Metodi locale e globale valutazione nocicezione termica in Drosophila Le larve

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di analizzare la nocicezione termica nelle larve di Drosophila. Ciò si ottiene raccogliendo le larve di drosophila per esporle successivamente a stimoli termici nocivi come seconda fase opzionale Le larve possono essere irradiate con raggi UV, causando danni ai tessuti e sensibilizzazione nocicettiva termica. Successivamente, la larva può essere sondata localmente con una sonda termica o globalmente utilizzando una piastra riscaldante per provocare risposte nocicettive che possono essere misurate quantitativamente.

La sonda termica mostra che le larve hanno un limite massimo alla risposta nocicettiva al calore e una sorprendente relazione tra la temperatura di ingresso e l'ampiezza della risposta provocata. Il test della piastra riscaldante mostra che le larve mostrano una sequenza stereotipata di comportamenti nocicettivi che dipendono dalla temperatura dell'acqua circostante e dall'attività dei neuroni sensoriali nocicettivi. I metodi qui descritti possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della nocicezione termica, come ad esempio se gli animali rispondono in modo diverso agli stimoli termici nocivi che si presentano localmente o globalmente.

In generale, le persone che non conoscono il test con sonda termica avranno difficoltà perché la padronanza del test richiede pratica per ridurre al minimo la variazione della pressione, della posizione e dell'angolo di condotta della sonda applicata La dimostrazione visiva del test con piastra termica è fondamentale. Poiché i comportamenti suscitati dall'aumento della temperatura devono essere visti per essere apprezzati al meglio. Per ottenere un numero sufficiente di larve di progenie di un genotipo definito di interesse, far crescere direttamente lo stock desiderato o impostare incroci in bottiglie contenenti cibo per mosche utilizzando da 20 a 30 femmine vergini e da 15 a 20 maschi cinque giorni dopo la deposizione delle uova, raccogliere e pulire le larve precoci del terzo stadio raccogliendo il cibo per mosche molliccio e filtrando con acqua corrente delicata attraverso una rete di dimensioni dei pori di 630 micron, trasferire le larve del terzo stadio precoce a un piccolo tampone umido di cibo per prevenire la fame e l'essiccazione.

Dopo aver costruito una camera di autorizzazione, utilizzare una pinza o un pennello per posizionare delicatamente 10 larve di terzo stadio precoce lungo l'interno del coperchio e chiudere. Lavorando in cappa aspirante, posizionare la camera di autorizzazione all'interno di un barattolo di accoppiamento contenente un becher da 10 millilitri contenente un batuffolo di cotone imbevuto di 1,5 millilitri di etere datilico. Avvitare il tappo del barattolo coplan per esporre le larve ai fumi eterei per due o 2,5 minuti.

Dopo l'autorizzazione, rimuovere la camera di autorizzazione dal vaso Coplan e lasciarla nella cappa per alcuni secondi affinché eventuali fumi residui di etere si disperdano. Usa un flacone per spruzzare acqua per sciacquare delicatamente le larve dalla camera di autorizzazione in una piccola capsula di Petri. Asciugare le larve anestetizzate e poi fissarle delicatamente con il lato dorsale rivolto verso l'alto su una striscia di nastro adesivo biadesivo fissata in un vetrino da microscopio di tre pollici per un pollice.

Posizionare il vetrino sulla superficie inferiore di una camera di irradiazione UV ed esporre le larve alla luce UV per sei secondi a 20 millijoule per centimetro quadrato di intensità. Dopo l'irradiazione, immergere il vetrino in acqua per far galleggiare delicatamente le larve fuori dallo scotch biadesivo. Usa una pinza o un pennello per posizionare delicatamente le larve irradiate in un diametro di 15 x 45 millimetri.

Una fiala di coltura in vetro contenente un millilitro di cibo per mosche da recuperare per 8-24 ore a 25 gradi Celsius o alla temperatura di coltura desiderata prima di ricollocarli. Per i saggi di nocicezione termica, preimpostare prima la temperatura della sonda termica sul set point desiderato. Usa un pennello o una pinza per trasferire delicatamente una singola larva su una piattaforma piana, assicurandoti che le larve siano coperte da un sottile film d'acqua.

Al fine di ridurre al minimo la variazione di pressione e di garantire la corretta posizione e angolazione della sonda termica, la pratica rende perfetti. Premere delicatamente la punta della sonda contro le larve al segmento A quattro, esercitando una leggera pressione con la punta a un angolo di circa 45 gradi tra la sonda e la superficie delle larve. La pressione dovrebbe causare una leggera rientranza sulla superficie delle larve e di solito sarà sufficiente per impedire la locomozione.

Continuare a stimolare le larve fino a quando non viene mostrata una risposta di ritiro o fino al raggiungimento del 22° cutoff. Le larve che rispondono in genere mostrano prima un comportamento preliminare di sollevamento della testa e della coda, seguito dal comportamento di ritiro di rotolamento di almeno 360 gradi. Una volta avviato il comportamento di prelievo, rilasciare il contatto con la sonda e registrare la latenza o il tempo impiegato per il prelievo.

Se non si osserva alcun comportamento di astinenza entro 20 secondi, allora le larve non rispondono. Posizionare le guide luminose in fibra ottica per garantire un'adeguata illuminazione ad alto contrasto. Per visualizzare le larve, posizionare il blocco riscaldante nella piastra riscaldante con la superficie piana rivolta verso l'alto, quindi posizionare la piastra riscaldante sulla base del microscopio.

