Bimolecolari complementazione fluorescenza

Questo esperimento mira a definire se due proteine interagiscono nelle cellule e a delineare aspetti dei siti di tale interazione. Le prime cellule vengono trasfettate con costrutti di espressione che codificano per le due proteine di interesse, una delle quali è fusa all'estremità terminale di una proteina fluorescente frammentata e l'altra fusa all'estremità C complementare della proteina fluorescente frammentata. Dopo aver permesso alle cellule trasfettate di sviluppare un segnale fluorescente in coltura, i complessi proteici vengono visualizzati mediante imaging e immuno blotting.

Successivamente, le immagini raccolte vengono esportate in un software di imaging come l'immagine J Al fine di quantificare l'intensità media della fluorescenza per cellula in un esperimento controllato, i risultati BIFC possono dimostrare le interazioni proteina-proteina e la localizzazione di questi complessi, come i tre domini SH della proteina dell'impalcatura che si intersecano e il dominio ricco pro di PI tre KC due beta. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la colocalizzazione, l'immunoprecipitazione e il fret, è che la BFC consente la localizzazione spazializzata delle interazioni transitorie più deboli nella cellula. E questo metodo non richiede un'estesa post-elaborazione delle immagini come si vede con fret.

Questo metodo può affrontare questioni chiave nell'area della trasduzione del segnale, come l'interazione delle proteine DO X e Y e, in tal caso, quali sono i compartimenti specifici in cui questi complessi si sono localizzati nella cellula? In generale, i neofiti di questo metodo avranno difficoltà perché non hanno scelto la configurazione corretta per esprimere la loro biopsia. Proteine di interesse Iniziate selezionando uno dei fluorofori multipli per le proteine di fusione BIFC.

Si consideri che le estremità terminali amminiche e carbossiliche di Venere sono in grado di formare un complesso a 37 gradi Celsius, mentre i frammenti Y-F-P-B-I-F-C richiedono una pre-incubazione a 30 gradi Celsius. Progettare vettori di espressione per l'aggiunta di tag alle proteine di interesse considerando come l'attaccamento dei frammenti BIFC può influenzare la funzione delle proteine di interesse. Ad esempio, la famiglia RA, i GTP a sono lipidi modificati all'estremità carbossilica e non possono essere marcati a questa estremità senza interrompere questa modifica.

Eseguire sempre esperimenti pilota per determinare le condizioni di trasfezione. Monitora anche le cellule mediante microscopia a fluorescenza per identificare un momento ottimale per lo sviluppo del segnale. Quindi eseguire l'analisi dei fiori occidentali per confermare l'espressione uguale dei costrutti.

È importante colorare l'immuno per l'HA o contrassegnare per verificare che l'aggiunta dei frammenti BIFC non alteri la localizzazione cellulare delle proteine di interesse per ciascuna piastra campione. 1,3 volte 10 delle cinque cellule causano ciascuna su una piastra di vetro con fondo e due pozzetti di una piastra a sei pozzetti e lasciare che le cellule si depositino durante la notte in un incubatore a 37 gradi Celsius il giorno successivo. Preparare i DNA per la trasfezione mediante lipectomia o altro metodo preferito.

Innanzitutto, diluire il DNA in 250 microlitri di DMEM libero dal siero come controllo della trasfezione. Aggiungi CFP a uno 50, la quantità del tuo DNA BIFC totale. Ora diluire il labbro in 250 microlitri di DMEM senza siero utilizzando 10 microlitri di labbra per un microgrammo di DNA.

Mescolare il DNA e le diluizioni delle labbra incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. Sciacquare le cellule due volte con siero caldo senza DMEM. Aggiungere due millilitri di DMEM senza siero a ciascuna piastra di vetro con fondo o a pozzetto di una piastra a sei pozzetti.

Quindi dividere uniformemente ogni miscela di trasfezione tra un piatto con fondo di vetro e due pozzetti da sei. Su una piastra ben incubata le cellule a 37 gradi Celsius per cinque ore. Infine, rimuovere il supporto di trasfezione e sostituirlo con DMEM completo più il 10% di supporto FBS.

