Metodi locale e globale valutazione nocicezione termica in Drosophila Le larve

L'obiettivo generale del seguente esperimento è analizzare la nocicezione termica nei larve di drosophila. Questo viene ottenuto raccogliendo larve di drosophila per esporle successivamente a stimoli termici nocivi come secondo passaggio opzionale. Le larve possono essere irradiate con raggi UV, il che provoca danni ai tessuti e una sensibilizzazione alla nocicezione termica. Successivamente, le larve possono essere stimolate localmente con una sonda termica o in modo globale utilizzando una piastra riscaldata, al fine di provocare risposte nocicettive che possono essere misurate quantitativamente.

La sonda termica mostra che le larve hanno un limite superiore nella risposta nocicettiva al calore e una relazione sorprendente tra la temperatura di ingresso e l'ampiezza della risposta provocata. Il test della piastra riscaldata mostra che le larve esibiscono una sequenza stereotipata di comportamenti nocicettivi che dipendono dalla temperatura dell'acqua circostante e dall'attività dei neuroni sensoriali nocicettivi. I metodi descritti qui possono aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della nocicezione termica, come ad esempio se gli animali rispondono in modo diverso a stimoli termici dannosi presentati in modo localizzato o globale.

Generalmente, i principianti nell'assay con sonda termica incontrano difficoltà, poiché il perfezionamento di questo assay richiede pratica per minimizzare le variazioni nella pressione, nella posizione e nell'angolo di applicazione della sonda. La dimostrazione visiva dell'assay su piastra riscaldata è fondamentale, in quanto i comportamenti indotti da un aumento di temperatura devono essere osservati per essere pienamente apprezzati. Per ottenere una quantità sufficiente di larve progenie di un genotipo specifico di interesse, coltivare la linea desiderata direttamente oppure impostare incroci in bottiglie contenenti cibo per moscerini, utilizzando da 20 a 30 femmine vergini e da 15 a 20 maschi; cinque giorni dopo la deposizione delle uova, raccogliere e pulire le larve di terzo stadio iniziali prelevando con un cucchiaino il cibo ammorbidente e filtrando con acqua corrente delicata attraverso una rete con pori di 630 micron; trasferire quindi le larve di terzo stadio iniziali su un piccolo tampone di cibo umido per prevenire la fame e la disidratazione.

Dopo aver costruito una camera di anestesia, utilizzare pinzette o un pennello per posizionare delicatamente 10 larve di terzo stadio iniziale lungo l'interno del coperchio e chiudere. Lavorando in una cappa, posizionare la camera di anestesia all'interno di un barattolo di accoppiamento contenente un becher da 10 millilitri con una pallina di cotone imbevuta di 1,5 millilitri di etere dietilico. Avvitare il coperchio del barattolo di accoppiamento per esporre le larve ai vapori di etere per due o 2,5 minuti.

Dopo l'e autorizzazione, rimuovere la camera di e autorizzazione dal barattolo Coplan e lasciarla qualche secondo nella cappa per consentire la dissipazione di eventuali fumi residui di etere. Utilizzare una bottiglia spray d'acqua per risciacquare delicatamente le larve dalla camera di autorizzazione in una piccola capsula di Petri. Asciugare delicatamente le larve anestetizzate quindi fissarle con cautela in posizione dorsale superiore su una striscia di nastro adesivo doppio lato applicato su un vetrino microscopico di tre pollici per un pollice.

Posizionare il vetrino sulla superficie inferiore di una camera di irradiazione UV ed esporre le larve alla luce UV per sei secondi a un'intensità di 20 millijoule per centimetro quadrato. Dopo l'irradiazione, immergere il vetrino in acqua per far staccare delicatamente le larve dal nastro adesivo doppiofaccia. Utilizzare pinzette o un pennello per posizionare delicatamente le larve irradiate in un contenitore di 15 per 45 millimetri.

Un vial di vetro da un dram contenente un millilitro di alimento per moscerini, da incubare per otto-24 ore a 25 gradi Celsius o alla temperatura di coltura desiderata prima di trasferirli nuovamente. Per i saggi di nocicezione termica, impostare innanzitutto la temperatura della sonda termica al valore desiderato. Utilizzare un pennello o delle pinzette per trasferire delicatamente un singolo larva su una piattaforma piana, assicurandosi che il larva sia ricoperto da un sottile strato d'acqua.

