Name: Lanalisi citofluorimetrica di bimolecular Complementation Fluorescenza: A High Throughput Metodo quantitativo per studiare linterazione proteina-proteina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Scopri un metodo ad alto rendimento per mappare i siti di interazione proteina-proteina utilizzando BiFC e citofluorimetria. Questa tecnica quantitativa analizza le interazioni tra AKAP-Lbc e PDE4D3 in cellule viventi HEK293T.

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Ringraziamo il laboratorio O&#39;Bryan a UIC per la valutazione sperimentale critica e discussione. Questo lavoro è stato sostenuto da American Heart Association Concessione 11SDG5230003 di GKC e National Center for Advancing Science Translational - Centro UIC per Scienze Cliniche e traslazionale sovvenzione UL1TR000050.

1. Trasfezione delle cellule <ol><li> Cellule piastra il giorno prima della transfezione, placcatura meno cellule per immunofluorescenza. <ol><li> Per immunofluorescenza: in un 6-pozzetti, cappotto di vetro coprioggetto (1 per bene) con il 0,02% di gelatina a 37 ° C per almeno 4 ore, lavare una volta con il mezzo, e per ogni bene, piastra 1 x 10 5 HEK 293T cellule in 2 ml di mezzo di crescita completo [mezzi di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) più 10% FBS]. </li><li> Per le analisi di citometria a flusso e Western Blot: piatto 1,2 x 10 5 HEK 293T cellule / pozzetto in 2 ml di terreno di coltura completo in 6 pozzetti (0,3 x 10 5 HEK 293T cellule in 0,5 ml di mezzo di coltura completo per pozzetto in piastra da 24 pozzetti ). </li></ol></li><li> Preparare DNA per trasfezione secondo il protocollo di produzione: Effectene (Qiagen) viene utilizzato per l&#39;immunofluorescenza. Transit-LT1 (Mirus) è utilizzato per le analisi di flusso citometria e Western Blot. Quantità di DNA utilizzato è elencato di seguito. <table border="1"><tbody><tr><td&gt; </td><td> 24-pozzetti (ng) </td><td> 6 pozzetti (ng) </td></tr><tr><td> CFP-vettore </td><td> 10 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> VN N-AKAP-Lbc </td><td> 200 </td><td> 1000 </td></tr><tr><td> VC N-PDE4D3-FL (full-length PDE4D3) </td><td> 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> VC-N-PDE4D3 UCR1 (un frammento N-terminale PDE4D3 contenente il dominio UCR1) </td><td></td><td> 100 </td></tr><tr><td> VC N-PDE4D3-UCR2 + CAT (un frammento C-terminale PDE4D3 contenente i domini UCR2 e catalitici) </td><td></td><td> 100 </td></tr></tbody></table> Trasfezione usando Effectene (6 pozzetti): <ol><li> Aggiungi quantità indicata di DNA plasmidico + 4 pl enhancer a 100 microlitri di buffer CE, mescolare e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 5 Effectene ml, mescolare e incubare per 10 minuti atemperatura ambiente. Aggiungere goccia a goccia per le cellule. </li></ol> Trasfezione utilizzando Transit-LT1 (6-well/24-well): <ol><li> Aggiungere quantità indicata di DNA plasmidico a 250 μl/50 pl di Opti-MEM I mezzo privo di siero in una provetta sterile. </li><li> Aggiungere il reagente Transit-LT1 alla miscela di DNA diluito e pipettare delicatamente per mescolare. (Transito-LT1 reagente: rapporto di DNA è di 3 ml di transito LT1-reagente per 1 mg di DNA). </li><li> Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente ed aggiungere goccia a goccia alle cellule. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione delle cellule per la citometria a flusso, Western Blot, e immunofluorescenza <ol><li> 24 ore dopo la trasfezione, controllare la fluorescenza sotto microscopio a epifluorescenza prima che le cellule raccolta. </li><li> Preparazione delle cellule per l&#39;analisi di citometria a flusso: <ol><li> Lavare le cellule con 0,5 ml / 2 ml PBS freddo per lastre 24-well/6-well. </li><li> Staccare le cellule utilizzano 50 μl/250 microlitri 0,05% tripsina. </li><li> Neutralizzare la tripsina con 200 pl / 1 ml di DMEM. </li><li> Collect 250 cellule microlitri (sia per piastra da 24 pozzetti e 6 pozzetti) per centrifugazione