Incubare le cellule per il tempo determinato negli esperimenti pilota per ottenere i livelli di espressione necessari delle proteine di interesse. Esaminare le cellule trasfettate al microscopio epifluorescente per assicurarsi che il controllo positivo sia fluorescente. Sciacquare le cellule tre volte con PBS per l'imaging di cellule vive.

Posizionare le celle in un terreno privo di matrici indicatrici. Per l'imaging di cellule fisse. Aggiungere il 2% di para formaldeide e mettere in ghiaccio per 10 minuti.

Quindi sciacquare le cellule tre volte con PBS ora coperto con un millilitro di PBS e conservare al buio a quattro gradi Celsius, licare immediatamente le cellule nel piatto a sei pozzetti. Per le analisi Western blot, è importante che tutte le cellule siano preparate contemporaneamente in modo che le cellule lys siano rappresentative delle cellule immagine. Eseguire un western blot per assicurarsi che le proteine tag siano espresse a livelli equivalenti.

Quando si esegue l'imaging delle cellule con un microscopio confocale, è importante mantenere costanti le impostazioni durante l'esperimento in modo che la fluorescenza sia confrontabile tra i campioni. Assicurati di visualizzare le singole celle in cui i pixel non sono saturi. Poiché la CFP è stata inclusa come controllo della trasfezione, selezionare solo le cellule positive per CFP per l'analisi dei segnali BIFC.

Quantifica la fluorescenza utilizzando un software di imaging come Image J.Apri i file di immagine in Image J.Go per analizzare le misurazioni impostate. Selezionare le caselle per l'area e il valore medio del grigio nella casella delle misure. Si noti che in questo esempio, le immagini venose sono state pseudo colorate in verde e le immagini CFP sono state pseudo colorate in rosso.

Utilizzando lo strumento di selezione a mano libera, disegnare un contorno attorno al bordo dell'intera cella nel canale CFP lasciando questo contorno in posizione. Passa al canale YFP. Vai ad analizzare, misura il valore medio del grigio che riflette l'intensità media di fluorescenza per cella per ogni immagine.

Disegna un cerchio nel canale YFP in un'area che non contiene una cella. Prendi una misura per quest'area come sfondo. Sottrai lo sfondo da ogni immagine.

Infine, per calcolare l'intensità media della fluorescenza per una popolazione di cellule, calcolare la media del valore del grado medio meno lo sfondo per tutte le cellule visualizzate in un campione. Quantificare idealmente 60 cellule in tre esperimenti. La proteina di impalcatura multi-dominio che si interseca regola la sopravvivenza neuronale attraverso la regolazione di una nuova classe due: PI: tre chinasi, PI tre, KC, due beta intersecanti SH, tre domini interagiscono con la regione ricca di prolina amminoterminale di PI, tre KC, due beta trasfezione di VN, marcati con VC, PI marcati tre, KC, due beta, provocano un segnale fluorescente nel canale YFP, che è pseudo colorato di verde che indica la formazione di un complesso.

Lo pseudo CFP qui colorato in rosso viene utilizzato come controllo per marcare le mutazioni delle cellule trasfettate nel dominio ricco di prolina di PI tre KC due beta, che interrompono la coprecipitazione dell'intersezione e PI tre KC due beta diminuiscono il segnale BIFC. Questa differenza nel segnale BIFC non è dovuta a differenze nell'espressione delle proteine wild type e PA PI tre K Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre giorni se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è necessario ricordarsi di eseguire i controlli appropriati e di verificare l'espressione proteica per assicurarsi che le differenze nel segnale BC siano dovute a differenze nella formazione di complessi e non all'espressione che segue questa procedura.

Altre tecniche, come il plasma di superficie sui residenti, possono essere eseguite per rispondere a domande come quali sono le diverse affinità di questi complessi l'uno per l'altro?