Name: Estrazione del DNA micobatterico mediante battitura del tallone in tampone personalizzato seguita da flusso di lavoro NGS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Scopri un metodo rapido per estrarre DNA da Mycobacterium tuberculosis usando bead-beating e purificazione con perline magnetiche. Questo protocollo supporta applicazioni NGS anche in contesti con risorse limitate.

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Questo studio è stato condotto presso l'Università della California di San Francisco (UCSF) con l'approvazione del Comitato Istituzionale per la Biosicurezza (BUA #BU198320-01GBUA/BABB) e segue le linee guida etiche della ricerca UCSF. Abbiamo ottenuto campioni di espettorato residuo raccolti da Discovery Life Sciences nell'ambito di un protocollo di rinuncia al consenso approvato dall'IRB da individui con condizioni respiratorie non tubercolari.
1. Preparazione dei tamponi
<ol>
	<li>Tampone Triton personalizzato (Tabella 1): per preparare 100 mL di tampone Triton personalizzato, iniziare combinando 2 mL di NaCl 5 M, 1 mL di Tris-HCl 1 M (pH 8), 1 mL di Triton X-100 e 0,2 mL di acido etilendiamminotetraacetico 0,5 M (EDTA). Aggiungere acqua ultrapura per portare il volume totale a 100 ml. Sterilizzare il filtro prima dell'uso. Il tampone finale contiene 100 mM di NaCl, 10 mM di Tris-HCl, 1 mM di EDTA e l'1% di Triton X-100.</li>
	<li>Basso EDTA TE (Tabella 2): per preparare 100 mL di tampone Low EDTA TE, combinare 1 mL di Tris-HCl 1M (pH 8) e 0,02 mL di EDTA 0,5 M. Aggiungere acqua ultrapura per portare il volume totale a 100 ml. Il tampone finale contiene 10 mM di Tris-HCl e 0,1 mM di EDTA.</li>
</ol>
2. Preparazione delle provette di lisi
<ol>
	<li>Utilizzando una lama da bisturi, tagliare con cura il fondo di una provetta con tappo a vite da 1,5 mL appena sotto il punto di flesso.</li>
	<li>Tagliare la punta di una punta P1000, tagliare un cuneo a forma di V vicino all'estremità e incuneare al suo interno il fondo preparato del tubo con tappo a vite. Fare riferimento alla Figura 1 per uno schema del misurino.</li>
	<li>Riempire un contenitore sterile (ad es. un serbatoio o una capsula di Petri) con perle di silicato di zirconio da 0,1 mm e utilizzare il misurino preparato per distribuire un misurino di perle (~200 mg) in provette con tappo a vite da 1,5 mL.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68037/68037fig1.jpg"> 
Figura 1: Paletta di distribuzione del tallone interna. Il misurino è stato progettato per il facile trasferimento di ~200 mg di perle di zirconio da 0,1 mm in provette di lavorazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68037/68037fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
3. Preparazione dei contributi
NOTA: Tutta la preparazione dei campioni deve essere condotta secondo i protocolli di biosicurezza della struttura. Si consiglia vivamente di maneggiare materiali infettivi all'interno di una cabina di biosicurezza (BSC) di Classe II per ridurre al minimo il rischio di esposizione all'aerosol.
<ol>
	<li>Coltura cellulare batterica<ol>
