Name: Gene Transfer per lorecchio del mouse Sviluppo Inner In Vivo Elettroporazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 2 s
Description: Scopri il trasferimento genico nell'orecchio interno del topo mediante elettroporazione in utero. Questa tecnica combina laparotomia, microiniezione e elettroporazione per studiare lo sviluppo dell'udito.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ringraziamo Humana Press per il permesso di pubblicare la pipetta figura microiniezione di fabbricazione, che è originariamente apparso a pagina 130 di riferimento 11; Larry Dlugas e Steven Wong, OHSU Ministero delle Comunicazioni educativi, per videografia, Larry Dlugas per il design e video editing; Adam M. O &#39;Quinn, Senior Designer, Trion / Envirco per la progettazione di nostra consuetudine orizzontale, cappa a flusso laminare e Les Goldsmith per fornire lo schema tecnico; Victor Monterroso, MV, MS, PhD e Tom Chatkupt, DVM, OHSU Dipartimento di Medicina comparativa, per la guida con il nostro animali protocollo di cura, tecniche chirurgiche, e profilattico analgesia regime; Marcel Perret-Gentil, DVM, MS, per condividere la sua dispensa sulle tecniche di sutura veterinaria, Edward Porsov, MS, per la progettazione la nostra workstation video di Adobe Premiere Pro microscopia computer; e Leah bianco e Jonas Hinckley dei LNS didascalie (Portland, OR). Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institute on Deafness e other disturbi della comunicazione: DC 008595 R01 e R01 DC 008595-04S2 (a JB) e P30 DC005983 (Oregon Hearing Research Core Center Grant, Peter Gillespie, Principal Investigator).

