Gene Transfer per l'orecchio del mouse Sviluppo Inner In Vivo Elettroporazione

Jane si è trasferita all'orecchio interno del topo in via di sviluppo da in vivo, elettroporazione Ling Wang, Han Jang e John Burgandy, Oregon Hearing Research Center, Oregon Health and Science University. Mi chiamo John Burgandy. Il mio laboratorio è presso l'Oregon Hearing Research Center presso l'Oregon Health and Science University.

Mi chiamo Ang. Sono un poster nel laboratorio di Johns. Sono anche Ang nel laboratorio Johns come assistente di ricerca.

La nostra presentazione è suddivisa in quattro parti. La prima è la laparotomia ventrale. Dimostriamo la penna al sodio, l'anestesia a base di barbital, come testare l'adeguatezza dell'anestesia, la protezione corneale, la preparazione del sito chirurgico, la scheda tecnica della chirurgia di sopravvivenza del topo di disinfezione, l'incisione della linea mediana ventrale della suite chirurgica attraverso la pelle e la parete addominale e l'esternalizzazione delle corna uterine.

La seconda parte è la microiniezione transuterina. Dimostriamo la trans illuminazione dell'embrione, l'embrione, il riorientamento, la microiniezione, la pipetta, la fabbricazione e la microiniezione nell'Otis al giorno embrionale 11.5 e al giorno embrionale 12.5. La terza parte è l'elettroporazione in vivo.

Dimostriamo il posizionamento dell'elettrodo a paletta e l'elettroporazione dell'embrionale giorno 11,5 di topo O assist. La quarta parte è rappresentata dai risultati rappresentativi. Mostriamo l'espressione della GFP nelle coclee embrionali tardive e postnatali precoci.

Ciò è risultato dall'elettroporazione in vivo del plasmide Otis con espressione alla laparotomia ventrale embrionale del giorno 11,5 parte uno. La diga è tenuta saldamente afferrando la pelle dietro il collo, la coda e l'arto posteriore sinistro. Un'iniezione intraperitoneale di anestetico a base di pentobarbital di sodio viene somministrata dopo aver tamponato l'addome con etanolo al 70%.

Il topo viene posto all'interno della sua gabbia domestica per quattro o cinque minuti per consentire all'anestetico di agire. I pizzicotti del piede e della coda vengono utilizzati per valutare l'adeguatezza dell'anestesia. Questa diga si chiude in risposta al pizzico della coda e ha bisogno di altri due minuti prima di diventare insensibile agli stimoli nocivi.

L'unguento oftalmico sterile viene applicato sugli occhi per proteggere le cornee dall'essiccazione. Prepariamo il sito chirurgico in una cappa chimica per ridurre al minimo la diffusione di pelo e peli. La pelliccia viene rasata con una lama sottile per esporre la pelle che ricopre la parete addominale.

La rimozione completa del pelo facilita la guarigione dell'incisione dopo l'intervento. La disinfezione della pelle addominale si ottiene alternando passaggi di betadina al 70% di etanolo e di etanolo al 70%. Passa sempre dal rostrale al coccola e usa un batuffolo di cotone chirurgico fresco o un applicatore con punta di cotone.

Per ogni passaggio, valutiamo la profondità e la qualità delle respirazioni durante la disinfezione per assicurarci che la diga non risponda Dopo, dopo il secondo passaggio di etanolo al 70%, abbiamo immediatamente posizionato la dannata superficie ventrale su un telo sterile e l'abbiamo messa su un tampone riscaldato per due o tre minuti per riscaldarla. Questo è un momento conveniente per registrare i dati preoperatori sul foglio di registro della chirurgia di sopravvivenza del topo. Abbiamo allegato la nostra scheda tecnica di chirurgia di sopravvivenza del topo come informazioni supplementari.

Prendi in considerazione l'inclusione della scheda tecnica e del protocollo di cura degli animali in modo che il tuo comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali possa vedere come monitorerai i dati operativi e postoperatori preoperatori. Compiliamo un foglio di registro per ogni soggetto chirurgico. Preferiamo condurre interventi chirurgici in un ambiente sterile, anche se questo in genere non è richiesto per i roditori.