a 500 xg per 5 min, utilizzare i restanti cellule (1 ml) per l&#39;analisi Western blot. </li><li> Risospendere le cellule in 250 microlitri tampone FACS [PBS + 0,5% (w / v) di BSA + 2 mM EDTA], negozio su ghiaccio per analisi citofluorimetrica. Le celle possono anche essere fissati in paraformaldeide 1% (in PBS) se l&#39;analisi di citometria a flusso non sarà immediata. </li></ol></li><li> Preparazione delle cellule per l&#39;analisi Western Blot: condotta in parallelo con la preparazione delle cellule per l&#39;analisi di citometria a flusso. <ol><li> Lavare le cellule 1x con 2 ml di PBS ghiacciato, lisare cellule aggiungendo 100 pl di tampone di lisi cellulare [10 mM tampone fosfato di sodio, pH 6,95, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1% Triton X-100] . </li><li> Raccogliere lisato cellulare mediante centrifugazione per 10 min a 21.000 xga 4 ° C. </li><li> Quantificare la concentrazione di proteine ​​mediante test proteina Bradford, caricare la stessa quantità di proteine ​​per ogni corsia per SDS-PAGE, e trasferimento in nitrocellulosa per immunoblotting. </li></ol&gt; </li><li> Preparazione delle cellule per immunofluorescenza. <ol><li> Risciacquare cellule 3x con 2 ml di PBS, fissare le cellule in 1 ml di 3,7% paraformaldeide (in PBS) per 10 min a temperatura ambiente, poi lavare 3x con 2 ml di PBS per 5 min. </li><li> Montare coprire scivolare su un vetrino, con mezzo di montaggio. Sigillare i bordi coprioggetto con smalto per unghie, se necessario. </li><li> Conservare i vetrini a 4 ° C prima dell&#39;esame. </li></ol></li></ol> 3. Citometria a flusso e microscopia di immunofluorescenza <ol><li> Citometria di flusso viene eseguita usando un Beckman Coulter Ciano ADP, dotato di 488 nm, 405 nm e 642 nm laser allo stato solido. Software Summit è utilizzato per l&#39;acquisizione e l&#39;analisi. <ol><li> Calibrare citofluorimetro utilizzando perline standard. </li><li> Diagramma a dispersione in avanti (FSC) / Orientabilità scatter (SSC) su una scala lineare per gating popolazione di cellule vive. </li><li> Trama larghezza di impulso FSC / tensione di gating non aggregata popolazione di cellule vive. </li><li> Trama count/FL6 (PCP fluorescence, 405 nm) su scala logaritmica per gating non aggregati cellule CFP-positive vivi. </li><li> Trama count/FL1 (YFP fluorescenza, 488 nm) su una scala logaritmica per l&#39;intensità BiFC. </li><li> Esegui campioni YFP-CFP-Double Negative, regolare FSC, SSC, FL1 e FL6 tubo foto moltiplicatore (PMT) per impostare la tensione di soglia per ogni segnale. </li><li> Esegui unico positivo (entrambi + + YFP e CFP) i campioni per il futuro di compensazione off-line </li><li> Acquisire almeno 10.000 eventi recintata (+ cellule PCP vivo non aggregati) per l&#39;analisi. </li></ol></li><li> Microscopia ad immunofluorescenza viene eseguita utilizzando un Zeiss LSM 510 microscopio confocale. Nota: è importante mantenere tutte le impostazioni (come ad esempio lo zoom, foro stenopeico, il guadagno del rivelatore, amplificatore offset, dimensione del frame, velocità di scansione, scansione media, e la potenza del laser) coerente tra campioni per una corretta comparazione di tutti i dati. </li></ol> 4. Analisi dei dati (effettuata utilizzando il software Summit) <ol><li> Impostare il protocollo di analisi simile a quella per Acquisizione con una corretta gating: Gate 1 in FSC / SSC dot plot per le cellule vive. Gate 2 in FSC / larghezza di impulso di Gate 1 per le cellule vive non aggregati. Gate 3 nel conteggio / CFP di Gate 3 per CFP non aggregata + cellule vive. </li><li> Compensare YFP e CFP segnale usando + e + PCP cellule positive singole YFP. </li><li> Rideterminare le linee di taglio per le cellule CFP / YFP-positivo. </li><li> Export YFP fluorescenza media (MFI) di PCP + celle in Excel per i dati-stampa. </li><li> Normalizzare YFP IFM ai livelli di espressione di AKAP-LBC PDE4D3, e il caricamento di controllo α-tubulina, come determinato da Western Blot. </li></ol>