1. Laparotomia ventrale <ol><li> Anestetizzare una diga i cui embrioni sono al giorno embrionale 11,5 (E11.5, a mezzogiorno del giorno viene rilevata una spina vaginale è il giorno 0,5 dello sviluppo embrionale) mediante iniezione intraperitoneale di soluzione di sodio pentobarbital anestesia (7,5 pl per grammo di peso corporeo). Soluzione di lavoro anestetico: 180 pl di 50 mg / mL di sodio pentobarbital, 100 pl di etanolo assoluto, 320 pl di 65 mg / ml di solfato di magnesio acquoso (modula tono uterina), e 400 pl di glicole propilenico (miscibile veicolo acquoso e organico componenti). </li><li> Valutare la completezza di anestesia effettuando prove di stimoli nocivi: squeeze zampa; risposta e lampeggiano al tocco sulla guancia e vibrisse; pizzico coda. Applicare una pomata oftalmica sterile per le cornee. </li><li> Accorciare il pelo addominale dalla zona sovrapubica alla gabbia toracica, con forbici e una lama fine (Oster # 40 della lama). Disinfettare l&#39;addome con il 70% etanolo, 10% di iodio povidone (Betadine), unnd etanolo al 70%, sequenzialmente. Luogo del mouse addome rivolto verso il basso su un telino sterile e quindi impostare su una piastra elettrica o piatto caldo (37 ° C) per 2-5 minuti. </li><li> Incidere la cute addominale sulla linea mediana ventrale con palla punta forbici. Estendere l&#39;incisione di 10-14 mm. Identificare la linea alba, uno avascolare, fascia bianca tessuto connettivo lungo la linea mediana ventrale della parete addominale. Incidere la linea alba con palla punta forbici ed estendere il 10-14 mm incisione. Lavare immediatamente con l&#39;addome preriscaldato (37 ° C), Ringer lattato soluzione. </li><li> Esternalizzare i due corni dell&#39;utero con una pinza ad anelli senza applicare una pressione eccessiva sui siti di impianto. Irrigare le corna uterine esternalizzati con preriscaldata, soluzione di Ringer lattato. </li></ol> 2. Microiniezione Transuterine <ol><li> Realizzare una parete spessa, borosilicato pipetta microiniezione capillare di vetro, con le seguenti caratteristiche: 12-16 μm diametro esterno ed uno smusso 20 gradi. Su un P-97 Sutter estrattore pipetta con filamento piccola scatola, utilizzare il seguente programma: calore = test di rampa più 3 unità; pressione = 200; tirare = 0; velocità = 46; tempo = 100). Con il BV-10 Beyeler Sutter, utilizzare la 104C (oro) disco abrasivo per pipette di grande diametro. Risospendere plasmide di espressione a 3-4 pg / pl in fosfato di calcio libero soluzione salina tamponata (pH 7,2-7,4). Aggiungi cristallino verde veloce al DNA concentrato, vortex delicatamente per 30 secondi, e far girare a 10.000 g per 10 secondi. La quantità minima di verde veloce necessaria per seguire visivamente l&#39;efficacia dell&#39;iniezione viene determinato empiricamente. La pipetta in sostegno degli smussato con il DNA / fast soluzione verde. Collegare la pipetta caricato microiniezione al titolare pipetta della pressione dell&#39;iniettore (Picospritzer con&gt; 99% di azoto puro come fonte di gas). </li><li> Transilluminate l&#39;utero a bassa intensità, luce alogena per visualizzare l&#39;embrione all&#39;interno del suo sito di impianto. Identificare il beating cuore, vescicole cerebrali, gemme degli arti, nascente 4 ° ventricolo del cervello posteriore, e gli occhi. Irrigare l&#39;utero ogni 2 minuti con preriscaldata e soluzione di Ringer lattato per mantenere l&#39;idratazione. Applicare una leggera pressione sull&#39;utero di riorientare l&#39;embrione e identificare i punti di repere anatomici di cui sopra. </li><li> Orientare l&#39;embrione per identificare la vena principale cui testa anteriore e posteriore fianco rami del territorio mesenchimali in cui il otocyst risiede. Il otocyst appropriato non può essere visto da transilluminazione dell&#39;utero. Il otocyst si trova a metà strada tra i rami anteriore e posteriore della vena testa primaria che, insieme al tronco principale della vena, formare la forma dei montanti o pali su un campo di football americano. Il otocyst è a metà strada tra i montanti. </li><li> Inserire la pipetta iniezione attraverso l&#39;utero in una traiettoria in linea con la posizione del presunto otocyst. Pulse il microiniettore volta dopo aver attraversato il uterci visualizzare il colorante tracciante e il approssimare la posizione della punta della pipetta. Far avanzare la pipetta sotto controllo micrometro e pulsare di nuovo per valutare la profondità. Ulteriori avanzare la pipetta nel mesenchima laterale della testa e il polso più volte. Il targeting otocyst successo rivelerà la forma affusolata del condotto endolinfatico dorsalmente e capesante forma a conchiglia del vestibolo. Rilasciare la pressione sul utero, rimuovere la pipetta dalla dell&#39;embrione / utero in un unico movimento, e subito irrigare l&#39;utero con preriscaldata, soluzione di Ringer lattato. </li></ol> 3. Elettroporazione in vivo <ol><li> Irrigare l&#39;utero con la soluzione di Ringer lattato. Soluzione appena applicato Ringer lattato è necessario accoppiare elettricamente la pagaia in stile elettrodi verso l&#39;utero. Inumidire le superfici degli elettrodi di tungsteno con il Ringer lattato. Centro il otocyst iniettato nel percorso degli elettrodi. Delicatamente comprimere l&#39;utero con il pa elettroporazioneddles. Il catodo è in contatto con la parete uterina laterale al otocyst iniettata e l&#39;anodo è in contatto con la parete uterina adiacente alla otocyst non iniettati delle cavie. Attivare un quadrato treno di impulsi d&#39;onda con l&#39;interruttore a pedale sul elettroporatore. Parametri di elettroporazione sono: 5, 50 msec impulsi a 43 volt per impulso e 950 msec ritardo interpulso. Immediatamente irrigare l&#39;utero dopo il treno di impulsi viene consegnato. Registrare la corrente erogata al tessuto: 60-100 mAmps è sufficiente per trasfettare progenitori epiteliali dell&#39;orecchio. Iniettare e elettroporare 4-6, gli embrioni E11.5 per diga. </li><li> Effettuare un secondo, microiniezione indipendente transuterine acquosa di destrano fluorescente (Alexa 488 se il plasmide di espressione codifica una proteina fluorescente rossa o Alex Fluor 594 se il plasmide di espressione codifica una proteina verde fluorescente) nel ventricolo 4 ° di tali embrioni cui interno orecchie accuratamente iniettato e almeno 60 mAmps di corrente per impulso era delivered durante l&#39;elettroporazione. Il destrano fluorescente sarà rilevabile al momento della nascita nel cervello posteriore e consentire la selezione di cuccioli cui interno sono state manipolate le orecchie durante l&#39;embriogenesi (vedi 3.5). </li><li> Irrigare le corna uterine con il Ringer lattato. Reinserire le corna uterine nella cavità addominale. Sciacquare la cavità uterina con 2-4 ml di preriscaldata, soluzione di Ringer lattato e consentire l&#39;overflow di drenare fuori dal sito di incisione sul telino sterile. Sostituire il drappeggio a secco, materiale sterile. Suturare la parete addominale con un non-taglio ago e un 6-0 sutura riassorbibile. Si preferisce un filza, bloccando ogni punto altro, sia per la parete addominale e la pelle. </li><li> Asciugare fur le dighe &#39;e amministrare un non-steroidei anti-infiammatori come il Meloxicam per iniezione sottocutanea. Riportare la diga per la gabbia di recupero preriscaldata in un telino sterile. Monitorare e registrare le respirazioni dighe &quot;, sito pervietà dell&#39;incisione e della vagina per lo scarico di sangue. Il sanguinamento è rari, ma se presente e senza sosta, l&#39;eutanasia la diga, mentre lei è ancora sotto anestesia. Nota: il momento in cui riprende conoscenza e tenta di deambulare. Riportare la diga per la colonia del mouse quando mostra segni di mangiare e bere e ha iniziato a costruire il nido. In genere, questo si verifica entro 12 ore. </li><li> Alla nascita (postnatali giorno 0), il flash della regione rombencefalo di ogni pup nella lettiera per rilevare la fluorescenza destrano utilizzando un microscopio stereofluorescence dissezione con GFP o Texas Red filtro impostato a seconda dei casi. Ritorna alla diga di allattamento solo i cuccioli che visualizzano l&#39;etichettatura rombencefalo. </li></ol> 4. Risultati rappresentativi <img src="/files/ftp_upload/3653/3653fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Elettroporazione trasferimento genico mediato alla coclea sviluppo. La otocyst E11.5 stato iniettato un plasmide di espressione codifica maggiore proteina fluorescente verde (EGFP) ed elettroporati (impulsi TRAnei parametri: cinque, 43 impulsi volt a 50 msec / impulsi e 950 msec di ritardo interpulso). A) Un orecchio rappresentante interno da un giorno postnatale 6 (P6) cucciolo otocyst cui è stato iniettato e elettroporate E11.5 a dimostrare l&#39;espressione EGFP dalla base attraverso il turn centro della coclea. La parete laterale della coclea è stato rimosso dal mezzo giro e solo apice. E11.5 progenitori che danno origine al vertice non sono state trasfettate. B) mount intero immunocolorazione della coclea in (A) con il marcatore delle cellule dei capelli, 7a miosina (MYO7A), indica che l&#39;espressione EGFP segue la traiettoria dell&#39;organo del Corti ed è grossolanamente localizzato l&#39;epitelio capelli cellula portante sensoriale. C) Un orecchio rappresentante interno da un embrione E18.5 otocyst cui è stato iniettato e elettroporate a E11.5. La proiezione laser confocale dimostra espressione EGFP in MYO7A-positivi cellule ciliate sensorie. D) la proiezione laser confocale dell&#39;epitelio cocleare sensoriale dell&#39;organo del Corti E18.5 indicando EGFP expression nelle cellule ciliate interne (IHC), le cellule ciliate esterne (OHC), le cellule interne phalangial (IPC), cellule pilastro (pc), e le cellule Deiters &#39;(dc). La barra della scala in (B) si applica a (A).

