Name: Metodi locale e globale valutazione nocicezione termica in Drosophila Le larve (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Scopri metodi per valutare la nocicezione termica locale e globale nelle larve di Drosophila. Queste tecniche permettono di quantificare le risposte comportamentali e studiare i meccanismi neuronali del dolore termico.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo Christian Landry per la progettazione di calore sonda, Daniel Babcock per lo sviluppo del larve test sonda termica, Sean Sweeney per aver suggerito il saggio di calore a piastre, il Bloomington Drosophila Stock Center per gli stock finestre, e Galko membri di laboratorio per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal NIH R01 NS069828 a MJG e NIH MARC U-STAR Training Grant (T34GM079088 alla University of Houston-Downtown Scholars Academy) per l&#39;accesso a carriere di ricerca minoranza (AVG).

<ol><li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).</li>
<li>Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((painless%2C+a+Drosophila+gene+essential+for+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">painless, a Drosophila gene essential for nociception.</a> Cell. 113, 261-273 (2003).</li>
<li>Oswald, M., Rymarczyk, B., Chatters, A., Sweeney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+thermosensitive+escape+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">A novel thermosensitive escape behavior in Drosophila larvae.</a> Fly (Austin). 5, 17810(2011).</li>
<li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li>
<li>Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hamlet%2C+a+binary+genetic+switch+between+single-+and+multiple-+dendrite+neuron+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology.</a> Science. 297, 1355-1358 (2002).</li>
<li>Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+regulating+dendritic+outgrowth%2C+branching%2C+and+routing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila.</a> Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).</li>
<li>Walters, E. T., Illich, P. A., Weeks, J. C., Lewin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defensive+responses+of+larval+Manduca+sexta+and+their+sensitization+by+noxious+stimuli+in+the+laboratory+and+field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Defensive responses of larval Manduca sexta and their sensitization by noxious stimuli in the laboratory and field.</a> J. Exp. Biol. 204, 457-469 (2001).</li>
<li>Woolf, C. J., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptors--noxious+stimulus+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Nociceptors--noxious stimulus detectors.</a> Neuron. 55, 353-364 (2007).</li>
<li>Hwang, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li>
<li>Xiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Sweeney, N. T., Li, W., Gao, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+single+neurons+in+vivo+reveals+specific+roles+of+flamingo+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of single neurons in vivo reveals specific roles of flamingo in neuronal morphogenesis.</a> Dev. Biol. 247, 76-88 (2002).</li>
<li>Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+mechanosensory+transduction%3A+mechanoreception-defective+mutations+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila.</a> Neuron. 12, 1195-1206 (1994).</li>
<li>Nitabach, M. N., Blau, J., Holmes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+silencing+of+Drosophila+pacemaker+neurons+stops+the+free-running+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Electrical silencing of Drosophila pacemaker neurons stops the free-running circadian clock.</a> Cell. 109, 485-495 (2002).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