<ol><li>Collura, V., Boissy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+protein-protein+complexes+to+interactomics%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell+Biochem%22%5BJournal%5D)">From protein-protein complexes to interactomics.</a> Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).</li>
<li>Stumpf, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+size+of+the+human+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Estimating the size of the human interactome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).</li>
<li>Shekhawat, S. S., Ghosh, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-protein+systems%3A+beyond+binary+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).</li>
<li>Dwane, S., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+used+to+study+how+protein+complexes+are+assembled+in+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng.+Bugs%22%5BJournal%5D)">Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades.</a> Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).</li>
<li>Piehler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+methodologies+for+measuring+protein+interactions+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).</li>
<li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).</li>
<li>Wong, K. A., O'Bryan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2643(2011).</li>
<li>Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+general+principles+and+applications+to+selected+studies+in+tumor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Adv.+Surg.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology.</a> Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).</li>
<li>Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+of+GLUT4+translocation+to+the+plasma+membrane+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (45), e2429(2010).</li>
<li>Smith, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic confocal microscopy.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11(2008).</li>
<li>Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+drug+discovery+with+contextual+assays+and+cellular+systems+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis.</a> Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).</li>
<li>Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+pharmacology+of+G+protein-coupled+receptor+signaling+complexes+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation.</a> Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

BiFC è un metodo semplice e sensibile per studiare l&#39;interazione proteina-proteina. Questo metodo non può essere usato per identificare nuove interazioni proteina-proteina, tuttavia, è particolarmente conveniente per confermare l&#39;interazione proteina-proteina all&#39;interno delle cellule e per studiare le proprietà funzionali, quali localizzazione subcellulare dei complessi proteici, mappatura dei siti di interazione proteina-proteina, e per lo screening di piccole molecole / peptidi che possono modulare l&#39;...

650.000 interazioni proteina-proteina sono stimati ad esistere nel interattoma umano, gioca un ruolo critico nel mantenimento della normale funzionalità delle cellule 1,2. Oltre co-immunoprecipitazione (co-IP), il gold standard per studiare l&#39;interazione proteina-proteina dal lisato cellulare, parecchi frammenti proteici saggi di complementazione (PCA) sono stati sviluppati per migliorare la sensibilità nella rilevazione di interazione proteina-proteina all&#39;interno delle cellule 3. Le tecniche includono Förster Resonance Energy Transfer (FRET), bioluminescenza Resonance Energy Transfer (BRET), e bimolecular complementazione fluorescenza (BiFC) 4,5. BiFC si basa sull&#39;associazione facilitato dei due frammenti di una proteina fluorescente (qui usiamo Venere; una variante YFP) che sono ognuno fuso ad un potenziale partner proteine ​​interagenti (in questo esempio si usa AKAP-Lbc e PDE4D3). Interazione dei due proteine ​​di interesse all&#39;interno di cellule risultati nella fluorescenza funzionali, che possono essere visualizzati da fmicroscopia luorescence utilizzando sia cellule vive o fissa 6,7,8. Rispetto ad altri APC, BiFC è sensibile e tecnicamente meno impegnativo, con la possibilità di studiare la localizzazione cellulare in cellule vive. Un grave inconveniente di questa tecnica tuttavia è che una volta formato, il complesso proteina fluorescente non può essere invertito. Quindi non è un buon metodo per studiare l&#39;interazione proteina-proteina dinamico. In questo lavoro, si usa BiFC per mappare i siti di interazione di PDE4D3 con AKAP-Lbc monitorando le intensità di fluorescenza di Venere. Rispetto ai tradizionali analisi mediante microscopia a fluorescenza, che richiede tempo e manodopera (se non effettuata con macchine ad alta velocità automatizzato), citometria a flusso fornisce un&#39;analisi quantitativa diretto di migliaia di cellule in una popolazione eterogenea in un breve tempo 9, 10. Qui, effettuando un confronto side-by-side di analisi citofluorimetrica-BiFC e co-IP tradizionale, dimostriamo che i due metodi forniscono dati comparabili, tuttavia, il flusso di analisi BiFC citometria richiede meno tempo e utilizza meno materiale che potrebbe essere più utile quando le cellule di interesse sono limitati.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Dulbecco&#8217; s Aquila modificata&#8217; s media (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Streptomicina (penna/streptococco), 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-bandiera</td><td>Sigma</td><td>M2, F1804</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-HA</td><td>Covance</td><td>16B12, MMS-101R</td><td></td></tr><tr><td>&#945;-tubulina</td><td>Sigma</td><td>DM1A, T9026</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFP</td><td>Clontech</td><td>632569</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari, coltura tissutale a 6 pozzetti trattata</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>cellule HEK 293T ATCC</td><td></td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione plasmidico Maxiprep, alta velocità</td><td>Qiagen</td><td>12663</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#8217; s Soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS), sterile 1x</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA, 0,05% (p/v)</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Provette in polistirene a fondo tondo per colorazione FACS</td><td>BD Biosciences</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S74337MF</td><td></td></tr><tr><td>Reagente antisbiadimento all'oro prolungato con DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P-36931</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio Superfrost plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest vetro di copertura premium</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5P</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>CO2 air-jacketed Incubatore</td><td>NuAIR DH autoflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale LSM510 META</td><td>Carl Zeiss, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unità di trasferimento e elettroforesi</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyan ADP Citometro a flusso</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;analisi citofluorimetrica di bimolecular complementation fluorescenza: a high throughput metodo quantitativo per studiare l&#39;interazione proteina-proteina