		<li>Centrifugare ~ 5 mL di coltura di M. tuberculosis (MGIT o coltura liquida torbida) in una provetta da centrifuga conica da 15 mL alla massima velocità (≥ 3.000 x g) per 10 minuti.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, rimuovere con cura tutto il surnatante tranne ~ 500 μL senza disturbare il pellet. Rimuovere il surnatante rimanente con una pipetta P1000 senza disturbare il pellet.</li>
		<li>Risospendere il pellet in 350 μl di tampone Triton personalizzato pipettandolo su e giù. Se necessario (ad esempio, per rimuovere campioni per l'elaborazione al di fuori di un BSL-3), inattivare il campione secondo le procedure operative standard.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparazione dell'espettorato<ol>
		<li>Trasferire 1-5 mL di campione di espettorato (spontaneo o indotto) in una provetta da centrifuga sterile da 50 mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liquefazione DTT<ol>
		<li>Aggiungere quattro volumi di 100 mM di ditiotreitolo al campione di espettorato (il volume può variare). Se si utilizza un reagente commerciale, seguire le istruzioni di diluizione del produttore.</li>
		<li>Agitare accuratamente per 30 s. Incubare a temperatura ambiente (20-25 °C) per 7 min. Vortice di nuovo per 30 s.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 3.3.1. e 3.3.2. 1x, per campioni molto viscosi, eseguire fino a 5 cicli di incubazione-vortice.</li>
		<li>Centrifugare alla massima velocità (≥ 3.000 x g) per 10 min. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, scartare con cura tutto tranne ~ 500 μL del surnatante. Rimuovere il surnatante rimanente con una pipetta P1000 senza disturbare il pellet.</li>
		<li>Risospendere il pellet in 350 μl di tampone Triton personalizzato.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liquefazione NALC-NaOH<ol>
		<li>Per preparare la soluzione NALC-NaOH, seguire le istruzioni del produttore per la preparazione e la diluizione.</li>
		<li>Aggiungere quattro volumi di soluzione di NALC-NaOH al campione di espettorato (spontaneo o indotto, il volume può variare).</li>
		<li>Vortice per 30 s. Incubare a temperatura ambiente (20-25 °C) per 7 min. Ripetere i passaggi 3.4.1 e 3.4.2. 1x. Per campioni molto viscosi, eseguire fino a 5 cicli di incubazione-vortice.</li>
		<li>Aggiungere PBS al segno di 50 ml. Agitare brevemente per mescolare. Centrifugare alla massima velocità (≥ 3.000 x g) per 10 min.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta sierologica da 50 mL, scartare con cura tutto tranne ~ 500 μL del surnatante. Rimuovere il surnatante rimanente con una pipetta P1000 senza disturbare il pellet.</li>
		<li>Risospendere il pellet in 350 μl di tampone Triton personalizzato. Se necessario (ad esempio, per rimuovere campioni per l'elaborazione al di fuori di un BSL-3), inattivare il campione secondo le procedure operative standard.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Estrazione del DNA
<ol>
	<li>Trasferire la sospensione batterica inattivata (350 μL dalla fase 3) in una nuova provetta con tappo a vite da 1,5 mL ben marcata contenente ~250 μL di perle di silicato di zirconio da 0,1 mm.</li>
	<li>Bead ha battuto il lisato a 6,5 m/s per 45 s con 2 minuti di riposo tra le corse. Ripetere per un totale di tre cicli di battitura delle talline.</li>