I saggi descritti qui possono essere utilizzate per valutare qualitativamente e quantitativamente larve di genotipi differenti reattività a stimoli termici nocivi. Una caratteristica principale della sonda per saggi di calore è che lo stimolo viene dato solo un singolo locus. Questo porta alla cottura di presumibilmente solo un piccolo sottoinsieme di classe IV neuroni quelli del segmento contattato dalla sonda e forse quelli immediatamente adiacenti segmenti 11. A causa della stimolazione locale, la sonda per saggi di calore imita l&#39;esperienza comune sensoriale di rilevare uno stimolo nocivo che è localizzato in una particolare regione del corpo, ad esempio una mano a contatto una stufa calda. Uno svantaggio della sonda per saggi di calore è che ha qualche utente a utente variabilità che può essere attribuita a tre fattori: i) la pressione con cui l&#39;utente applica la sonda per la larva, ii) la posizione precisa della sonda la larva rispetto ai neuroni sottostanti nocicettivi, e iii) il preciso angLe in cui la sonda contatto con la superficie della larva. Abbiamo precedentemente riportato una strategia quantitativa di larve categorizzare in non responder, le risposte lenti e responder veloci in base alla loro latenza ritiro ad una data temperatura 1. Qui riportiamo la risposta delle larve a temperature ancora più alte. È interessante notare, troviamo che c&#39;è un tetto massimo per le risposte larvali termici nocicettivi e che tale massimale si trova tra 52 e 54 ° C. Questo può indicare che le larve non possiedono un potenziale transitoria recettore (TRP) canali in grado di gating a temperature superiori a 52 ° C. In alternativa, si potrebbe suggerire che i neuroni o dei muscoli utilizzati per avviare o effettuare la risposta del motore danneggiato prima di poter funzionare anche in ritiro avversione. Si riportano anche una diversa analisi della ampiezza della risposta-ritiro utilizzando il numero di rulli come indicatore della &quot;robustezza&quot; della risposta. Ingenuamente, unosi aspetta che questi parametri aumenta con l&#39;aumentare della temperatura o il tempo di stimolazione. Sorprendentemente, abbiamo trovato che questo non è il caso. Le larve stimolato per un tempo più lungo a una temperatura alla fine della gamma bassa nocive (42 ° C) mostrano più rotoli e più tempo trascorso rollio che larve sondati a temperature più elevate (48-52 ° C). Questo suggerisce che all&#39;interno della finestra di temperatura nocivo è soprattutto la durata di esposizione che determina l&#39;ampiezza della risposta. Poiché larve esposto a temperature estremamente nocivi (48-52 ° C) rispondono mediamente molto rapidamente, essi non presentano più rollini larve esposto ad una temperatura inferiore nocivo per un periodo di tempo più lungo. L&#39;analisi dell&#39;ampiezza della risposta qui riportati aggiunge un&#39;altra dimensione quantitativa lungo le quali genotipi differenti o manipolazioni ambientali possono essere confrontati. Una caratteristica principale del saggio piastra calore è che coinvolge una esposizione globale al nocivicalore. Come tale, essa è più simile a l&#39;animale seduto in un calderone di riscaldamento che toccare una stufa calda. Anche se non è chiaro quando una larva potrebbe verificare uno stimolo nocivo a livello globale in natura, in laboratorio le risposte comportamentali a questa esposizione globale sono più complessi di quelli osservati dopo stimolazione locale. Una forza del saggio a piastre, anche rilevato da altri 3, è che ha poco da utente a utente variabilità poiché tocca la larva non è un componente del protocollo. L&#39;unica variazione sostanziale sembra essere nel definire quando inizia ogni comportamento e questo può essere minimizzato con la visione ripetuta / familiarità. Una differenza interessante tra i saggi sono le temperature a cui i comportamenti avversative avviano. Questi sono molto inferiore nel test di calore a piastre che con la sonda di calore. Il comportamento preliminare esibita da larve a contatto con la sonda di calore (testa e coda rilancio) può essere correlato della testa thrash osservato a ~ 27 ° C in calore la piattaformae dosaggio. E &#39;possibile che questa risposta riflette &quot;fastidio&quot; più di &quot;dolore&quot;. Non abbiamo osservato una correlazione di frustate, convulsioni, paralisi e anche ad elevate (fino a 48 ° C) le temperature nel