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Tra i metodi per studiare l&#39;interazione proteina-proteina all&#39;interno delle cellule, bimolecular complementazione fluorescenza (BiFC) è relativamente semplice e sensibile. BiFC è basato sulla produzione di fluorescenza con due frammenti non fluorescenti di una proteina fluorescente (Venere, una variante Proteina Fluorescente Giallo, è usato qui). Non fluorescenti frammenti Venus (VN e VC) sono fusi a due proteine ​​interagenti (in questo caso, AKAP-Lbc e PDE4D3), cedendo fluorescenza dovuto all&#39;interazione VN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3 e la formazione di una proteina fluorescente funzionale all&#39;interno delle cellule. BiFC fornisce informazioni sulla localizzazione subcellulare di complessi proteici e la forza delle interazioni proteina basati sull&#39;intensità di fluorescenza. Tuttavia, l&#39;analisi BiFC utilizzando microscopia a quantificare la forza di interazione proteina-proteina è lunga e alquanto soggettiva causa di eterogeneità nell&#39;espressione della proteina e di interazione. Con flusso citometria accoppiamentoanalisi con metodologia BiFC, il segnale di interazione proteina-proteina fluorescente BiFC può essere misurata con precisione per una grande quantità di cellule in breve tempo. Qui, dimostriamo una applicazione di questa metodologia per mappare le regioni in PDE4D3 che sono necessari per l&#39;interazione con AKAP-Lbc. Questa metodologia throughput elevato può essere applicata a fattori di screening che regolano l&#39;interazione proteina-proteina.

AKAP-Lbc e PDE4D3 costrutti (Figura 1B) sono state fuse a VN e frammenti VC, rispettivamente. Interazione di AKAP-Lbc e PDE4D3 risultati in funzionale YFP fluorescenza (Figura 1A). Qui usiamo il metodo BiFC per mappare i siti AKAP-LBC-vincolanti in PDE4D3. Regione a monte conservata 1 (UCR1), regione a monte conservato 2 (UCR2) e regione catalitica (CAT) sono conservati tra PDE4 proteine ​​della famiglia, quindi, tutta la lunghezza (FL), UCR1 e UCR2 più CAT sono stati utilizzati per lo ...

L&#39;analisi citofluorimetrica di bimolecular complementazione fluorescenza fornisce un alto metodo quantitativo di throughput per studiare l&#39;interazione proteina-proteina. Questa metodologia può essere applicata a siti di legame della proteina di mappatura e per lo screening di fattori che regolano l&#39;interazione proteina-proteina.

L&#39;analisi citofluorimetrica di bimolecular Complementation Fluorescenza: A High Throughput Metodo quantitativo per studiare l&#39;interazione proteina-proteina

