Preparazione del campione di Mycobacterium tuberculosis Estratti di studi di risonanza magnetica nucleare metabolomica

Lo scopo di questa procedura è analizzare il mycobacterium tuberculosis, estratti privi di cellule mediante prima coltura di metabolomica NMR e raccogliere le cellule in un appropriato stadio di crescita. Quindi cellule di lisa e ottenere estratti privi di cellule per l'analisi. Risospendere gli estratti liofilizzati in tampone per l'analisi NMR.

Infine, raccogli i dati NMR e analizza gli spettri con il software per identificare i metaboliti. In definitiva, l'analisi NMR del mycobacterium tuberculosis viene utilizzata per mostrare la conservazione dei livelli di metaboliti in vari trattamenti. La metabolomica NMR può essere applicata ad aspetti chiave della fisiologia del Mycobacterium tuberculosis, come importanti vie metaboliche.

Questa comprensione è fondamentale per chiarire i meccanismi di azione e resistenza ai farmaci e per identificare nuovi bersagli per la progettazione di farmaci. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avrebbero difficoltà a causa dell'incapacità di gestire tutti i campioni esattamente allo stesso modo, il che introdurrà variazioni e risultati non necessari dal mio laboratorio. Il dottorando Steven Luka dimostrerà le procedure per gestire i campioni per l'elaborazione NMR Dal mio laboratorio, il responsabile del laboratorio di ricerca e Robert Fenton, tecnico di ricerca tre, dimostreranno ora le procedure per gestire le colture di mycobacterium tuberculosis durante l'esecuzione della tubercolosi M.

La ricerca ha seguito le pratiche di biosicurezza di livello tre come definito dalle linee guida istituzionali. Sebbene le etichette in questo video indichino microbacterium tuberculosis per considerazioni di biosicurezza, questa dimostrazione ha utilizzato il micobatterio magmatico non patogeno. Inizia scongelando una scorta di glicerolo al 50% di M tuberculosis su ghiaccio.

Inoculare 0,15 millilitri in 110 millilitri di brodo M-A-D-C-T-W nell'ER da 250 millilitri e il mio pallone fa crescere le colture a 37 gradi Celsius con agitazione a 100 giri/min per circa sei giorni. Se non sono necessari antibiotici, aggiunte alternative o altri trattamenti. Raccogli le colture per le colture che richiedono trattamenti.

Riserva un Eloqua da 0,5 millilitri su ghiaccio per la coltura, la titolazione e il controllo qualità. Quindi eseguire il trattamento desiderato e riposizionare le colture nell'agitatore dopo il periodo di trattamento. Rimuovere un millilitro e determinare l'OD 600.

Inoltre, riservare un campione da 0,5 millilitri per la coltura, la titolazione e il controllo qualità. Mantenere le cellule in ghiaccio per tutto il protocollo rimanente. Raccogliere le cellule in quattro provette da 50 millilitri mediante centrifugazione dopo il lavaggio con 15 millilitri di acqua ghiacciata a doppia distillazione.

Reese sospende i pellet in aliquote da 10 millilitri. Estrarre due aliquote e pellettare per centrifugazione, quindi risospendere il pellet della cella in un volume finale di un millilitro di acqua distillata doppia. Se si desidera una sospensione a singola cellula priva di grumi, far passare le cellule attraverso un ago calibro 27.

Per tre volte procedere a trasferire la sospensione cellulare da un millilitro in un tappo a vite da due millilitri contenente la matrice di lisi B.Posizionare l'omogeneizzatore di lisi fast prep 24 all'interno della cabina di biosicurezza. Posizionare i campioni nel supporto del campione fissando la piastra del raggio di ritenzione. Quindi lavorare per 60 secondi a una velocità di sei metri al secondo.

Quindi, centrifugare i campioni per ottenere detriti di celle a pellet e celle intatte. Quindi passare il supinato attraverso un filtro per siringa da 0,2 micron in una provetta sterile per controllare l'assenza di cellule vitali. Piastra 0,1 millilitri di campione su MADC. Agar.

Congelare i campioni in un bagno di ghiaccio secco di etanolo e conservarli a meno 80 gradi Celsius fino a quando non sono pronti per essere liofilizzati e processati in un impianto NMR. Dopo due mesi, controllare le piastre per verificare l'assenza di unità formanti colonie. Se non viene trovato alcun utilizzatore di FC, i campioni possono essere prelevati dal laboratorio BSL 3 per ulteriori analisi in una struttura NMR standard.

Dopo aver portato i campioni all'essiccazione, risospenderli in 0,7 millilitri di tampone NMR e trasferirli in una centrifuga a provette per microcentrifuga per tre minuti a 13.000 volte. G, rimuovere 0,6 millilitri e trasferire in un tubo NMR da cinque millimetri. Dall'analisi dei fluidi, un rack personalizzato facilita il caricamento di più provette NMR negli spinner alla profondità corretta.

Quindi trasferire i campioni allo spettrometro NMR per inserirli in A-B-A-C-S uno scambiatore di campioni da 20. Alternanza tra colture non trattate e trattate con farmaci. Il primo campione deve essere precaricato nel magnete all'inizio di una corsa automatizzata.

Per calibrare lo strumento, ottimizzare la lunghezza dell'impulso di 90 gradi con un singolo campione e sintonizzare lo strumento per i campioni rimanenti. Usa l'icona NMR e lo spessore graduato. Automatizza il bloccaggio, lo spessoramento e la raccolta dei dati NMR per ogni campione.

Per uno spettro NMR di idrogeno 1D, selezionare la sequenza di impulsi con soppressione dell'acqua e scultura dell'eccitazione. Imposta un totale di 32.000 punti dati, 128 scansioni e 16 scansioni fittizie per uno spettro QC di due DH e C 13 hs. Selezionare la sequenza di impulsi.

Selezionare un totale di 2048 punti dati con larghezza di sweep lungo la quota H 1 diretta e 64 punti dati con larghezza di sweep lungo la quota C 13 indiretta. Specificare anche la raccolta dello spettro con 128 scansioni e 16 scansioni fittizie per ottenere un buon rapporto segnale/rumore. Uno spettro di m tuberculosis ha generato circa 400 picchi, inclusi 50 metaboliti noti.

Ad esempio, l'elaborazione dei dati, come descritto nel manoscritto di accompagnamento, ha prodotto questo spettro di metaboliti che sono direttamente o indirettamente associati alla via della D alanina. L'entità delle intensità di picco è proporzionale alle concentrazioni di metaboliti presenti nell'estratto cellulare, quindi le perturbazioni relative nei metaboliti e nelle vie metaboliche possono essere quantificate tra campioni e trattamenti. La metabolomica LMR apre la strada alle ricerche nel campo della batteriologia per esplorare la fisiologia e la patogenesi nei microrganismi visivi e nei microbatteri, altri microrganismi patogeni o non patogeni.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare più estratti di cellule di tubercolosi per la metabolomica NMR e, soprattutto, mantenere la coerenza durante l'intero protocollo per ottenere risultati affidabili.