saggio della sonda di calore e può essere che una massa critica di neuroni sensoriali sparare da più di una regione del corpo è necessari per portare a questi comportamenti. È interessante notare, i comportamenti epilettiche e paralisi sono osservati a temperature (~ 34 - 37 ° C) sotto l&#39;estremità inferiore della soglia nocicettiva osservata con la sonda termica che indica che la stimolazione globale può comportare somma delle risposte neuronali che sono insufficienti per innescare con comportamento locale applicazione della sonda calore. Tali temperature sono effettivamente percepito come nocivi per le larve è supportata dall&#39;osservazione che le larve che iniziano il comportamento paralisi e sono successivamente lasciato recuperare il cibo fly non nella maggioranza dei casi sopravvivere (Figura 5C). Ulteriori sostenere la tesi secondo cui il calore plsaggio viene mangiato lettura risposte nocicettive è il fatto che bloccano la trasmissione sinaptica noti in neuroni sensoriali nocicettivi aumenta la latenza della maggior parte dei comportamenti osservati (Figura 6). L&#39;osservazione che non vi sia aumento della latenza per l&#39;alta temperatura comportamento frustate suggerisce che altri neuroni sensoriali che non esprimono md-Gal4 può essere richiesto per questo comportamento. In sintesi, entrambi i saggi comportano l&#39;esposizione di un individuo larva di uno stimolo nocivo termico di temperatura definito - la punta calda di una sonda metallica nel saggio locale e immersione in una goccia di rapido riscaldamento dell&#39;acqua nel saggio globale. Risposte comportamentali di Drosophila larve di vario background genetici e / o esposti a diverse condizioni ambientali (ad esempio, più o meno danni ai tessuti), possono essere studiate e quantificate con questi test. In definitiva, i risultati ottenuti in questi test ci aiuterà a capire meglio le reti genetiche che controllano nociception in Drosophila e di altre specie affini.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Sonda termica </td><td> Pro-Dev Ingegneria </td><td> Custom-costruita su richiesta </td><td> Informazioni di contatto possono essere fornite su richiesta </td></tr><tr><td> Dry Bath Incubator </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-718 </td><td> 1 blocco riscaldante solida e 1 blocco riscaldante con pozzi 16mm </td></tr><tr><td> Leica DFC290 12v/400mA Telecamera a colori </td><td> Leica Microsystems </td><td> 12730080 </td><td> Qualsiasi equivalente fotocamera farà. </td></tr><tr><td> Leica MZ6 microscopio </td><td> Leica Microsystems </td><td> Codice per MZ6 corpo zoom (corpo ottico) è 10445614 </td><td></td></tr><tr><td> Schott Ace Modulamp Unità </td><td> Schott North America, Inc. </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td> Schott doppio collo di cigno 23 pollici Light Guide fibra ottica </td><td> Schott North America, Inc. </td><td> Schott A08575 </td><td></td></tr><tr><td> Unità di controllo termico </td><td> TSCI corp. </td><td> Custom Built </td><td> I dettagli possono essere forniti su richiesta </td></tr><tr><td> Zeiss Stemi 2000 microscopio </td><td> Zeiss </td><td> NT55-605 </td><td> Qualsiasi equivalente microscopiofarà. </td></tr><tr><td> Forcipe </td><td> FST </td><td> FS-1670 </td><td></td></tr><tr><td> 1 millimetro rete </td><td> Genesee Scientific </td><td> 57-101 </td><td></td></tr><tr><td> Pennello </td><td> Dick Blick Art Materials </td><td> 06762-1002 </td><td></td></tr><tr><td> UV reticolante </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1199289 </td><td></td></tr><tr><td> Coplin </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-816 </td><td></td></tr><tr><td> 10ml beaker </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-540C </td><td></td></tr><tr><td> Etere etilico </td><td> Fisher Scientific </td><td> E138-500 </td><td></td></tr><tr><td> 35 X 10 mm Dish polistirolo Petri </td><td> Falco </td><td> 351008 </td><td> Non abbiamo testato piatti alternativi. </td></tr><tr><td> Glass vetrino da microscopio </td><td> Corning </td><td> 26003 </td><td></td></tr><tr><td> Termocoppia </td><td> Omega Engineering, Inc. </td><td> HH802U </td><td></td></tr><tr><td> Pezzo di vinile </td><td> Office Depot </td><td> 480009 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrifuga tubo </td><td> Denville scientificoInc. </td><td> C-2170 </td><td></td></tr></tbody></table>