<ol><li>Gillespie, P. G., Muller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+by+hair+cells%3A+models%2C+molecules%2C+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms.</a> Cell. 139, 33-44 (2009).</li>
<li>Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+and+morphogenesis+of+the+vertebrate+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear.</a> Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).</li>
<li>Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cell+fate+in+the+sensory+epithelia+of+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner ear.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 837-849 (2006).</li>
<li>Ohyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signaling+is+necessary+for+patterning+the+sensory+and+nonsensory+regions+of+the+developing+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">BMP signaling is necessary for patterning the sensory and nonsensory regions of the developing mammalian cochlea.</a> J. Neurosci. 30, 15044-15051 (2010).</li>
<li>Pan, W., Jin, Y., Stanger, B., Kiernan, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+is+required+for+the+generation+of+hair+cells+and+supporting+cells+in+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Notch signaling is required for the generation of hair cells and supporting cells in the mammalian inner ear.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15798-15803 (2010).</li>
<li>Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Mitchell, J. C., Ricci, A. J., Brigande, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+auditory+hair+cells+produced+in+the+mammalian+cochlea+by+in+utero+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional auditory hair cells produced in the mammalian cochlea by in utero gene transfer.</a> Nature. 455, 537-541 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%22">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals</a>. , 8th edn, The National Academy Press. (2010).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).</li>
<li>Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+electroporation+theories%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Biol.+Eng.+Comput%22%5BJournal%5D)">Membrane electroporation theories: a review.</a> Med. Biol. Eng. Comput. 44, 5-14 (2006).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).</li>
<li>Brigande, J. V., Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Jungwirth, J. J., Bresee, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-mediated+gene+transfer+to+the+developing+mouse+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation-mediated gene transfer to the developing mouse inner ear.</a> Methods Mol. Biol. 493, 125-139 (2009).</li>
<li>Morsli, H., Choo, D., Ryan, A., Johnson, R., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+mouse+inner+ear+and+origin+of+its+sensory+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of the mouse inner ear and origin of its sensory organs.</a> J. Neurosci. 18, 3327-3335 (1998).</li>
<li>Sher, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+and+postnatal+development+of+the+inner+ear+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse.</a> Acta. Otolaryngol. , Suppl 285. 1-77 (1971).</li>
<li>Sheffield, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vector+tropism+for+supporting+cells+in+the+developing+murine+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Viral vector tropism for supporting cells in the developing murine cochlea.</a> Hear Res. 277, 28-36 (2011).</li>
<li>Bedrosian, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+delivery+of+recombinant+viruses+to+the+fetal+murine+cochlea%3A+transduction+characteristics+and+long-term+effects+on+auditory+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">In vivo delivery of recombinant viruses to the fetal murine cochlea: transduction characteristics and long-term effects on auditory function.</a> Mol. Ther. 14, 328-335 (2006).</li>
<li>Reisinger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+functional+equivalence+of+otoferlin+and+synaptotagmin+1+in+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Probing the functional equivalence of otoferlin and synaptotagmin 1 in exocytosis.</a> J. Neurosci. 31, 4886-4895 (2011).</li>
<li>Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Gateway+to+MultiSite+Gateway+in+one+recombination+event%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event.</a> BMC Mol. Biol. 7, 46(2006).</li>
