L'analisi citofluorimetrica di bimolecular Complementation Fluorescenza: A High Throughput Metodo quantitativo per studiare l'interazione proteina-proteina

L'obiettivo generale di questa procedura è mappare i siti di interazione tra ACAP LBC e PDE4D3. Ciò avviene misurando l'intensità media di fluorescenza della complementazione della fluorescenza biomolecolare o del BC mediante citometria a flusso. A tal fine, le cellule vengono trasfettate con frammenti di ACAP LBC e PDE4D3 fusi alla porzione terminale N o C della proteina reporter fluorescente.

Successivamente, viene eseguita la citometria a flusso Venus per valutare la fluorescenza nel caso in cui i frammenti proteici interagiscano, completando così la proteina Venus e generando fluorescenza. Se i frammenti proteici non interagiscono, nessuna fluorescenza viene rilevata. Viene inoltre eseguita un'analisi complementare del sangue mediante western blot per determinare i livelli relativi di espressione proteica.

La forza delle interazioni proteina-proteina viene quindi calcolata normalizzando l'intensità media della fluorescenza YFP con i livelli di espressione proteica. I dati ottenuti indicano che il legame di PDE 43 ad ACAP LBC è mediato da più regioni all'interno di PDE 43, principalmente attraverso la regione conservata a monte uno o UCR uno. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la co-immunoprecipitazione e il BP C mediante microscopio, sono la relativa semplicità, la sensibilità e la facilità di eseguire lo screening rapido di un elevato numero di cellule.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle interazioni proteina-proteina, può anche essere utilizzato per identificare fattori che regolano tali interazioni nell'ambito della scoperta di farmaci. In genere, le persone alle prime armi con questa tecnica incontrano difficoltà perché è necessario determinare una risposta B lineare. L'espressione del costrutto dovrebbe essere simile, in modo che i risultati ottenuti con frammenti proteici diversi possano essere confrontati tra loro.

Negli esperimenti descritti qui, le cellule vengono cotrasfettate con il frammento N-terminale del derivato YFP, Venus fuso alla lunghezza intera di ACAP LBC e il frammento C-terminale di Venus fuso a uno dei seguenti: la lunghezza intera di PDE E 43, la regione conservata a monte uno (UCR uno) di PDE E 43 o la regione conservata a monte due più la regione catalitica (UCR R due più CAT) di PDE 43 il giorno precedente la trasfezione in piastre da coltura tissutale a sei pozzetti, seminando 1,2 × 10⁵ cellule HEC 293 T per pozzetto in due millilitri di terreno di crescita completo. Seminare tre pozzetti di controllo più tre pozzetti per ciascuna delle prove.

Incubare Cotran al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, prepararsi per la trasfezione dei costrutti di DNA plasmatico BC e del vettore CFP, che viene cotrasfettato insieme ai costrutti BS C come marcatore. Per ogni condizione, aggiungere la quantità appropriata di DNA a 250 microlitri di mezzo Optum M1 privo di siero.

In un tubo sterile, un tubo è sufficiente per trasfettare tre pozzetti. Aggiungere quindi tre microlitri del reagente Transit-LT1 per ogni microgrammo alla miscela di DNA diluito e pipettare delicatamente per mescolare; incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, aggiungere goccia a goccia 250 microlitri di miscela di trasfezione alle cellule, quindi incubare a 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per 24 ore.

Dopo la trasfezione, verificare la fluorescenza al microscopio a fluorescenza episcopica: le cellule devono esprimere fluorescenza gialla per il segnale BC e fluorescenza CFP per rilevare l'efficienza di trasfezione. Per preparare le cellule all'analisi citofluorimetrica, lavarle prima con due millilitri di PBS freddo, quindi staccare le cellule aggiungendo 250 microlitri di tripsina 0,05% e incubare per due-cinque minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, utilizzando un microscopio, verificare lo stacco delle cellule.

Dopo che le cellule si sono staccate, neutralizzare la tripsina con un millilitro di DMEM. Successivamente, trasferire un millilitro di cellule in una microprovetta, quindi trasferire 0,25 millilitri di cellule in una seconda microprovetta. Centrifugare le provette a 500 ×g per cinque minuti.

Il campione di 250 microlitri verrà ulteriormente processato per la citometria a flusso. Mettere da parte il campione di un millilitro su ghiaccio per l'analisi del sangue western, che deve essere eseguita in parallelo seguendo la spin Resus. Sospendere le cellule in 250 microlitri di buffer fax e posizionarle sul ghiaccio; le cellule possono anche essere fissate con paraformaldeide al 1% in PBS se l'analisi mediante citometria a flusso non sarà immediata. Qui, la citometria a flusso viene eseguita utilizzando un Beckman Coulter Cyan ADP dotato di laser a stato solido a 488 nanometri, 405 nanometri e 642 nanometri. Il software Summit viene utilizzato per l'acquisizione e l'analisi, dopo aver calibrato il citofluorimetro mediante perline standard. Riportare lo scatter anteriore (FSC) contro lo scatter laterale (SSC) su scala lineare e delimitare la popolazione di cellule vitali.