Accendi la piastra riscaldante al massimo e attendi circa 15 minuti affinché la temperatura si stabilizzi a 95 gradi Celsius. Misurare 80 microlitri di acqua distillata e posizionare la goccia d'acqua al centro di una piastra di Petri in polistirene da 60 x 15 millimetri con un micro pipettatore. Usa una pinza per posizionare delicatamente una larva pulita del terzo stadio centrale al centro della goccia d'acqua, introducendo meno acqua aggiuntiva possibile.

Posizionare delicatamente la capsula di Petri sul blocco riscaldante solido sulla piastra riscaldante. Regola rapidamente la posizione del piatto in modo che tutte le larve e la goccia d'acqua siano in vista. Avvia il timer.

Al momento, la capsula di Petri viene posizionata sul blocco riscaldante solido della piastra riscaldante e registra il tempo di insorgenza di ciascun comportamento. Cinque. Comportamenti stereotipati della locomotiva si osservano al momento del trasferimento della larva immersa nell'acqua alla piastra riscaldante. Il comportamento normale in assenza di calore comporta la locomozione dell'ombrellone, accompagnata da movimenti della testa che la ricercano.

Il comportamento del dimenarsi della testa può verificarsi successivamente al punto in cui la larva muove rapidamente la testa con un movimento in avanti o laterale. Questo movimento è simile alla loro normale locomozione in acqua, ma avviene in modo più a scatti e persistente. Il comportamento si verifica quando le larve rotolano lateralmente di almeno 360 gradi.

Questo può verificarsi un numero variabile di volte e talvolta comporta rotoli incompleti. Ai fini del punteggio, il comportamento conta solo rotazioni complete a 360 gradi. Questo comportamento è il più simile a quello della scena con l'applicazione locale della sonda termica durante il comportamento della frusta.

La larva mostra rapidi movimenti di rilascio della contrazione lungo l'asse antio posteriore che avvicinano molto brevemente la testa alla coda La frustata è spesso osservata in rapida successione, due o contemporaneamente al rotolamento. Infine, la larva mostrerà un comportamento convulsivo spesso seguito da paralisi. Durante il comportamento convulsivo, la larva si allunga lungo l'asse interoppale posteriore e mostra un'alta frequenza in tutto il corpo.

Il comportamento di scuotimento senza paralisi da flessione si verifica quando le larve cessano il movimento In alcune larve, questo è permanente, mentre altre mostrano un movimento di pulsazione a bassa frequenza. In questo grafico della percentuale di responder appartenenti a ciascuna categoria, c'è un limite massimo alla risposta alla nocicezione termica larvale. Nel test con sonda termica, il 100% delle larve risponde rapidamente fino a una temperatura della sonda di 52 gradi Celsius.

Tuttavia, a 54 gradi Celsius e oltre, il 90% o più delle larve non risponde nemmeno dopo 20 secondi di contatto. Sebbene queste larve continuino a muoversi dopo il 22° cutoff, è possibile misurare e tracciare anche il numero di rotoli o il tempo trascorso nel comportamento di astinenza da avversione. Sorprendentemente, sembra esserci una relazione inversa tra la temperatura di ingresso della sonda e la robustezza della risposta, poiché temperature più basse sembrano provocare un numero maggiore di rotoli.

Cinque comportamenti stereotipati della locomotiva sono osservati al momento del trasferimento della larva immersa nell'acqua alla piastra riscaldante. Le latenze medie alle quali si osservano questi comportamenti sono mostrate qui, così come le temperature medie delle gocce d'acqua misurate per ciascuna latenza nelle condizioni ottimali di analisi qui presentate, la percentuale di larve che mostrano ogni comportamento distinto variava dal 77 al 100%, anche se occasionalmente i comportamenti di rotolamento e frustata sono omessi, si sovrappongono o si verificano in ordine inverso, La percentuale di larve che sono sopravvissute dopo l'inizio del comportamento di paralisi nel test della piastra riscaldante è mostrata qui. Le larve sono state riscaldate fino alla paralisi e poi rimosse in condizioni di coltura standard per riprendersi.

Le larve simulate hanno ricevuto un trattamento equivalente tranne che per l'esposizione al calore e la formazione di DPI negli adulti vitali è stata quantitativa dal settimo al tredicesimo giorno. Qui, MD G four guida l'espressione di transgeni regolati da UAS in tutte e quattro le classi di neuroni sensoriali periferici multi dendritici. UAS o un delta C esprime una versione modificata del canale del potassio raddrizzatore aperto della drosophila necessario per la trasmissione sinaptica e UAS orrc un delta NC esprime una versione ulteriormente modificata dello stesso canale che non interferisce con la trasmissione sinaptica.

Si noti che solo le larve che portano sia il driver MD GALF four che il transgene UAS ORC one delta C mostrano latenze aumentate per quattro dei cinque comportamenti osservati. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare le risposte locali e globali delle larve di frattaglie GE a stimoli termici nocivi. Queste procedure possono essere combinate con altri metodi, come l'analisi genetica, per identificare i geni necessari per la nocicezione termica Durante il test della sonda termica, è importante ricordare di ridurre al minimo la variazione e la pressione, la posizione e l'angolo di contatto della sonda.