metodi locale e globale valutazione nocicezione termica in<em&gt; drosophila</em&gt; le larve

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In questo articolo dimostriamo saggi per studiare nocicezione termica in larve di Drosophila. Un test comporta la stimolazione spazialmente limitata (locale) di energia termica 1,2 nocicettori, mentre il secondo comporta una wholesale (globale) l&#39;attivazione della maggior parte o tutti questi neuroni 3. Insieme, queste tecniche consentono la visualizzazione e la quantificazione delle funzioni comportamentali di Drosophila neuroni sensoriali nocicettivi. La larva di Drosophila è un sistema modello per studiare istituito nocicezione termica, una risposta sensoriale, a temperature potenzialmente dannosi che è evolutivamente conservata tra le specie 1,2. I vantaggi di Drosophila per tali studi sono la relativa semplicità del suo sistema nervoso e la sofisticazione delle tecniche genetiche che possono essere utilizzati per sezionare la base molecolare della biologia sottostante 4-6 in Drosophila, come in tutti metazoi, i response nocivi a stimoli termici comporta generalmente un ritiro &quot;nocifensive&quot; avversione allo stimolo presentato 7. Tali stimoli vengono rilevati attraverso terminazioni nervose libere o nocicettori e l&#39;ampiezza della risposta organica dipende dal numero di nocicettori ricevono il stimolo nocivo 8. In Drosophila, è la classe IV arborizzazione dendritica neuroni sensoriali che rilevano nocivi stimoli termici e meccanici 9 in aggiunta al loro ruolo recentemente scoperto come fotorecettori 10. Questi neuroni, che sono stati studiati molto bene a livello di sviluppo, arborize sopra il foglio di barriera epidermica e di stabilire contatti con quasi tutte le cellule epidermiche 11,12. Il singolo assone di ogni classe IV progetti neuroni nel midollo nervoso ventrale del sistema nervoso centrale, 11 in cui possono connettersi al secondo ordine i neuroni che proiettano al cervello. In condizioni basali, neuro sensoriale nocicettivans non scatta finché una soglia relativamente elevata viene raggiunta. I saggi qui descritte consentono al ricercatore di quantificare le risposte comportamentali di base o, presumibilmente, la sensibilizzazione che ne deriva danni tessuto nel modo seguente. Ciascun test provoca risposte locomotorie distinti ma correlati comportamentali nocivi stimoli termici e consente al ricercatore di visualizzare e quantificare i vari aspetti della nocicezione termica in larve di Drosophila. I saggi possono essere applicati a larve di genotipi desiderati o di larve sollevata in diverse condizioni ambientali che potrebbero influenzare nocicezione. Dal momento che nocicezione termica è conservata tra le specie, i risultati raccolti da dissezione genetica in Drosophila è probabile che informerà la nostra comprensione di nocicezione termica in altre specie, tra vertebrati.

In questo articolo dimostriamo saggi per studiare nocicezione termica<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve. Un test comporta la stimolazione spazialmente limitata (locale) dei nocicettori termici<sup&gt; 1,2</sup&gt; Mentre il secondo comporta una wholesale (globale) l&#39;attivazione della maggior parte o tutti questi neuroni<sup&gt; 3</sup&gt;. Insieme, queste tecniche consentono la visualizzazione e la quantificazione delle funzioni comportamentali di<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuroni sensoriali nocicettivi.

Metodi locale e globale valutazione nocicezione termica in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

