettate in cot con il frammento terminale N del derivato YFP, Venere fusa con ACAP LBC a lunghezza intera e il frammento terminale C di Venere fuso con una delle seguenti PDE E 43 a lunghezza intera, la regione conservata a monte uno UCR uno della PDE E 43 o la regione conservata a monte due più la regione catalitica UCR due più CAT di PDE 43 il giorno prima della trasfezione in Sei. Bene, le piastre di coltura tissutale seminano 1,2 volte 10 al quinto HEC 2 9 3 cellule T per pozzetto in due millilitri di crescita completa. Seme medio, tre pozzetti di controllo più tre pozzetti per ciascuno dei test.

Il cotran incuba al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo preparatevi per la trasfezione dei costrutti di DNA plasmatico BC e del vettore CFP, che viene trasfettato in cot con i costrutti BS C come marcatore. Per ogni condizione, aggiungere la quantità appropriata di DNA a 250 microlitri di terreno privo di siero Optum M1.

In una provetta sterile, una provetta è sufficiente per trasfettare tre pozzetti. Quindi aggiungere tre microlitri di transito LT, un reagente per ogni microgrammo, alla miscela di DNA diluita e pipettare delicatamente per mescolare, incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione a 250 microlitri di miscela di trasfezione goccia a goccia sulle cellule, quindi incubare al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius, 24 ore.

Dopo il controllo della trasfezione della fluorescenza al microscopio a epifluorescenza, le cellule devono esprimere la fluorescenza gialla per il segnale BC e la fluorescenza CFP per riportare l'efficienza della trasfezione. Per preparare le cellule per l'analisi citofluorimetrica, lavarle prima con due millilitri di PBS ghiacciato, quindi staccare le cellule aggiungendo 250 microlitri di tripsina allo 0,05%, incubare per due-cinque minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, utilizzando un microscopio, verificare la presenza di distacco cellulare.

Una volta che le cellule si sono staccate, neutralizzare la tripsina con un millilitro di DMEM. Quindi, trasferire un millilitro di cellule in una provetta per microcentrifuga, quindi trasferire 0,25 millilitri di cellule in una seconda provetta per microcentrifuga. Girare i tubi a 500 formaggi per cinque minuti.

Il campione da 250 microlitri sarà ulteriormente elaborato per la citometria a flusso. Mettere da parte il campione da un millilitro sul ghiaccio per l'analisi del sangue occidentale, che deve essere eseguita in parallelo seguendo la centrifuga Resus. Sospendi le cellule in 250 microlitri di tampone fax e posizionale su celle di ghiaccio può anche essere fissato in aldeide paraforma all'1% in PBS Se l'analisi della citometria a flusso non sarà immediata qui, la citometria a flusso viene eseguita utilizzando un ciano Beckman Coulter un DP dotato di laser a stato solido a 488 nanometri 405 nanometri e 642 nanometri Il software summit viene utilizzato per l'acquisizione e l'analisi dopo aver calibrato il citometro a flusso utilizzando perle standard, tracciare la dispersione in avanti o FSC rispetto alla SSC a dispersione laterale su scala lineare e l'andatura sulla popolazione di cellule vive.

Successivamente, traccia SSC rispetto alla tensione, all'ampietrusità dell'impulso e all'andatura sulla popolazione di cellule vive non aggregate. Quindi tracciare FSC su scala lineare rispetto alla fluorescenza CFP a 405 FL sei su questo strumento su scala logaritmica e andatura sulle cellule CFP positive vive non aggregate. Infine, tracciare FSC su scala lineare rispetto alla fluorescenza YFP a 488 nanometri FL uno su questo strumento su scala logaritmica per visualizzare l'intensità BC.

Quindi, eseguire il campione doppio negativo Y-F-P-C-F-P e regolare il tubo moltiplicatore di foto F-S-C-S-S-C FL one e FL six o la tensione PMT per impostare la soglia per ciascun segnale. Successivamente, esegui sia i campioni positivi singoli YFP che CFP per la futura compensazione offline. Assicurati di acquisire almeno 10.000 eventi riservati.