<li>Perret-Gentil, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPerret-Gentil%2C+M+%22Principles+of+Veterinary+Suturing%22">Principles of Veterinary Suturing</a>. , The University of Texas at San Antonio. Forthcoming.</li>
<li>Oesterle, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOesterle%2C+A+%22P-1000+%26+P-97+Pipette+Cookbook%22">P-1000 & P-97 Pipette Cookbook</a>. , Sutter. (2011).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Trasferimento del gene per l&#39;orecchio del mouse in via di sviluppo interno: L&#39;orecchio interno del mouse si sviluppa dalla placode otic durante la prima settimana di sviluppo post-impianto 12,13. Di giorno embrionale 9.5 (E9.5), il placode ha invaginato e trasformato in una vescicola piena di liquido chiamato otocyst 2. Precursori Otic in vescicole dare origine alle cellule sensoriali e nonsensory all&#39;interno dell&#39;orecchio interno matura così come i neuroni che inne...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Micro Caso sterilizzazione </td><td> ROBOZ </td><td> RS-9900a </td><td> 8X8.5X1.25 pollici </td></tr><tr><td> Ball-punta forbici </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 14109-09 </td><td></td></tr><tr><td> Anello pinza </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 11106-09 </td><td> 4,8 millimetri ID/6mm OD </td></tr><tr><td> Adson tessuto Pinza </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 11027-12 </td><td></td></tr><tr><td> Needle conducente </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 12502-12 </td><td></td></tr><tr><td> Allergy siringa Tray </td><td> Becton Dickison </td><td> 305536 </td><td></td></tr><tr><td> Suture 6-0 </td><td> Syneture </td><td> GL-889 </td><td> 0,7 sutura metrica gastrointestinale </td></tr><tr><td> Ringer lattato iniezione USP </td><td> Baxter </td><td> 2B2323 </td><td></td></tr><tr><td> Veloce verde </td><td> Sigma Aldrich </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> Capillare di vetro borosilicato </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 30-0053 </td><td></td></tr><tr><td> Soluzione di sodio Nembutal </td><td> OVATION Pharmaceuticals Inc. </td><td> NDC 67386-501-52 </td><td></td></tr><tr><td> MgSO4.7H2O </td><td> Fisher Scientific </td><td> M63-500 </td><td></td></tr><tr><td> Glicole propilenico </td><td> Fisher Scientific </td><td> P355-1 </td><td></td></tr><tr><td> Etanolo </td><td> Sigma Aldrich </td><td> E7023-500 </td><td></td></tr><tr><td> Meloxicam </td><td> Boehringer Ingeheim </td><td> NADA 141-219 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipetta Puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> P-97 </td><td> FB255B filamento box; consultare Cookbook pipetta da strumenti Sutter </td></tr><tr><td> Microelettrodo Beyeler </td><td> Sutter Instruments </td><td> BV-10 </td><td> Disco smussatura 104C per pipette di grandi dimensioni, consultare il manuale per smussare la teoria </td></tr><tr><td> Micropipetta titolare </td><td> Warner Instruments </td><td> MP-S15T </td><td> Per pipette 1,5 millimetri di diametro esterno e la porta di pressione femmina per tubi Picospritzer. </td></tr><tr><td> Pinzetta-style elettrodo </td><td> Protech International Inc. </td><td> CUY650P5 </td><td> 5 mm di diametro esterno </td></tr><tr><td> Piazza Onda Elettroporatore </td><td> Protech International Inc. </td><td> CUY21EDIT </td><td> Pedale raccomandata </td></tr><tr><td> PICOSPRITZER III </td><td> Parker Hannifin </td><td> 051-0500-900 </td><td> Pedale raccomandata </td></tr><tr><td> Controllo manuale Micromanipolatore </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 640056 </td><td></td></tr><tr><td> Flusso laminare orizzontale banco pulito </td><td> Envirco </td><td></td><td> Modifiche personalizzate LF 630-10554. Vedi informazioni supplementari per disegno dello schema cappuccio. </td></tr><tr><td> Leica stereofluorescence dissezione microcope con motore Lumencor SOLA luce </td><td> Bartels e Stout e Lumencor </td><td> MZ10F con motore Lumencor SOLA luce </td><td> Footpedals di concentrare i MZ10F e per attivare l&#39;illuminatore SOLA sono raccomandati </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 destrano </td><td> Invitrogen </td><td> D22913 </td><td> 10mg/ml, acquoso </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 destrano </td><td> Invitrogen </td><td> D22910 </td><td> 10mg/ml, acquoso </td></tr><tr><td> Enviro-dri </td><td> Pastore Altre PapERS </td><td></td><td> <a href="http://www.ssponline.com" target="_blank">www.ssponline.com</a> </td></tr></tbody></table>