Successivamente, tracciare SSC in funzione della larghezza dell'impulso di tensione e della modalità di selezione sulla popolazione di cellule vive non aggregate. Quindi, tracciare FSC su scala lineare in funzione della fluorescenza CFP a 405 FL sei su questo strumento su scala logaritmica e della modalità di selezione sulle cellule vive CFP positive non aggregate. Infine, tracciare FSC su scala lineare in funzione della fluorescenza YFP a 488 nanometri FL uno su questo strumento su scala logaritmica per visualizzare l'intensità di BC.

Successivamente, eseguire il campione doppio negativo Y-F-P-C-F-P e regolare il tubo fotomoltiplicatore (PMT) del canale FL1 e FL6 di F-S-C-S-S-C per impostare la soglia per ciascun segnale. Successivamente, eseguire entrambi i campioni singoli positivi per YFP e CFP per la compensazione futura offline. Assicurarsi di acquisire almeno 10.000 eventi selezionati.

Infine, raccogliere i dati per i campioni sperimentali dopo la raccolta dati. Impostare il protocollo di analisi secondo l'acquisizione, propagando il gate uno nel dot plot FS CSC per le cellule vitali. Gate due nel tracciato a impulsi FSC con dot plot del gate uno per le cellule vitali non aggregate e gate tre nel dot plot ccfp FSC del gate due per le cellule vitali positive a ccfp non aggregate.

Dopo aver compensato il segnale di YFP e CCFP nel diagramma a dispersione Yfp CFP utilizzando cellule singolarmente positive per YFP e CFP, determiniamo le linee di cutoff per le cellule positive a CFP e YFP. Esportare il valore medio di intensità di fluorescenza (MFI) di YFP delle cellule positive per CFP in Excel per la rappresentazione grafica dei dati; successivamente, in Excel, normalizzare l'MFI di YFP al livello di espressione di ACAP LBC PDE E 43 e al controllo di caricamento alfa-tubulina, determinato mediante immunoblotting, al fine di stabilire il range lineare dell'intensità media di fluorescenza di YFP. CFP è stato cotrasfettato con VN ACAP L BBC e quantità variabili di VC PDE E 43 in cellule HEC 2 93, e l'interazione è stata valutata mediante citometria a flusso biforcazione come descritto in questo video; questo grafico mostra la variazione relativa dell'espressione di VC PDE E 43 in funzione della quantità di VC PDE E 43 trasfettata.

L'intensità media della fluorescenza di Venus nelle cellule positive per CFP, indicata dai quadrati blu, ha mostrato una correlazione con l'espressione di VCDE 43 ed è risultata coerente con i livelli di espressione determinati mediante analisi dell'immagine di un western blot, indicati dai triangoli rossi. Un'intensità media di fluorescenza simile per CFP è stata osservata tra i campioni, come indicato dai quadrati verdi, ed è stata utilizzata come controllo negativo per limitare le variazioni cellulari. Questi risultati confermano l'utilizzo della citometria a flusso per quantificare l'interazione tra ACAB LB C PDE 43 misurando l'intensità media della fluorescenza di BS e, allo stesso tempo, determinando la quantità appropriata di costrutti BIC impiegati per lo screening volto a mappare i siti di legame di ACAP LBC all'interno di PDE E 43. L'analisi BIC dell'interazione tra ACAP LBC e PDE E 43 a lunghezza intera (fl).

La regione UCR uno della PDE 43 e le regioni UCR due e CAT della PDE 43 sono state valutate utilizzando questo metodo, come mostrato qui. L'espressione di vn ACAP LBC e VC PDE 43 UCR due più CAT determina un segnale BC più basso rispetto a VC PDE 43 FL e VC PDE 43 UCR uno; livelli simili di espressione proteica sono stati osservati in tutti i campioni in flusso e l'intensità media della fluorescenza è stata normalizzata rispetto ai livelli di espressione relativi di ACAP LBC PDE 43 e alfa-tubulina. Pertanto, il valore B-C-M-F-I normalizzato indica che non vi è alcuna differenza nell'intensità di fluorescenza tra ACAP LBC PDE 43 FL e ACAP LBC PDE 43 UCR uno, ma un segnale notevolmente più basso per l'interazione ACAP LBC PDE 43 UCR due più CAT.

Questi risultati suggeriscono che esistono diverse regioni nella PDE 43 che interagiscono con l'ACAP LBC e che l'UCR R della PDE 43 è la regione principale di interazione con l'ACAP LBC. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come studiare l'interazione tra proteine mediante analisi di citometria a flusso del BP C. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di determinare la quantità corretta di costrutto BP C da utilizzare per ottenere un'espressione proteica simile e una risposta lineare del BP C. Dopo aver seguito questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come l'uso di peptidi o il rischio, al fine di determinare quali amminoacidi all'interno della PDE 40 D tre sono responsabili.

Le sue interazioni tra ACAP e globuli rossi.