Estrazione del DNA micobatterico mediante battitura del tallone in tampone personalizzato seguita da flusso di lavoro NGS

La nostra ricerca diagnostica si concentra sul miglioramento dell'individuazione della resistenza ai farmaci nella tubercolosi in contesti con risorse limitate, con particolare attenzione alla velocità e al pragmatismo. Nella diagnostica della tubercolosi, ci sono test genotipici più completi e persino un certo numero di nuovi test fenotipici rapidi, e ci sono spinte costanti per avvicinare questi test al punto di cura. Ma ci sono una serie di barriere pragmatiche che esistono ancora.

Le sfide in termini di risorse, dai reagenti alle infrastrutture alla logistica, continuano a rappresentare ostacoli significativi. Al di là della sofisticazione tecnica di un test Cepheid Xpert, la standardizzazione del protocollo è difficile in diversi contesti. Quindi, l'estrazione del DNA MTB, come descritto in dettaglio in questo lavoro qui, è un ottimo esempio di ciò.

C'è una necessità fondamentale di espandere la diagnostica della tubercolosi basata sul sequenziamento, ma molti laboratori non hanno ancora un modo affidabile per estrarre DNA di alta qualità. Il nostro obiettivo è condividere un metodo semplice, pratico e adatto a un punto di cura con poche risorse. Qui presentiamo un protocollo semplice e a basso costo progettato per l'uso in contesti con risorse limitate.

È stato convalidato per applicazioni NGS ed è compatibile con i sistemi automatizzati di manipolazione dei liquidi. Per iniziare, combina la soluzione di cloruro di sodio Tris cloridrato, Triton X 100 e EDTA per creare il tampone Triton. Mescolare mescolando e aggiungere acqua ultrapura fino a raggiungere un volume finale di 100 millilitri.

Filtro: sterilizzare il tampone prima dell'uso. Successivamente, preparare 100 millilitri di tampone Tris-EDTA a basso contenuto di EDTA combinando un millilitro di Tris-HCl monomolare e 20 microlitri di EDTA 0,5 molari. Mescolare e riempire con acqua ultrapura fino a raggiungere un volume finale di 100 millilitri.

Quindi filtrare sterilizzare il tampone. Per preparare le provette di lisi, utilizzare una lama di bisturi per tagliare con cura il fondo di una provetta con tappo a vite da 1,5 millilitri appena sotto il punto di inflessione. Tagliare il puntale di un puntale per pipetta P1000 e creare un cuneo a forma di V vicino all'estremità.

Incastrare la parte inferiore tagliata della provetta con tappo a vite nella punta della pipetta a forma di V per formare un misurino. Riempire un contenitore sterile con perle di silicato di zirconia da 0,1 millimetri. Usando il misurino preparato, trasferire circa 200 milligrammi di perline in tubi con tappo a vite da 1,5 millilitri.

Per la preparazione della coltura cellulare batterica, trasferire cinque millilitri di coltura di mycobacterium tuberculosis in una provetta da centrifuga conica da 15 millilitri. Centrifugare alla massima velocità per 10 minuti. Ora usa una pipetta sierologica da 10 millilitri per rimuovere con cura tutti i microlitri di surnatante tranne circa 500 senza disturbare il pellet.

Utilizzare una pipetta P1000 per rimuovere il surnatante rimanente. Risospendere il pellet in 350 microlitri di tampone tritone personalizzato, quindi mescolare bene pipettando su e giù. Riscaldare il campione in un bagno di calore secco per 30 minuti a 95 gradi Celsius.

Per preparare l'espettorato, trasferire da uno a cinque millilitri di campione di espettorato in una provetta da centrifuga sterile da 50 millilitri. Per eseguire la liquefazione del ditiotreitolo, aggiungere quattro volumi di ditiotreitolo da 10 millimolari al campione di espettorato, quindi agitare accuratamente per 30 secondi. Centrifugare il campione alla massima velocità per 10 minuti.

Quindi utilizzare una pipetta sierologica da 10 millilitri per scartare tutto tranne 500 microlitri del surnatante. Rimuovere il resto del surnatante con una pipetta P1000 senza disturbare il pellet. Risospendere il pellet in 350 microlitri di tampone tritone personalizzato.

Per eseguire la liquefazione dell'idrossido di sodio NALC, aggiungere quattro volumi della soluzione di idrossido di sodio NALC al campione di espettorato. Agitare il composto per 30 secondi. Quindi incubare la provetta per sette minuti a temperatura ambiente.

Ora aggiungi PBS fino a 50 millilitri. Agitare il contenuto della provetta per amalgamare bene, quindi centrifugare la provetta alla massima velocità per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, con una pipetta sierologica da 50 millilitri, scartare il surnatante come dimostrato in precedenza.

Quindi risospendere il pellet in 350 microlitri di tampone tritone personalizzato. Innanzitutto, trasferire 350 microlitri di campione inattivato in una provetta etichettata da 1,5 millilitri con tappo a vite contenente 250 microlitri di perle di silicato di zirconia da 0,1 millimetri. Bead batte il lisato a 6,5 metri al secondo per 45 secondi con due minuti di riposo tra i cicli.

Centrifugare il campione alla massima velocità per due minuti, quindi trasferire 150 microlitri di surnatante in una nuova provetta etichettata. Successivamente le perle magnetiche di pulizia del vortice che sono state equiparate a temperatura ambiente per 30 minuti, per risospenderle. Trasferire 180 microlitri di microsfere magnetiche sul campione di DNA.

Pipet su e giù 10 volte per mescolare. Dopo un'incubazione di due minuti a temperatura ambiente, posizionare la provetta su un rack magnetico e attendere due minuti che la soluzione si liberifichi. Quindi utilizzare una pipetta da 200 microlitri per scartare il surnatante.

Con la provetta ancora sulla rastrelliera magnetica, aggiungi 500 microlitri di etanolo al 70% appena preparato lungo la parete opposta e attendi 30 secondi. Al termine dell'ultimo lavaggio, rimuovere l'etanolo residuo con una pipetta da 10 microlitri e asciugare all'aria per due minuti. Non appena le perle diventano opache, rimuovere la provetta dalla rastrelliera magnetica.

Risospendere in 20 microlitri di tampone Tris a basso EDTA. Miscelare mediante pipettaggio o vortice per assicurarsi che tutte le perle siano in soluzione prima di un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, posizionare la provetta su una griglia magnetica per due minuti fino a quando non è trasparente.

Quindi trasferire meno di 20 microlitri di DNA eluiato in una nuova provetta etichettata per evitare il trascinamento delle microsfere. Per quantificare il DNA micobatterico utilizzando una PCR quantitativa mirata a 99 nucleotidi dell'atpE micobatterico, assemblare una master mix QPCR su ghiaccio. Regolare la master mix in base alla quantità di campioni e agli standard, inclusa un'eccedenza del 10% per tenere conto della perdita di pipettaggio.

Far funzionare il termociclatore a 95 gradi Celsius per 60 secondi, seguiti da 35 cicli di 95 gradi Celsius per 10 secondi e 60 gradi Celsius per 30 secondi con una velocità di rampa di 2,11 gradi Celsius al secondo. Esegui tutti i campioni, gli standard e i controlli in triplice copia. Qui, le colture di Mycobacterium tuberculosis hanno prodotto le più alte concentrazioni di DNA tra tutte le condizioni testate.

I campioni di espettorato addizionato hanno mostrato rese di DNA progressivamente più basse e una maggiore variazione con la diminuzione dell'input batterico, specialmente nel gruppo dei 10.000 batteri.