gene transfer per l&#39;orecchio del mouse sviluppo inner<em&gt; in vivo</em&gt; elettroporazione

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

L&#39;orecchio interno dei mammiferi ha 6 epiteli sensoriali distinti: 3 creste in ampolle dei canali semicircolari, macule nel utricolo e sacculo, e l&#39;organo del Corti nella coclea a spirale. Le creste e macule contengono cellule ciliate vestibolari che trasducono stimoli meccanici per la pongono al servizio della speciale senso di equilibrio, mentre le cellule uditive dei capelli in dell&#39;organo del Corti sono i trasduttori primari per l&#39;audizione 1. Il destino specifica cella in questi epiteli sensoriali e morfogenesi dei canali semicircolari e la coclea hanno luogo durante la seconda settimana di gestazione nel topo e sono in gran parte completati prima della nascita 2,3. Studi sullo sviluppo dell&#39;orecchio interno del mouse sono regolarmente condotti da raccolta embrioni transgenici in diverse fasi embrionali o post-natale al fine di conoscere le basi molecolari di cellulare e / o morfologica fenotipi 4,5. Ipotizziamo che il trasferimento del gene per l&#39;orecchio interno del mouse in via di sviluppo in utero &lt;/ Em&gt; nel contesto di guadagno-e la perdita di funzione studi rappresenta un approccio complementare alla transgenesi mouse tradizionale per l&#39;interrogatorio dei meccanismi genetici alla base dei mammiferi lo sviluppo dell&#39;orecchio interno 6. Il paradigma sperimentale per condurre studi misexpression gene nel topo in via di sviluppo dell&#39;orecchio interno dimostrato qui si risolve in tre fasi generali: 1) laparotomia ventrale; 2) microiniezione transuterine e 3) elettroporazione in vivo. Laparotomia ventrale è una tecnica di sopravvivenza del mouse che permette di esternalizzazione chirurgica dell&#39;utero per accedere sperimentale per gli embrioni impiantati 7. Microiniezione Transuterine è l&#39;uso di smussati, micropipette capillari di vetro per introdurre plasmide di espressione nel lume della vescicola otica o otocyst. In vivo elettroporazione è l&#39;applicazione di onda quadra, diretti impulsi di corrente per guidare l&#39;espressione plasmidico in 8-10 cellule progenitrici. 11. Mouse tecniche sperimentali embriologici può essere difficile da imparare dalla prosa e immagini fisse da solo. Nel presente lavoro, dimostriamo i 3 passaggi della procedura di trasferimento genico. La maggior parte critica, abbiamo distribuire microscopia video digitale per mostrare con precisione come: 1) identificare l&#39;orientamento dell&#39;embrione in utero, 2) riorientare embrioni per il targeting iniezioni al otocyst; 3) microinject DNA miscelata con una soluzione tracciante colorante nella otocyst al giorno e 11,5 embrionali 12,5; 4) elettroporare il otocyst iniettato; e 5) embrioni etichette elettroporate per la selezione post-natale alla nascita. Forniamo esempi rappresentativi di successo trasfettate orecchio interno, di una guida pittorica per le cause più comuni di mistargeting otocyst, discutere su come evitare i più comuni errori metodologici e attuali orientamenti per la scrittura di un utero in gene trasferimento degli animali protocollo di cura.

L&#39;orecchio interno è un topo placode derivato il cui organo sensoriale per lo sviluppo del programma è elaborato durante la gestazione. Definiamo uno<em&gt; In utero</em&gt; Tecnica di trasferimento genico composto da tre fasi: laparotomia ventrale del mouse, microiniezione transuterine e<em&gt; In vivo</em&gt; Elettroporazione. Usiamo la microscopia video digitale per dimostrare le critiche tecniche sperimentali embriologici.

Gene Transfer per l&#39;orecchio del mouse Sviluppo Inner<em&gt; In Vivo</em&gt; Elettroporazione

L'orecchio interno dei mammiferi presenta 6 distinti epiteli sensoriali: 3 creste nelle ampolle dei canali semicircolari; le macule nell'utricolo e nel sacculo; e ...

Jane si è trasferita all'orecchio interno del topo in via di sviluppo mediante elettroporazione in vivo di Ling Wang, Han Jang e John Burgandy, Centro di Ricerca sull'Udito dell'Oregon, Università delle Scienze della Salute dell'Oregon. Ok. Mi chiamo John Burgandy. Il mio laboratorio si trova presso il Centro di Ricerca sull'Udito dell'Oregon dell'Università delle Scienze della Salute dell'Oregon.Mi chiamo Ang. Sono un ricercatore nel laboratorio di John. Sono anche Ang nel laboratorio di John come assistente di ricerca.La nostra presentazione è suddivisa in quattro parti. La prima è la laparotomia ventrale. Illustreremo l'anestesia a base di pentobarbital sodico, come verificare l'adeguatezza dell'anestesia, la protezione della cornea, la preparazione del sito chirurgico, la disinfezione, il modulo dati per interventi chirurgici di sopravvivenza nei topi, l'incisione mediana ventrale nell'ambiente chirurgico attraverso la cute e la parete addominale ed esternazione dei corni uterini.La seconda parte riguarda la microiniezione transuterina. Illustreremo la transilluminazione dell'embrione, il riorientamento dell'embrione, la fabbricazione della pipetta, la microiniezione e l'iniezi

gene-transfer-to-developing-mouse-inner-ear-vivo

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

In Utero iniezione intraventricolare e Elettroporazione di E15 embrioni di topo

Un metodo per fornire Morpholinos direttamente nel otocyst pesce zebra a 24hpf è stato sviluppato. Mediante microiniezione di Morpholinos nel lume del vescicola otica ed elettroporazione di effettuare la penetrazione, siamo stati in grado di bypassare l'effetto di Morpholinos sul cervello e ottenere effetti specifici per l'orecchio interno.