La superficie di lavoro è separata dal motore del ventilatore e dall'alloggiamento del plenum, quindi non vengono trasmesse vibrazioni all'utente. Durante la microiniezione, abbiamo aggiunto come informazioni supplementari, uno schema delle modifiche che abbiamo apportato alla nostra cappa a flusso laminare per facilitare il trasferimento genico in utero, le modifiche essenziali sono ritagli di illuminazione a bassa resistenza e traccia e prese nascoste per i cavi di alimentazione dello strumento e un percorso di instradamento per i circuiti elettrici accessori. La suite chirurgica è composta da suonerie elettriche lattate, sacca per flebo, bagno caldo, XY, manipolatore Z, fluorescenza stereo, microscopio da dissezione, sorgente luminosa a fibre ottiche e strumenti chirurgici.

I pedali vengono utilizzati per attivare il micro iniettore, l'elettro perter entra a fuoco. Gli strumenti chirurgici dell'endoscopio vengono sterilizzati in autoclave. Gli strumenti devono essere risterilizzati tra i topi utilizzando uno sterilizzatore a microsfere di vetro o risterilizzando in autoclave il driver dell'ago.

Le forbici Balli, le pinze ad anello e le pinze vascolari sono gli strumenti essenziali. Incisione ventrale della linea mediana, afferrare la pelle con una pinza vascolare e asportare il tegumento con le forbici a punta sferica, estendere l'incisione da 10 a 14 millimetri. Identificare la banda avascolare bianca del tessuto collegato chiamata linea alba e la linea mediana ventrale dell'addome incidere l'alba lineare con le forbici a punta sferica.

Facendo attenzione a non intaccare l'intestino o i cuscinetti adiposi inguinali. Irrigare immediatamente l'addome con una soluzione sterile di ringer lattato Prewarm. Valutare i siti di incisione nella pelle e nella parete addominale per il sanguinamento.

La pressione diretta con una pinza smussata arresterà l'emorragia minore, se presente, esternalizzerà le corna uterine destra e sinistra con una pinza a punta anulare. Afferra delicatamente il corno uterino destro con un'estremità ad anello della pinza e tira l'utero verso l'incisione della linea mediana. Usa la mano libera per manipolare delicatamente il lato laterale della diga per facilitare l'aggancio dell'utero.

Le pinze non vengono mai utilizzate per comprimere l'utero ed estrarlo. Poiché ciò potrebbe danneggiare la vascolarizzazione uterina o gli embrioni, ripetere la procedura di esternalizzazione per il corno uterino sinistro. Irrigare immediatamente le corna uterine appena esternalizzate con una soluzione di ringer lattato preriscaldata, reinserire delicatamente i cuscinetti adiposi inali o l'intestino in caso di esternalizzazione con l'utero.

Questo non si incontra spesso. Parte seconda micro iniezione uterina. La diga è disposta sotto l'obiettivo a lunga distanza di lavoro e una luce a fibre ottiche a cavo morbido è appoggiata alla parete uterina.

L'utero viene premuto delicatamente con un dito della mano libera. Facilitare l'identificazione dell'orientamento dell'embrione. La luce del cavo in fibra ottica deve essere alla minima intensità richiesta per valutare con precisione l'orientamento dell'embrione.

La luce intensa può trasmettere calore all'utero che può causare complicazioni. Teniamo la luce a fibre ottiche e l'utero in una mano e usiamo un dito della nostra mano libera per riposizionare l'embrione mediante palpazione delicata. Dimostriamo nei seguenti tre video al microscopio clip EC e gli orientamenti embrionali comuni osservati dall'utero.

L'osservatore vedrà la vista microscopica che vediamo durante l'illuminazione trans, anche se in bianco e nero l'illuminazione trans dell'utero consente di rilevare l'orientamento dell'embrione in vivo. In questo esempio, l'embrione si trova in posizione verticale con la superficie ventrale rivolta verso l'osservatore. Spostando l'utero avanti e indietro, possiamo rilevare gli arti posteriori destro e sinistro, la coda e il cephalon dell'occhio sinistro.