	<li>Centrifugare alla massima velocità (≥ 12.000 x g) per 2 minuti e trasferire 150 μl di surnatante in una nuova provetta ben marcata. Fare attenzione a non trasferire perline o detriti cellulari.</li>
	<li>Lasciare che le perle magnetiche di pulizia si equilibrino a temperatura ambiente per 30 minuti e vorticare accuratamente per garantire una risospensione completa prima dell'uso.</li>
	<li>Aggiungere 180 μl (1,2x volume) di microsfere magnetiche di pulizia e mescolare pipettando su e giù 10x. Incubare a temperatura ambiente per 2 min.</li>
	<li>Posizionare su una griglia magnetica e attendere che la soluzione si liberifichi per ~ 2 min. Utilizzando una pipetta P200, scartare con cura il surnatante senza disturbare le microsfere magnetiche.</li>
	<li>Con la provetta ancora sulla rastrelliera magnetica, aggiungere 500 μl di etanolo al 70 % (v/v) appena preparato, erogando lungo la parete opposta della provetta alle microsfere magnetiche. Attendere 30 s.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 4.5. - 4.7. per un totale di due lavaggi. Al termine dell'ultimo lavaggio, rimuovere l'etanolo residuo con una pipetta P10. Asciugare brevemente le perline per ~ 2 min.</li>
	<li>Immediatamente dopo che il pellet di perlina diventa opaco, rimuovere la provetta dal rack magnetico e risospendere in 20 μl di tampone Tris a basso EDTA. Non lasciare che le perline si secchino e si screpolino.</li>
	<li>Miscelare mediante pipettaggio o vortice per assicurarsi che tutte le microsfere siano in soluzione. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.</li>
	<li>Posizionare su una griglia magnetica e attendere che la soluzione diventi limpida per ~ 2 min. Trasferire il DNA eluito in una nuova provetta ben marcata per l'analisi a valle. Aspirare &lt;20 μL di DNA estratto per evitare il carry-over delle biglie magnetiche.</li>
</ol>
5. Enumerazione qPCR del DNA micobatterico
<ol>
	<li>Per quantificare il DNA micobatterico utilizzando una PCR quantitativa mirata a 99 nucleotidi dell'atpE micobatterico (Rv1305), assemblare una miscela di reazione da 10 μL per campione su ghiaccio contenente 5 μL di miscela master per sonda universale (2x), 0,4 μL ciascuno di primer diretto (5'-AATTCCTGGTGTAGCGGTGG-3', 10 μM) e primer inverso (5'-GTTTACGGCGTGGACTACCA-3', 10 μM), 0,2 μL di sonda TaqMan (5'-VIC-AGGAGGAACACCGGTGGCGA-MGB-3', 10 μM), 2 μL di DNA stampo e 2 μL di acqua priva di nucleasi (Tabella 3).</li>
	<li>Eseguire la reazione utilizzando le seguenti condizioni di ciclo termico: denaturazione iniziale a 95 °C per 60 s, seguita da 35 cicli di 95 °C per 10 s e 60 °C per 30 s (con una cattura qui, utilizzando una velocità di rampa di 2,11 °C/s; Tabella 4). NOTA: In questo caso, la qPCR è stata eseguita utilizzando un test TaqMan con sonda marcata VIC su un sistema di PCR in tempo reale QuantStudio 3,</li>
	<li>Esegui tutti i campioni, gli standard e i controlli in triplicate tecniche. Generare curve standard utilizzando diluizioni seriali di DNA purificato di M. tuberculosis . Esegui analisi di quantificazione relativa utilizzando il software di analisi.</li>
	<li>Esporta i valori di quantificazione relativa risultanti in formato CSV e visualizzali utilizzando R Studio (versione 2024.09.1+394) per generare box plot che confrontano le rese di DNA tra i metodi di estrazione.</li>
</ol>