In questo articolo, dimostriamo dei saggi per studiare la nocicezione termica nelle larve di Drosophila. Un saggio prevede la stimolazione spazialmente limitata (locale) di ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare la nocicezione termica nei larve di drosophila. Questo viene ottenuto raccogliendo larve di drosophila per esporle successivamente a stimoli termici nocivi come secondo passaggio opzionale. Le larve possono essere irradiate con raggi UV, il che provoca danni ai tessuti e una sensibilizzazione nocicettiva termica. Successivamente, le larve possono essere stimolate localmente con una sonda termica o in modo globale utilizzando una piastra riscaldata, al fine di provocare risposte nocicettive che possono essere misurate quantitativamente.La sonda termica mostra che le larve hanno un limite superiore nella risposta nocicettiva al calore e una relazione sorprendente tra la temperatura di ingresso e l'ampiezza della risposta provocata. Il test della piastra riscaldata mostra che le larve esibiscono una sequenza stereotipata di comportamenti nocicettivi che dipendono dalla temperatura dell'acqua circostante e dall'attività dei neuroni sensoriali nocicettivi. I metodi descritti qui possono aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della nocicezione termica, come ad esempio se gli animali rispondano in modo diverso a stimoli termici dannosi presentati in maniera localizzata o globale.Generalmente, le persone alle prime armi con il saggio della sonda termica incontrano difficoltà perché padroneggiare questo saggio richiede pratica per minimizzare le variazioni nella pressione, nella posizione e nell'angolo di applicazione della sonda. La dimostrazione visiva del saggio su piastra riscaldata è fondamentale, poiché i comportamenti indotti da un aumento di temperatura devono essere osservati per essere pienamente apprezzati. Per ottenere una quantità sufficiente di larve progenie di un genotipo definito di interesse, coltivare la linea desiderata direttamente oppure impostare incroci in bottiglie contenenti cibo per moscerini, utilizzando da 20 a 30 femmine vergini e da 15 a 20 maschi. A cinque giorni dalla deposizione delle uova, raccogliere e pulire le larve di terzo stadio iniziali rimuovendo il cibo ammuffito e filtrando con acqua corrente delicata attraverso una rete con pori di 630 micron. Trasferire quindi le larve di terzo stadio iniziali su un piccolo cuscinetto di cibo umido per prevenire la fame e la disidratazione.Dopo aver costruito una camera di anestesia, utilizzare pinzette o un pennello per posizionare delicatamente 10 larve di terzo stadio iniziale lungo l'interno del coperchio e chiudere. Lavorando in una cappa aspirante, collocare la camera di anestesia all'interno di un barattolo di accoppiamento contenente un becher da 10 millilitri con una pallina di cotone imbevuta di 1,5 millilitri di etere diatilico. Avvitare il coperchio del barattolo di accoppiamento per esporre le larve ai vapori di etere per due a 2,5 minuti.Dopo l'autorizzazione, rimuovere la camera di autorizzazione dal barattolo Coplan e lasciarla per alcuni secondi sotto cappa, in modo che gli eventuali residui di vapori di etere possano disperdersi. Utilizzare una bottiglia spray d'acqua per risciacquare delicatamente le larve dalla camera di autorizzazione e trasferirle in una piccola capsula di Petri. Asciugare delicatamente le larve anestetizzate e quindi fissarle con cautela in posizione dorsale verso l'alto su un nastro di nastro adesivo doppio faccia applicato su un vetrino microscopico di tre pollici per un pollice.Posizionare il vetrino sulla superficie inferiore di una camera di irradiazione UV ed esporre le larve alla luce UV per sei secondi a un'intensità di 20 millijoule per centimetro quadrato. Dopo l'irradiazione, immergere il vetrino in acqua per far staccare delicatamente le larve dal nastro adesivo doppiofaccia. Utilizzare pinzette o un pennello per posizionare delicatamente le larve irradiate in un contenitore di 15 per 45 millimetri.Un vial di vetro da un dram contenente un millilitro di alimento per moscerini, da recuperare per otto-24 ore a 25 gradi Celsius o alla temperatura di coltura desiderata prima di reinserirli. Per i saggi di nocicezione termica, impostare innanzitutto la temperatura della sonda termica al valore desiderato. Utilizzare un pennello o delle pinzette per trasferire delicatamente un singolo larva su una piattaforma piana, assicurandosi che il larva sia ricoperto da un sottile strato d'acqua.Per ridurre al minimo le variazioni di pressione e garantire al contempo la posizione e l'angolo corretti della sonda termica, la pratica rende perfetti. Premere delicatamente la punta della sonda contro le larve nel segmento A4, applicando una leggera pressione con la punta a un angolo di circa 45 gradi tra la sonda e la superficie delle larve. La pressione dovrebbe causare una lieve indentazione sulla superficie delle larve e sarà generalmente sufficiente per impedire la locomozione.Continuare a stimolare le larve fino a quando non si manifesta una risposta di ritrazione o fino al raggiungimento del cutoff 22. Le larve che rispondono mostrano tipicamente un comportamento preliminare sollevando la testa e la coda, seguito dal comportamento di ritrazione consistente nel rotolare di almeno 360 gradi. Una volta iniziato il comportamento di ritrazione, interrompere il contatto con la sonda e registrare la latenza o il tempo impiegato per la ritrazione.Se entro 20 secondi non viene osservato alcun comportamento di ritrazione, la larva è un non risponditore. Posizionare le guide luminose in fibra ottica in modo da garantire un'illuminazione adeguata con alto contrasto. Per osservare le larve, inserire il