In questo esempio, l'embrione è di nuovo in posizione verticale, ma ruotato di circa 90 gradi rispetto all'asse anteriore posteriore. Muovendo delicatamente l'utero avanti e indietro, possiamo vedere le forme della pagaia che definiscono l'arto posteriore sinistro e l'arto sinistro. Anche il cervello posteriore è evidente.

L'embrione è in posizione eretta con il lato sinistro rivolto verso l'osservatore. Il quarto ventricolo nascente è rilevabile come una macchia luminosa nel cervello posteriore. Sono evidenti anche il cephalon dell'occhio sinistro, i quattro arti sinistri e gli arti posteriori sinistri.

Una leggera pressione sull'utero riorienta leggermente gli embrioni per consentire il rilevamento del tronco principale della vena primaria della testa e dei suoi rami anteriori e posteriori, che sono contrassegnati rispettivamente da un asterisco bianco e nero. Come vedremo, l'Otis si trova a metà strada tra i rami anteriore e posteriore della vena primaria della testa. L'Otis stesso non può essere visto attraverso l'utero mediante transilluminazione.

In due clip di videoscopia successive dimostriamo come riorientare l'embrione per la microiniezione nell'assistenza Otis. L'obiettivo è identificare i punti di riferimento embrionali che consentono l'interpolazione della posizione dell'otis nella testa laterale. Certo, il nostro obiettivo è quello di riorientare l'embrione dalla posizione dorsale a quella laterale in modo da poter identificare la vena primaria della testa.

Il mesencefalo, il quarto ventricolo e il lato sinistro dell'arto sono evidenti nella posizione dorsale. Una leggera pressione sull'utero sposta l'orientamento dell'embrione da dorsale a successivo. Il cephalon dell'occhio sinistro, il mesencefalo e il quarto ventricolo sono facilmente evidenti.

Sono evidenti anche la vena primaria della testa e il suo ramo posteriore indicato dall'asterisco. Il ramo anteriore della vena primaria della testa non è chiaramente rilevato. Il nostro obiettivo, ancora una volta, è quello di orientare l'embrione in modo che possa identificare la vena primaria della testa, ma con un ingrandimento più elevato appropriato per la microiniezione uterina.

I vasi uterini, la banda deciduale e l'occhio sinistro sono visibili in questa prospettiva laterale. Una leggera pressione sull'utero sposta la posizione dell'embrione, in modo da poter rilevare il quarto ventricolo sinistro. La vena primaria della testa e il suo ramo posteriore contrassegnati dall'asterisco, la vena primaria della testa e i suoi rami formano la forma dei montanti da football americano.

La vescicola otica non può essere vista attraverso l'utero, ma si trova al centro dei montanti. Lynn ha avviato una sequenza di iniezione per un embrione. Illumina l'utero, riorienta l'embrione per una microiniezione e porta sul campo la pipetta per microiniezione riempita di verde veloce.

La pipetta per microiniezione è fissata a un supporto per pipette tenuto da un manipolatore di microm X, Y, z. Il supporto magnetico del manipolatore è fissato a una piastra in acciaio con base in teflon che consente un posizionamento lordo senza sforzo della pipetta per microiniezione. L'ago viene fatto avanzare utilizzando la manopola di controllo del micrometro in avanti sul manipolatore in modo appropriato.

Le pipette fabbricate sono essenziali per una microiniezione traumatica nell'embrione di topo allo stadio iniziale di Otis. Tiriamo fuori un tubo capillare in vetro borosil a parete spessa con un estrattore per pipette orizzontale. La pipetta risultante mostrata in A viene rotta manualmente con una pinza a circa 14-16 micron di diametro esterno indicata dalla punta della freccia in B.La rottura grossolana della pipetta mostrata in C è frastagliata e fragile.

Smussiamo la pipetta a circa 20 gradi per affilare la punta della pipetta, come mostrato nel pannello D, i parametri per l'estrazione e la smussatura delle pipette per microiniezione sono forniti nel testo di accompagnamento. Dimostriamo nelle prossime due clip di microscopia video la microiniezione nell'assistenza otica del topo ai giorni embrionali 11.5 e 12.5. Il nostro obiettivo è dimostrare la microiniezione uterina nel giorno embrionale, 11,5 otici di topo.