<ol><li>Jouet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+amplicon+sequencing+for+culture-free+prediction+of+susceptibility+or+resistance+to+13+anti-tuberculous+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Deep amplicon sequencing for culture-free prediction of susceptibility or resistance to 13 anti-tuberculous drugs.</a> Eur Respir J. 57 (3), 2002338(2021).</li>
<li>George, S., et al. DNA Thermo-Protection Facilitates Whole Genome Sequencing of Mycobacteria Direct from Clinical Samples by the Nanopore Platform. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGeorge%2C+S+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2020).</li>
<li>Doyle, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+whole-genome+sequencing+of+sputum+accurately+identifies+drug-resistant+mycobacterium+tuberculosis+faster+than+MGIT+culture+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct whole-genome sequencing of sputum accurately identifies drug-resistant mycobacterium tuberculosis faster than MGIT culture sequencing.</a> J Clin Microbiol. 56 (8), e00666-e00718 (2018).</li>
<li>Noordhoek, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+Specificity+of+PCR+for+Detection+of+Mycobacterium+Tuberculosis%3A+A+Blind+Comparison+Study+among+Seven+Laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and Specificity of PCR for Detection of Mycobacterium Tuberculosis: A Blind Comparison Study among Seven Laboratories.</a> J Clin Microbiol. 32, (1994).</li>
<li>Jaber, M., Rattan, A., Verma, A., Tyagi, J., Kumar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+DNA+extraction+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tubercle+Lung+Dis%22%5BJournal%5D)">A simple method of DNA extraction from Mycobacterium tuberculosis.</a> Tubercle Lung Dis. 76 (6), 578-581 (1995).</li>
<li>Käser, M., Ruf, M. T., Hauser, J., Marsollier, L., Pluschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+method+for+preparation+of+DNA+from+pathogenic+and+environmental+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimized method for preparation of DNA from pathogenic and environmental mycobacteria.</a> Appl Environ Microbiol. 75 (2), 414-418 (2009).</li>
<li>De Almeida, I. N., Da Silva Carvalho, W., Rossetti, M. L., Costa, E. R. D., De Miranda, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Six+Different+DNA+Extraction+Methods+for+Detection+of+Mycobacterium+Tuberculosis+by+Means+of+PCR-IS6110%3A+Preliminary+Study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Six Different DNA Extraction Methods for Detection of Mycobacterium Tuberculosis by Means of PCR-IS6110: Preliminary Study.</a> BMC Res Notes. 6, 561(2013).</li>
<li>Pan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+four+DNA+extraction+methods+for+detecting+Mycobacterium+tuberculosis+by+real-time+PCR+and+its+clinical+application+in+pulmonary+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of four DNA extraction methods for detecting Mycobacterium tuberculosis by real-time PCR and its clinical application in pulmonary tuberculosis.</a> J Thorac Dis. 5 (3), 251-257 (2013).</li>
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<li>Votintseva, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Same-day+diagnostic+and+surveillance+data+for+tuberculosis+via+whole-genome+sequencing+of+direct+respiratory+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Same-day diagnostic and surveillance data for tuberculosis via whole-genome sequencing of direct respiratory samples.</a> J Clin Microbiol. 55 (5), 1285-1298 (2017).</li>
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<li>Miyata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+quality+of+dna+extracted+by+two+techniques+from+mycobacterium+tuberculosis+for+fast+molecular+identification+and+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of the quality of dna extracted by two techniques from mycobacterium tuberculosis for fast molecular identification and genotyping.</a> Braz J Microbiol. 42 (2), 774-777 (2011).</li>
<li>Votintseva, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+DNA+extraction+for+whole-genome+sequencing+from+early+positive+liquid+%28MGIT%29+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial DNA extraction for whole-genome sequencing from early positive liquid (MGIT) cultures.</a> J Clin Microbiol. 53 (4), 1137-1143 (2015).</li>
<li>Kolia-Diafouka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Lysis-Extraction+Method+Combined+With+IS6110-Amplification+for+Detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+Paucibacillary+Sputum+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimized Lysis-Extraction Method Combined With IS6110-Amplification for Detection of Mycobacterium tuberculosis in Paucibacillary Sputum Specimens.</a> Front Microbiol. 9, 2224(2018).</li>