blocco riscaldante nella piastra riscaldante con la superficie piana rivolta verso l'alto, quindi posizionare la piastra riscaldante sulla base del microscopio.Accendere la piastra riscaldante impostandola su temperatura alta e attendere circa 15 minuti affinché la temperatura si stabilizzi a 95 gradi Celsius. Misurare 80 microlitri di acqua distillata e posizionare la goccia d'acqua al centro di una piastra di Petri in polistirene di 60 per 15 millimetri utilizzando una micropipetta. Utilizzare pinzette per posizionare delicatamente un larva pulita del terzo stadio larvale al centro della goccia d'acqua, introducendo il minor quantitativo possibile di acqua aggiuntiva.Posizionare delicatamente la piastra di Petri sul blocco riscaldante solido della piastra termica. Regolare rapidamente la posizione della piastra in modo che tutti i larve e la goccia d'acqua siano visibili. Avviare il cronometro.In questo momento, la piastra di Petri viene posizionata sul blocco riscaldante solido della piastra termica e si registra il tempo di insorgenza di ciascun comportamento. Cinque. Comportamenti locomotori stereotipati vengono osservati dopo il trasferimento della larva immersa in acqua sulla piastra termica. Il comportamento normale in assenza di calore comprende la locomozione a parasole, accompagnata da movimenti della testa di ricerca.Il comportamento di scuotimento della testa può verificarsi quando la larva muove rapidamente la testa in avanti o lateralmente. Questo movimento è simile alla normale locomozione in acqua, ma si presenta in modo più brusco e con rotolamento persistente. Il comportamento si verifica quando la larva effettua un rotolamento laterale di almeno un intero giro di 360 gradi.Questo può verificarsi un numero variabile di volte e a volte comprende rotolamenti incompleti. Ai fini della valutazione del comportamento, contare soltanto i rotolamenti completi di 360 gradi. Questo comportamento è il più simile a quella situazione con applicazione locale della sonda termica durante il comportamento a frusta.La larva mostra movimenti rapidi di contrazione e rilascio lungo l'asse antero-posteriore che avvicinano brevemente la testa alla coda. Il movimento a frusta è spesso osservato in rapida successione, due volte o contemporaneamente al rotolamento. Infine, la larva mostrerà un comportamento convulsivo, spesso seguito da paralisi. Durante il comportamento convulsivo, la larva si allunga lungo l'asse intero-posteriore e manifesta una contrazione ritmica ad alta frequenza dell'intero corpo.Il comportamento di scuotimento senza paralisi da piegamento si verifica quando le larve cessano il movimento. In alcune larve, questo fenomeno è permanente, mentre altre successivamente mostrano un movimento pulsatorio a bassa frequenza. In questo grafico della percentuale di rispondenti appartenenti a ciascuna categoria, si osserva un limite superiore nella risposta larvale alla nocicezione termica. Nel test con la sonda termica, il 100% delle larve risponde rapidamente fino a una temperatura della sonda di 52 gradi Celsius.Tuttavia, a 54 gradi Celsius e temperature superiori, il 90% o più delle larve non risponde nemmeno dopo 20 secondi di contatto. Sebbene queste larve continuino a muoversi dopo il 22° taglio, il numero di rotolamenti o il tempo trascorso nel comportamento di ritiro avversivo può comunque essere misurato e riportato in grafico. Sorprendentemente, sembra esserci una relazione inversa tra la temperatura del sonda in ingresso e l'intensità della risposta, poiché temperature più basse sembrano provocare un numero maggiore di rotolamenti.Si osservano cinque comportamenti locomotori stereotipati dopo il trasferimento della larva immersa in acqua sulla piastra riscaldata. Qui sono mostrate le latenze medie alle quali questi comportamenti vengono osservati, così come le temperature medie della goccia d'acqua misurate per ciascuna latenza nelle condizioni ottimali del saggio qui presentate; la percentuale di larve che mostrano ciascun comportamento distinto è compresa tra il 77 e il 100%. Sebbene occasionalmente i comportamenti di rotolamento e di frustata possano essere omessi, sovrapporsi o verificarsi in ordine inverso, qui è riportata la percentuale di larve sopravvissute dopo l'inizio del comportamento di paralisi nel saggio sulla piastra riscaldata. Le larve sono state riscaldate fino alla paralisi, quindi rimosse e poste in condizioni di coltura standard per il recupero.Le larve trattate come controllo hanno ricevuto un trattamento equivalente, fatta eccezione per l'esposizione al calore, e la formazione di PPE negli adulti vitali è stata quantitativa dal giorno sette al tredici. Qui, MD G quattro induce l'espressione di transgeni regolati da UAS in tutte e quattro le classi di neuroni sensoriali periferici multidendritici. UAS o one delta C esprime una versione modificata del canale del potassio rettificatore aperto di drosophila necessario per la trasmissione sinaptica e UAS orrc uno delta NC esprime una versione ulteriormente modificata dello stesso canale che non interferisce con la trasmissione sinaptica.Si noti che solo le larve portatrici sia del driver MD GAL4 che del transgene UAS ORC1 delta C mostrano latenze aumentate in quattro dei cinque comportamenti osservati. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come misurare le risposte locali e globali delle larve di GEs offal ai stimoli termici nocicettivi. Queste procedure possono essere combinate con altri metodi, come l'analisi genetica, per identificare i geni necessari per la nocicezione termica. Quando si esegue il saggio con la sonda termica, è importante ricordare di minimizzare le variazioni di pressione, posizione e angolo di contatto della sonda.