Infine, raccogliere i dati per i campioni sperimentali dopo la raccolta dei dati. Impostare il protocollo di analisi come da acquisizione con la propagazione con gate one nel dot plot FS CSC per cellule vive. Gate two in FSC pulse con dot plot del gate uno per cellule vive non aggregate e gate tre in ccfp FSC dot plot del gate due per cellule vive positive ccfp non aggregate.

Dopo aver compensato il segnale YFP e CCFP nel dot plot Y fp CFP utilizzando le singole celle positive YFP e CFP, determiniamo le linee di cutoff per le celle positive CFP e YFP. Esportare l'intensità di fluorescenza media YFP o MFI delle cellule positive CFP per eccellere per la tracciatura dei dati, quindi normalizzare in Excel Y-F-P-M-F-I al livello di espressione di ACAP, LBC, PDE E 43 e controllo del carico di alfa tubulina come determinato dal western blotting per determinare l'intervallo lineare dell'intensità di fluorescenza media YFP. La CFP è stata sezionata in cot con VN ACAP L BBC e quantità variabili di VC PDE E 43 in cellule HEC 2 93 e l'interazione è stata valutata utilizzando la citometria a flusso bif come descritto in questo video, questo grafico mostra la variazione relativa del fold nell'espressione di VC PDE E 43 in funzione di VC PDE E 43 trasfettato.

L'intensità media di fluorescenza di Venere nelle cellule CFP positive indicata dai quadrati blu era correlata con l'espressione di VCDE 43 ed era coerente con i livelli di espressione determinati dall'analisi dell'immagine di un western blot, che è indicato dai triangoli rossi. Un'intensità di fluorescenza media simile a quella della CFP è stata osservata tra i campioni, come indicato dai quadrati verdi, ed è stata utilizzata come controllo negativo per limitare le variazioni cellulari. Questi risultati convalidano l'uso della citometria a flusso per quantificare l'interazione ACAB, LB, C, PDE 43 misurando l'intensità media di fluorescenza di BS e e e allo stesso tempo determinando la quantità corretta di costrutti BIC utilizzati per lo screening per mappare i siti di legame di ACAP LBC all'interno della PDE E 43 Analisi BIC dell'interazione ACAP LBC con la PDE E 43 fl.

La regione UCR uno della PDE 43 e le regioni UCR due e CAT della PDE 43 sono state valutate utilizzando questo metodo, come mostrato qui. L'espressione di vn ACAP, LBC e VC PDE 43, UCR two plus CAT determina un segnale BC più basso rispetto a VC PDE 43, FL e VC PDE 43 UCR, un'espressione proteica simile è stata osservata in tutti i campioni di flusso e la fluorescenza media è stata normalizzata ai livelli di espressione relativi di ACAP, LBC, PDE 43 e alfa tubulina. Pertanto, la normalizzazione B-C-M-F-I indica che non vi è alcuna differenza nell'intensità di fluorescenza tra ACAP LBC PDE 43 FL e ACAP LBC PDE 43 UCR R one, ma un segnale molto più basso per ACAP LBC PDE 43 UCR two più l'interazione CAT.

Questi risultati suggeriscono che ci sono più regioni nella PDE 43 che interagiscono con ACAP LBC e che la PDE 43 UCR R uno è la regione primaria di interazione con ACAP LBC. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come studiare l'interazione proteina e proteina mediante analisi di citometria a flusso di BP C.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di determinare la quantità corretta di costrutto BP C utilizzato per ottenere un'espressione proteica simile e una risposta BP C lineare. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il peptide o il rischio, al fine di determinare di quali amminoacidi all'interno della PDE 40 D 3 sono responsabili.

Le sue interazioni ACAP RBC.