<li>Bonnet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Evaluation+of+GeneLEAD+VIII+DNA+Platform+Combined+to+Deeplex+Myc-TB+Assay+to+Detect+in+8+Days+Drug+Resistance+to+13+Antituberculous+Drugs+and+Transmission+of+Mycobacterium+tuberculosis+Complex+Directly+From+Clinical+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Evaluation of GeneLEAD VIII DNA Platform Combined to Deeplex Myc-TB Assay to Detect in 8 Days Drug Resistance to 13 Antituberculous Drugs and Transmission of Mycobacterium tuberculosis Complex Directly From Clinical Samples.</a> Front Cell Infect Microbiol. 11, 707244(2021).</li>
<li>Mann, B. C., et al. Systematic review and meta-analysis of protocols and yield of direct from sputum sequencing of Mycobacterium tuberculosis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMann%2C+BC+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Schwab, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+evaluation+of+nanopore+targeted+next-generation+sequencing+to+predict+drug-resistant+tuberculosis+from+native+sputum+in+South+Africa+and+Zambia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Field evaluation of nanopore targeted next-generation sequencing to predict drug-resistant tuberculosis from native sputum in South Africa and Zambia.</a> J Clin Microbiol. 63 (3), e0139024(2025).</li>
<li>Colman, R. E., Seifert, M., De la Rossa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+culture-free+targeted+next-generation+sequencing+for+diagnosing+drug-resistant+tuberculosis%3A+a+multicentre+clinical+study+of+two+end-to-end+commercial+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluating culture-free targeted next-generation sequencing for diagnosing drug-resistant tuberculosis: a multicentre clinical study of two end-to-end commercial workflows.</a> Lancet Infect Dis. 25 (3), 325-334 (2025).</li>
<li>Oberacker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-On-Magnetic-Beads+%28BOMB%29%3A+Open+platform+for+high-throughput+nucleic+acid+extraction+and+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Bio-On-Magnetic-Beads (BOMB): Open platform for high-throughput nucleic acid extraction and manipulation.</a> PLoS Biol. 17 (1), e3000107(2019).</li>
<li>Limberis, J. D., Metcalfe, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turbolysis%3A+A+low-cost%2C+small+footprint+alternative+to+commercial+bead+beaters+for+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22HardwareX%22%5BJournal%5D)">Turbolysis: A low-cost, small footprint alternative to commercial bead beaters for cell lysis.</a> HardwareX. 19, e00576(2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Perle di silicato di zirconio da 0,1 mm</td><td>Prodotti Biospec</td><td>Codice 11079101Z</td><td>Perle utilizzate per la fase di battitura delle perle per lisare le cellule micobatteriche</td></tr><tr><td>Perline AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>Codice A63880</td><td>Sfere magnetiche per la pulizia del DNA post-lisi</td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M, pH 8,0)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>AM9260G</td><td>Componenti buffer Triton/Low EDTA personalizzati</td></tr><tr><td>Preparazione rapida 24</td><td>MPbio, Stati Uniti</td><td>116004500</td><td>Attrezzatura per la battitura del cordone a 6,5 m/s</td></tr><tr><td>Primer in avanti</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>Sintesi personalizzata</td><td>Sequenza di primer: AATTCCTGGTGTAGCGGTGG</td></tr><tr><td>H2O (acqua, grado di biologia molecolare)</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>BP2819-1</td><td>Componenti buffer Triton/Low EDTA personalizzati</td></tr><tr><td>Sonda universale Luna</td><td>Biolaboratori del New England</td><td>Motore M3004</td><td>Reagente qPCR per l'enumerazione del DNA micobatterico</td></tr><tr><td>MycoPrep Kit</td><td>BD</td><td>Codice SKU/REF 240863</td><td>BD MycoPrep Digestione dei campioni per l'elaborazione dell'espettorato NALC-NaOH</td></tr><tr><td>NaCl (cloruro di sodio, soluzione 5M)</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>AM9759</td><td>Componenti buffer Triton/Low EDTA personalizzati</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Millipore Sigma</td><td>P2272</td><td>Elaborazione dell'espettorato</td></tr><tr><td>Innesco inverso</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>Sintesi personalizzata</td><td>Sequenza di primer: GTTTACGGCGTGGACTACCA</td></tr><tr><td>Sonda TaqMan</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>Sintesi personalizzata</td><td>Sequenza della sonda: AGGAGGAACACCGGTGGCGA</td></tr><tr><td>Tris-HCl (1M, pH 8,0)</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>AM9855G</td><td>Componenti buffer Triton/Low EDTA personalizzati</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>28314</td><td>Componenti buffer Triton/Low EDTA personalizzati</td></tr></tbody></table>