local-global-methods-assessing-thermal-nociception-drosophila

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Qui, descriviamo una procedura rapida, semplice e affidabile per determinare la temperatura minima alla quale i ratti o topi mostrare un comportamento...

Rapida determinazione della soglia termica nocicettivo in ratti diabetici

Le larve di Drosophila hanno neuroni sensoriali dedicati, nocicettori, la cui risposta a stimoli termici potenzialmente dannosi innesca comportamenti avversivi, o cosiddetti "nocifensivi", nell'animale. Questo video descrive un metodo per valutare la nocicezione termica registrando il comportamento larvale in risposta all'applicazione locale di una sonda termica sulla cuticola. Questo metodo è quindi chiamato saggio della sonda di calore locale.

Saggio con sonda termica locale: un metodo per valutare la nocicezione delle alte temperature nelle larve di Drosophila

Studi di morfogenesi neuronale utilizzando Drosophila larvale arborizzazione dendritiche (bis) i neuroni beneficiano di visualizzazione situ delle proteine neuronali e epidermiche mediante immunofluorescenza. Descriviamo una procedura che migliora l'analisi di immunofluorescenza di DA neuroni e cellule epidermiche circostanti, rimuovendo il tessuto muscolare dalla parete del corpo larvale.

Rimozione di<em&gt; Drosophila</em&gt; Tessuto muscolare da larvali Filetti per l&#39;analisi di immunofluorescenza dei neuroni sensoriali e cellule epidermiche

Qui mostriamo un nuovo metodo di analisi per studiare nocicezione freddo in Drosophila larve. Questo dosaggio utilizza una sonda custom-built Peltier in grado di applicare una focale stimolo freddo nociva e si traduce in comportamenti specifici a freddo quantificabili. Questa tecnica consentirà un'ulteriore dissezione cellulari e molecolari della nocicezione freddo.

Nuovo metodo di analisi per Cold nocicezione in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

Qui, presentiamo un protocollo per determinare la temperatura ambientale preferita delle larve di Drosophila utilizzando un gradiente termico continuo.

Un'analisi di gradiente di temperatura per determinare le preferenze termiche delle larve di Drosophila

Qui presentiamo un protocollo per determinare automaticamente le prestazioni dell'apparato locomotore di Drosophila alle variazioni di temperatura usando un arena di temperatura programmabile che produce i cambiamenti di temperatura veloce ed accurato nel tempo e nello spazio.

Un metodo automatizzato per determinare le prestazioni della drosofila in risposta a variazioni di temperatura nello spazio e nel tempo

I limiti termici possono prevedere gli ambienti che gli organismi tollerano, che sono informazioni preziose di fronte al rapido cambiamento climatico. Qui descritti sono protocolli ad alto rendimento per valutare il minimo termico critico e il tempo di abbattimento del calore negli insetti. Entrambi i protocolli massimizzano la velocità effettiva e riducono al minimo il costo dei test.

Analisi ad alta velocità di produzione dei limiti termici critici negli insetti

L'obiettivo di questo protocollo è mostrare come eseguire un saggio migliorato per la nocicezione meccanica nelle larve di Drosophila. Usiamo il saggio qui per dimostrare che l'ipersensibilità meccanica (allodinia e iperalgesia) esiste nelle larve di Drosophila.

Un saggio e strumenti migliorati per misurare la nocicezione meccanica nelle larve di Drosophila

La valutazione e trattamento del dolore nei bambini è difficile perché i bambini non possono segnalare verbalmente la loro esperienza. In questo video si descrivono metodi quantitativi elettrofisiologiche e tecniche di analisi che possono essere utilizzati per misurare la risposta agli eventi nocivi dal sistema nervoso infantile.

Le misurazioni elettrofisiologiche e Analisi di nocicezione nei neonati umani

Drosophila melanogaster è un sistema genetico e comportamentale del modello trattabile che è stato utilizzato per comprendere le basi molecolari e cellulari di molti importanti processi biologici per oltre un secolo 1. Drosophila è stata ben sfruttata per acquisire conoscenze in base genetica del comportamento mosca.

Metodi per test Drosophila Comportamento

Scopri metodi per valutare la nocicezione termica locale e globale nelle larve di Drosophila. Queste tecniche permettono di quantificare le risposte comportamentali e studiare i meccanismi neuronali del dolore termico.

Metodi locale e globale valutazione nocicezione termica in

Esplora altri video