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

L'obiettivo generale di questa procedura è mappare i siti di interazione tra ACAP LBC e PDE4D3. Ciò avviene misurando l'intensità media di fluorescenza della complementazione della fluorescenza biomolecolare o del BC mediante citometria a flusso. A tal fine, le cellule vengono trasfettate con frammenti di ACAP LBC e PDE4D3 fusi alla porzione terminale N o C della proteina reporter fluorescente.Successivamente, viene eseguita la citometria a flusso Venus per valutare la fluorescenza nel caso in cui i frammenti proteici interagiscano, completando così la proteina Venus e generando fluorescenza. Se i frammenti proteici non interagiscono, nessuna fluorescenza viene rilevata. Viene inoltre eseguita un'analisi complementare del sangue mediante western blot per determinare i livelli relativi di espressione proteica.La forza delle interazioni proteina-proteina viene quindi calcolata normalizzando l'intensità media della fluorescenza YFP con i livelli di espressione proteica. I dati ottenuti indicano che il legame di PDE 43 ad ACAP LBC è mediato da più regioni all'interno di PDE 43, principalmente attraverso la regione conservata a monte uno o UCR uno. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la co-immunoprecipitazione e il BP C mediante microscopio, sono la relativa semplicità, la sensibilità e la facilità di eseguire lo screening rapido di un elevato numero di cellule.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle interazioni proteina-proteina, può anche essere utilizzato per identificare fattori che regolano tali interazioni nell'ambito della scoperta di farmaci. In genere, le persone alle prime armi con questa tecnica incontrano difficoltà perché è necessario determinare una risposta B lineare. L'espressione del costrutto dovrebbe essere simile, in modo che i risultati ottenuti con frammenti proteici diversi possano essere confrontati tra loro.Negli esperimenti descritti qui, le cellule vengono cotrasfettate con il frammento N-terminale del derivato YFP, Venus fuso alla lunghezza intera di ACAP LBC e il frammento C-terminale di Venus fuso a uno dei seguenti: la lunghezza intera di PDE E 43, la regione conservata a monte uno (UCR uno) di PDE E 43 o la regione conservata a monte due più la regione catalitica (UCR R due più CAT) di PDE 43 il giorno precedente la trasfezione in piastre da coltura tissutale a sei pozzetti, seminando 1,2 × 10⁵ cellule HEC 293 T per pozzetto in due millilitri di terreno di crescita completo. Seminare tre pozzetti di controllo più tre pozzetti per ciascuna delle prove.Incubare Cotran al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, prepararsi per la trasfezione dei costrutti di DNA plasmatico BC e del vettore CFP, che viene cotrasfettato insieme ai costrutti BS C come marcatore. Per ogni condizione, aggiungere la quantità appropriata di DNA a 250 microlitri di mezzo Optum M1 privo di siero.In un tubo sterile, un tubo è sufficiente per trasfettare tre pozzetti. Aggiungere quindi tre microlitri del reagente Transit-LT1 per ogni microgrammo alla miscela di DNA diluito e pipettare delicatamente per mescolare; incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, aggiungere goccia a goccia 250 microlitri di miscela di trasfezione alle cellule, quindi incubare a 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per 24 ore.Dopo la trasfezione, verificare la fluorescenza al microscopio a fluorescenza episcopica: le cellule devono esprimere fluorescenza gialla per il segnale BC e fluorescenza CFP per rilevare l'efficienza di trasfezione. Per preparare le cellule all'analisi citofluorimetrica, lavarle prima con due millilitri di PBS freddo, quindi staccare le cellule aggiungendo 250 microlitri di tripsina 0,05% e incubare per due-cinque minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, utilizzando un microscopio, verificare lo stacco delle cellule.Dopo che le cellule si sono staccate, neutralizzare la tripsina con un millilitro di DMEM. Successivamente, trasferire un millilitro di cellule in una microprovetta, quindi trasferire 0,25 millilitri di cellule in una seconda microprovetta. Centrifugare le provette a 500 ×g per cinque minuti.Il campione di 250 microlitri verrà ulteriormente processato per la citometria a flusso. Mettere da parte il campione di un millilitro su ghiaccio per l'analisi del sangue western, che deve essere eseguita in parallelo seguendo la spin Resus. Sospendere le cellule in 250 microlitri di buffer fax e posizionarle sul ghiaccio; le cellule possono anche essere fissate con paraformaldeide al 1% in PBS se l'analisi mediante citometria a flusso non sarà immediata. Qui, la citometria a flusso viene eseguita utilizzando un Beckman Coulter Cyan ADP dotato di laser a stato solido a 488 nanometri, 405 nanometri e 642 nanometri. Il software Summit viene utilizzato per l'acquisizione e l'analisi, dopo aver calibrato il citofluorimetro