estrazione del dna micobatterico mediante battitura del tallone in tampone personalizzato seguita da flusso di lavoro ngs

Mycobacterial DNA Extraction using Bead Beating in Custom Buffer Followed by NGS Workflow

Abbiamo testato il protocollo di estrazione del DNA su campioni di espettorato puntato di M. tuberculosis in coltura e M. tuberculosis (n = 3 per ciascuna condizione). Utilizzando M. tuberculosis H37Rv mc² 7901 in coltura, abbiamo standardizzato l'input a 8,4 x 106 cellule per 50 μL, equivalenti a 1 mL di una coltura MGIT a 200 GU. Per gli esperimenti sull'espettorato, abbiamo raccolto 1 mL di espettorato da individui con condizioni respiratorie non tubercolari (ottenute commercialme...

Estrazione del DNA micobatterico mediante battitura del tallone in tampone personalizzato seguita da flusso di lavoro NGS

Tuberculosis is a deadly disease, and the emergence of antibiotic drug resistance in the causative agent bacterium, Mycobacterium tuberculosis, worsens ...

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Immunologia e Infezioni

Viene presentato il confronto e l'ottimizzazione di due metodi di arricchimento organellare del DNA vegetale: centrifugazione differenziale tradizionale e frazionamento del gDNA totale sulla base dello stato di metilazione. Valutiamo la quantità e la qualità del DNA risultanti, dimostriamo le prestazioni in sequenza di prossima generazione e discutiamo il potenziale di utilizzo in sequenza a lunga lettura di singole molecole.

Ottimizzazione e analisi comparativa dei metodi di arricchimento del DNA organologico vegetale adatti per la sequenziazione di nuova generazione

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Un protocollo di estrazione del DNA delle zanzare a base di perline magnetiche per il sequenziamento di nuova generazione

L'espressione genica è regolata dalle interazioni dei promotori genici con gli elementi regolatori distali. Qui, descriviamo come basso input Capture Hi-C (liCHi-C) consenta l'identificazione di queste interazioni in tipi di cellule rare, che in precedenza non erano misurabili.

Un flusso di lavoro integrato per studiare l'architettura del genoma spazio-temporale centrata sul promotore in popolazioni cellulari scarse

Presentiamo un metodo ottimizzato per l'estrazione del DNA dall'espettorato decontaminato utilizzando un metodo di estrazione basato su matrice combinato con una purificazione a microsfere magnetiche per il sequenziamento mirato a valle di nuova generazione del Mycobacterium tuberculosis.

Estrazione del DNA basata su matrice per il sequenziamento mirato di nuova generazione su campioni di espettorato decontaminato

Questo protocollo descrive il metodo CTAB per estrarre DNA di alta qualità dai micobatteri, superando le difficoltà poste dalle loro dure pareti cellulari ricche di acido micolico. Il processo prevede la digestione enzimatica, la lisi cellulare con CTAB e la purificazione del DNA tramite estrazione organica e precipitazione di etanolo. Questo metodo produce DNA adatto agli studi molecolari ed è affidabile per la ricerca micobatterica.

Estrazione di acidi desossiribonucleici a genoma intero da specie di Mycobacterium tramite la tecnica del bromuro di cetiltrimetilammonio

Qui, presentiamo un protocollo per consentire il sequenziamento dell'intero genoma delle infezioni batteriche sessualmente trasmissibili da campioni clinici utilizzando l'arricchimento del bersaglio. Questo nuovo metodo basato su pannelli sindromici supera le sfide dell'abbondanza di DNA umano e della bassa carica batterica, facilitando la sorveglianza genomica per Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum e Mycoplasma genitalium.

Generazione di genomi batterici interi da campioni clinici utilizzando un flusso di lavoro di arricchimento del target

Lo studio attuale descrive un flusso di lavoro per il sequenziamento nanoporo dei plasmidi quando la sequenza cromosomica è già nota o non ha alcun interesse. Un primo passaggio di arricchimento del DNA plasmidico garantisce una profondità ottimale della sequenza plasmidica e massimizza il numero di campioni che possono essere sequenziati per cella di flusso.

Sequenziamento e assemblaggio di plasmidi a lunga lettura utilizzando flussi di lavoro basati sul sequenziamento nanopore

Scopri un metodo rapido per estrarre DNA da Mycobacterium tuberculosis usando bead-beating e purificazione con perline magnetiche. Questo protocollo supporta applicazioni NGS anche in contesti con risorse limitate.

Estrazione del DNA micobatterico mediante battitura del tallone in tampone personalizzato seguita da flusso di lavoro NGS

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