Preparazione dei campioni per la metabolomica: un metodo per preparare campioni cellulari per la profilazione dei metaboliti

La metabolomica è lo studio per identificare e quantificare i metaboliti presenti all'interno delle cellule. Per preparare il campione, iniziare seminando le cellule del cancro al seno insieme al terreno di crescita in due piastre etichettate come test e controllo. Incubare per tre giorni a 37 gradi Celsius. Ora, rimuovere il terreno e aggiungere il terreno fresco con estradiolo nella piastra di prova e il terreno semplice nella piastra di controllo.

L'estradiolo si lega al recettore alfa degli estrogeni nelle cellule del cancro al seno per indurre determinate espressioni, causando un cambiamento nella composizione del metabolita. Incubare le piastre per la durata desiderata. Sostituire il terreno con soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato o PBS per lavare le cellule, quindi aggiungere acetone ghiacciato. I reagenti ghiacciati bloccano l'azione delle proteasi e quindi prevengono la degradazione delle proteine.

Ora usa un raschietto per staccare le cellule dalle piastre e trasferiscile in provette con l'aiuto di una pipetta. Prelevare 20 microlitri di questa sospensione cellulare su un emocitometro e contare il numero di cellule. Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius fino a quando non vengono utilizzati per ulteriori analisi. Nel seguente protocollo, prepariamo campioni da celle MCF-7 per la gascromatografia e la spettrometria di massa.

Utilizzando cellule MCF-7 coltivate secondo il protocollo di testo, aggiungere cinque millilitri di 1x PBS ghiacciato alla piastra. Quindi inclinare la piastra più volte prima di rimuovere il PBS. Ripetere altre due volte rimuovendo quanto più PBS possibile dopo l'ultimo lavaggio. Aggiungere 750 microlitri di acetone preraffreddato a ciascuna piastra e raschiare le cellule, quindi unire le cellule di due piastre in un tubo da due millilitri su ghiaccio.

Per contare le cellule per la normalizzazione, per ogni trattamento, utilizzare due piastre extra per la quantificazione cellulare. Quindi, per staccare le cellule dalle piastre, aggiungere 2 millilitri di tampone HE e incubare per cinque minuti. Miscelare accuratamente le cellule pipettandole nel tampone HE.

Quindi utilizzare 20 microlitri della soluzione cellulare in un emocitometro per contare il numero di cellule al microscopio. Conservare i campioni a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius prima di utilizzare l'analisi della spettrometria di massa gascromatografica per identificare e quantificare i metaboliti. Eseguire analisi integrative secondo il protocollo di testo.