mediante perline standard. Riportare lo scatter anteriore (FSC) contro lo scatter laterale (SSC) su scala lineare e delimitare la popolazione di cellule vitali.Successivamente, tracciare SSC in funzione della larghezza dell'impulso di tensione e della modalità di selezione sulla popolazione di cellule vive non aggregate. Quindi, tracciare FSC su scala lineare in funzione della fluorescenza CFP a 405 FL sei su questo strumento su scala logaritmica e della modalità di selezione sulle cellule vive CFP positive non aggregate. Infine, tracciare FSC su scala lineare in funzione della fluorescenza YFP a 488 nanometri FL uno su questo strumento su scala logaritmica per visualizzare l'intensità di BC.Successivamente, eseguire il campione doppio negativo Y-F-P-C-F-P e regolare il tubo fotomoltiplicatore (PMT) del canale FL1 e FL6 di F-S-C-S-S-C per impostare la soglia per ciascun segnale. Successivamente, eseguire entrambi i campioni singoli positivi per YFP e CFP per la compensazione futura offline. Assicurarsi di acquisire almeno 10.000 eventi selezionati.Infine, raccogliere i dati per i campioni sperimentali dopo la raccolta dati. Impostare il protocollo di analisi secondo l'acquisizione, propagando il gate uno nel dot plot FS CSC per le cellule vitali. Gate due nel tracciato a impulsi FSC con dot plot del gate uno per le cellule vitali non aggregate e gate tre nel dot plot ccfp FSC del gate due per le cellule vitali positive a ccfp non aggregate.Dopo aver compensato il segnale di YFP e CCFP nel diagramma a dispersione Yfp CFP utilizzando cellule singolarmente positive per YFP e CFP, determiniamo le linee di cutoff per le cellule positive a CFP e YFP. Esportare il valore medio di intensità di fluorescenza (MFI) di YFP delle cellule positive per CFP in Excel per la rappresentazione grafica dei dati; successivamente, in Excel, normalizzare l'MFI di YFP al livello di espressione di ACAP LBC PDE E 43 e al controllo di caricamento alfa-tubulina, determinato mediante immunoblotting, al fine di stabilire il range lineare dell'intensità media di fluorescenza di YFP. CFP è stato cotrasfettato con VN ACAP L BBC e quantità variabili di VC PDE E 43 in cellule HEC 2 93, e l'interazione è stata valutata mediante citometria a flusso biforcazione come descritto in questo video; questo grafico mostra la variazione relativa dell'espressione di VC PDE E 43 in funzione della quantità di VC PDE E 43 trasfettata.L'intensità media della fluorescenza di Venus nelle cellule positive per CFP, indicata dai quadrati blu, ha mostrato una correlazione con l'espressione di VCDE 43 ed è risultata coerente con i livelli di espressione determinati mediante analisi dell'immagine di un western blot, indicati dai triangoli rossi. Un'intensità media di fluorescenza simile per CFP è stata osservata tra i campioni, come indicato dai quadrati verdi, ed è stata utilizzata come controllo negativo per limitare le variazioni cellulari. Questi risultati confermano l'utilizzo della citometria a flusso per quantificare l'interazione tra ACAB LB C PDE 43 misurando l'intensità media della fluorescenza di BS e, allo stesso tempo, determinando la quantità appropriata di costrutti BIC impiegati per lo screening volto a mappare i siti di legame di ACAP LBC all'interno di PDE E 43. L'analisi BIC dell'interazione tra ACAP LBC e PDE E 43 a lunghezza intera (fl).La regione UCR uno della PDE 43 e le regioni UCR due e CAT della PDE 43 sono state valutate utilizzando questo metodo, come mostrato qui. L'espressione di vn ACAP LBC e VC PDE 43 UCR due più CAT determina un segnale BC più basso rispetto a VC PDE 43 FL e VC PDE 43 UCR uno; livelli simili di espressione proteica sono stati osservati in tutti i campioni in flusso e l'intensità media della fluorescenza è stata normalizzata rispetto ai livelli di espressione relativi di ACAP LBC PDE 43 e alfa-tubulina. Pertanto, il valore B-C-M-F-I normalizzato indica che non vi è alcuna differenza nell'intensità di fluorescenza tra ACAP LBC PDE 43 FL e ACAP LBC PDE 43 UCR uno, ma un segnale notevolmente più basso per l'interazione ACAP LBC PDE 43 UCR due più CAT.Questi risultati suggeriscono che esistono diverse regioni nella PDE 43 che interagiscono con l'ACAP LBC e che l'UCR R della PDE 43 è la regione principale di interazione con l'ACAP LBC. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come studiare l'interazione tra proteine mediante analisi di citometria a flusso del BP C. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di determinare la quantità corretta di costrutto BP C da utilizzare per ottenere un'espressione proteica simile e una risposta lineare del BP C. Dopo aver seguito questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come l'uso di peptidi o il rischio, al fine di determinare quali amminoacidi all'interno della PDE 40 D tre sono responsabili.Le sue interazioni tra ACAP e globuli rossi.

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