Consegna diretta di Morpholinos MIF Into the Otocyst Zebrafish di iniezione e di elettroporazione influenza lo sviluppo dell&#39;orecchio interno

Trasfezione delle cellule gangliari della retina di topo In vivo Elettroporazione

Un metodo per l'incorporazione di DNA plasmidico in cellule murine della retina allo scopo di effettuare sia guadagno o la perdita di studi di...

In elettroporazione in vivo di Retina topo in via di sviluppo

Un metodo di trasferimento genico nel cervello del mouse di sviluppo è descritta utilizzando un metodo unico chirurgico e la forma speciale di elettrodi. Questa tecnica unica consente la trasfezione di DNA plasmidico temporalmente e spazialmente, che aiuterà molti neuroscienziati a studiare lo sviluppo del cervello.

Mouse in Utero elettroporazione: controllato Transefection Gene spazio-temporale

Fonte: Denaxa, M., el al., Trapianto di progenitori interneuronali corticali chemiogeneticamente modificati in cervelli di topo postnatali precoci. J. Vis. Exp. (2019)Questo video mostra la procedura per iniettare un vettore plasmidico che trasporta il gene di interesse nei progenitori degli interneuroni in una fetta di cervello embrionale, seguita dall'elettroporazione per l'ingresso nel plasmide e l'espressione genica. Questi progenitori modificati possono essere successivamente utilizzati...

Trasferimento genico assistito da elettroporazione incorporato in agarosio nei progenitori degli interneuroni corticali di topo

Presentiamo un metodo che descrive l'isolamento e la coltura di espianti cocleari dall'orecchio interno di topo embrionale.  Dimostriamo anche un metodo per il trasferimento genico in espianti cocleari tramite elettroporazione a onda quadra. La coltura di espianti in vitro abbinata alla tecnica di trasferimento genico consente ai ricercatori di studiare gli effetti dell'alterazione dell'espressione genica durante lo sviluppo.

Cultura della embrionali di topo cocleari espianti e Gene Transfer con elettroporazione

L'organo uditivo media l'udito. Qui presentiamo un metodo di micro-elettroporazione in ovo modificato ottimizzato per lo studio della proliferazione e della differenziazione delle cellule progenitrici uditive nell'organo uditivo del pollo in via di sviluppo.

Gene Transfer nel pollo Auditory Organ<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-elettroporazione

In questo studio, descriviamo l'approccio del canale semicircolare posteriore come un metodo affidabile per la consegna del gene dell'orecchio interno in topi neonatali. Indichiamo che consegna del gene attraverso il canale semicircolare posteriore è in grado di irrorare l'intero orecchio interno.

Approccio del canale semicircolare posteriore per consegna del Gene dell'orecchio interno in Mouse neonatale

Qui descriviamo la procedura canalostomy che permette la consegna di droga locale nelle orecchie interno dei topi adulti e neonati attraverso il canale semicircolare con minimo danno alla funzione uditiva e vestibolare. Questo metodo può essere utilizzato per inoculare vettori virali, prodotti farmaceutici e le piccole molecole nell'orecchio interno del mouse.

Canalostomy come un approccio chirurgico alla consegna di droga locale nelle orecchie interno dei topi adulti e neonati

Il pulcino è un organismo modello economico, accessibile e ampiamente disponibile per una varietà di studi. Qui, una serie di protocolli è dettagliata per comprendere i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della rigenerazione dell'orecchio interno aviario.

Metodi Ovo ed Ex Ovo per studiare lo sviluppo dell'orecchio interno aviario

Scopri il trasferimento genico nell'orecchio interno del topo mediante elettroporazione in utero. Questa tecnica combina laparotomia, microiniezione e elettroporazione per studiare lo sviluppo dell'udito.

Gene Transfer per l'orecchio del mouse Sviluppo Inner

Esplora altri video