In primo luogo, iniettiamo gli otici senza la presenza dell'utero per mostrare in modo inequivocabile come appare un'iniezione correttamente mirata. Quindi dimostriamo l'autentica micro iniezione transuterina. Per questa prima iniezione, l'utero è stato inciso per consentire al sacco viscerale di estrudere la banda deciduale sovrastante il sacco vitellino viscerale è stata rimossa.

La placenta rimane attaccata all'utero e l'embrione è vivo. Con l'utero rimosso focalmente, vediamo il quarto ventricolo, la vena primaria della testa e i suoi rami anteriori e posteriori, la pipetta e la posizione approssimativa della cisti in bianco. All'inizio di questa sequenza di iniezione, il flusso sanguigno viene rilevato nel sistema vascolare del sacco vitellino.

La pipetta viene fatta avanzare attraverso il sacco vitellino viscerale e il dai viene iniettato nella nota dell'osis, nel dotto endolinfatico dorsalmente e nella posizione dell'otico al centro dei montanti. L'otica è a metà strada tra i rami anteriore e posteriore della vena primaria della testa, micro iniezione uterina nel giorno embrionale. 11.5 L'otica del topo richiede il rilevamento della vena primaria della testa e di almeno uno dei suoi rami per stimare la posizione dell'assistenza otica.

Il nostro obiettivo in questo esempio diagrammatico, sia il ramo anteriore che quello posteriore della vena primaria della testa vengono rilevati con il territorio OUC contrassegnato in bianco. Una presentazione più realistica dell'embrione è quella in cui viene rilevato il tronco principale della vena primaria della testa insieme a uno solo dei suoi rami e nell'esempio mostrato si vede solo il ramo posteriore della vena primaria della testa, ma questo è sufficiente per interpretare la posizione dell'otica. Il PT viene fatto avanzare attraverso l'utero e il colorante viene iniettato nell'otica.

Aspettiamo 30 secondi per consentire al colorante di uscire dalla cavità amniotica, a quel punto possiamo vedere il dotto endolinfatico dorsalmente e il vestibolo. Concludiamo con una vista a basso ingrandimento dell'embrione di cui abbiamo appena iniettato la cisti per fornire una prospettiva anatomica in questa vista, si vedono il quarto ventricolo sinistro e la vascolarizzazione uterina. Dimostriamo la trans e la microiniezione nella cisti otica embrionale del giorno 12 e la microiniezione nel quarto ventricolo nascente del cervello posteriore.

La transilluminazione ci consente di rilevare la vena primaria della testa in questa vista laterale sinistra e l'occhio. La pipetta viene fatta avanzare attraverso l'utero nella vescicola otica e muore iniettata per riempirne il lume. Per iniettare il quarto ventricolo, ruotiamo l'embrione di 90 gradi per una vista dorsale del cervello posteriore.

La cisti sinistra iniettata si trova ora sul lato sinistro. La pipetta viene fatta avanzare attraverso l'utero e il verde veloce si mescola con lor. Il destrano coniugato viene iniettato nel quarto ventricolo.

Si noti che il volume di colorante iniettato non entra nel mesencefalo in vivo. La fluorescenza viene valutata dopo l'iniezione per convalidare la localizzazione del destrano nel quarto ventricolo. L'embrione viene quindi riorientato dalla posizione dorsale a quella laterale.

Il dotto endolinfatico è appena ventrale al quarto ventricolo in questa vista laterale. La fluorescenza in vivo convalida la localizzazione del destrano nel quarto ventricolo. Alla nascita, controlliamo i cuccioli per la fluorescenza verde nel quarto ventricolo utilizzando un'epifluorescenza.

I cuccioli di microscopio da dissezione con fluorescenza verde nel cervello posteriore possiedono un orecchio interno che è stato manipolato durante l'embriogenesi parte terza elettroporazione in vivo. Dopo aver riempito la cisti con il plasmide di espressione, l'utero viene appena irrigato con una soluzione di ringer lattato preriscaldato. La transilluminazione facilita il centraggio della cisti ODU nel campo dell'elettrodo.

La testa metallica della luce a fibre ottiche è retratta dalla superficie uterina. Prima di avviare il treno di impulsi a onda quadra, dimostriamo nella prossima clip di microscopia video un ciclo completo di elettroporazione in vivo. L'elettroporazione del giorno embrionale, la cisti otica di topo 11,5 richiede un posizionamento delicato degli elettrodi a paletta sull'utero.

In questo esempio, la cisti otica sinistra è stata riempita con plasmide di espressione e l'utero è stato appena irrigato con ringer lattati. Il catodo è posizionato lateralmente rispetto alla cisti otica riempita e l'ode è posizionato medialmente all'inizio della sequenza di azione, la cisti otica è centrata nel campo della paletta. L'utero viene compresso delicatamente e il treno di impulsi a onda quadra viene avviato con un interruttore a pedale.

Idealmente, per impulso vengono erogati da 60 a cento milliampere di corrente. L'utero viene quindi rilasciato e immediatamente irrigato. L'utero appena irrigato viene riportato nella cavità addominale mediante una leggera pressione con la pinza ad anello.

Una volta che l'utero è internalizzato, la cavità addominale viene lavata con circa quattro mil di anelli lattati che lasciano circa un milione di anelli lattati nella cavità addominale per aiutare a mantenere l'idratazione della madre che berrà meno acqua del solito subito dopo l'intervento chirurgico addominale. La parete addominale e quindi la pelle vengono chiuse con sutura riassorbibile utilizzando un cacciaago. Il nostro cacciavite ad ago ha una forbice incorporata che semplifica la chiusura.

Preferiamo un punto filza sia per la parete addominale che per la pelle. Blocchiamo ogni altro punto per fornire un supporto aggiuntivo nel sito di incisione. Somministriamo un farmaco antinfiammatorio non steroideo per via sottocutanea prima di posizionare la madre nella gabbia di recupero.

Consulta il tuo personale veterinario per sapere quali analgesici profilattici sono preferiti dal tuo comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. La diga è avvolta in un telo sterile e posta sul pavimento della gabbia di recupero riscaldata. La gabbia di recupero contiene materiale per il nido, un tubo rosso per la copertura, cibo da laboratorio e una bottiglia d'acqua.

La gabbia viene rimontata con un cofano filtrante sulla parte superiore la mattina dopo l'intervento. La madre è ben curata, deambulante e in grado di stare in equilibrio sugli arti posteriori per informarsi sulla parte superiore della gabbia aperta. La linea di sutura nell'addome è pulita, asciutta e non mostra segni di separazione, arrossamento o gonfiore.

Abbiamo allegato un documento che discute lo sviluppo di un protocollo di cura degli animali per il trasferimento genico in utero. Il documento contiene un linguaggio che può essere utile quando si progetta un protocollo specifico dell'istituto in consultazione con il comitato per la cura e l'uso degli animali. Parte quarta, risultati rappresentativi.

I pannelli A e B mostrano una coclea rappresentativa da un cucciolo postnatale del sesto giorno in cui Otis è stato iniettato con un plasmide di espressione proteica fluorescente verde potenziato al giorno embrionale 11,5 e poi elettro. La parete laterale cocleare è stata rimossa dal midterm e dall'apice. Solo l'espressione di GFP è presente dalla base al medio termine della coclea e segue la distribuzione del marcatore delle cellule ciliate miosina sette A mostrato nel pannello B.Il pannello C mostra una proiezione confocale a basso ingrandimento della giornata embrionale.

18,5 organo murino di corde immuno colorato con una miosina, sette cellule trasfettate con anticorpi A sono distribuite in tutto l'organo del corde. Il pannello D mostra una proiezione confocale ad alto ingrandimento della giornata embrionale. 18.5 Organo murino di corde colorato con cin. Sette.

L'espressione di GFP è rilevata nelle cellule ciliate interne ed esterne, nelle cellule interfalangee, nelle cellule pilastro e nelle cellule TER. Trasferimento genico mediato da elettroporazione all'Otis al giorno embrionale 11.5 Trasfetti progenitori che danno origine a tutti i tipi di cellule componenti all'interno dell'organo del corde.