Per ridurre al minimo le variazioni di pressione e garantire al contempo la posizione e l'angolo corretti della sonda termica, la pratica rende perfetti. Premere delicatamente la punta della sonda contro le larve nel segmento A4, esercitando una leggera pressione con la punta a un angolo di circa 45 gradi tra la sonda e la superficie delle larve. La pressione dovrebbe causare una lieve indentazione sulla superficie delle larve e sarà generalmente sufficiente per impedire la locomozione.

Continuare a stimolare le larve fino a quando non si verifica una risposta di ritrazione o fino al raggiungimento del cutoff numero 22. Le larve che rispondono mostrano tipicamente un comportamento preliminare caratterizzato dal sollevamento della testa e della coda, seguito dal comportamento di ritrazione consistente nel rotolare di almeno 360 gradi. Una volta iniziato il comportamento di ritrazione, interrompere il contatto con la sonda e registrare la latenza o il tempo impiegato per la ritrazione.

Se entro 20 secondi non viene osservato alcun comportamento di ritrazione, il larva è un non rispondente. Posizionare le guide luminose in fibra ottica in modo da garantire un'illuminazione adeguata con alto contrasto. Per osservare il larva, inserire il blocco riscaldante nella piastra riscaldante con la superficie piatta rivolta verso l'alto, quindi posizionare la piastra riscaldante sulla base del microscopio.

Accendere la piastra riscaldante impostandola al massimo e attendere circa 15 minuti affinché la temperatura si stabilizzi a 95 gradi Celsius. Misurare 80 microlitri di acqua distillata e posizionare una goccia d'acqua al centro di una piastra di Petri in polistirene di 60 per 15 millimetri utilizzando una micropipetta. Utilizzare una pinzetta per posizionare delicatamente un larva pulita del terzo stadio larvale al centro della goccia d'acqua, introducendo il minor quantitativo possibile di acqua aggiuntiva.

Posizionare delicatamente la piastra di Petri sul blocco riscaldante solido della piastra termica. Regolare rapidamente la posizione della piastra in modo che tutti i larve e la goccia d'acqua siano visibili. Avviare il cronometro.

In questo momento, la piastra di Petri viene posizionata sul blocco riscaldante solido della piastra termica e si registra il tempo di insorgenza di ciascun comportamento. Cinque. Comportamenti locomotori stereotipati vengono osservati dopo il trasferimento della larva immersa in acqua sulla piastra termica. Il comportamento normale in assenza di calore comprende la locomozione a parasole, accompagnata da movimenti della testa di ricerca.

Il comportamento di scuotimento della testa può verificarsi quando la larva muove rapidamente la testa in avanti o lateralmente. Questo movimento è simile alla normale locomozione in acqua, ma si presenta in modo più brusco e con un rotolamento persistente. Il comportamento si verifica quando la larva ruota lateralmente compiendo almeno un giro completo di 360 gradi.

Questo può verificarsi un numero variabile di volte e a volte comporta rotolamenti incompleti. Ai fini della valutazione del comportamento, contare soltanto i rotolamenti completi di 360 gradi. Questo comportamento è il più simile a quella situazione con applicazione locale della sonda termica durante il comportamento a frusta.

La larva mostra movimenti rapidi di contrazione e rilascio lungo l'asse antero-posteriore che avvicinano brevemente la testa alla coda. Il movimento a frusta è spesso osservato in rapida successione, due volte o contemporaneamente al rotolamento. Infine, la larva mostrerà un comportamento convulsivo, spesso seguito da paralisi. Durante il comportamento convulsivo, la larva si allunga lungo l'asse intero-posteriore e manifesta una frequenza elevata di movimenti dell'intero corpo.

Un comportamento di scuotimento senza paralisi da piegamento si verifica quando le larve cessano il movimento. In alcune larve, questo fenomeno è permanente, mentre altre successivamente mostrano un movimento pulsatorio a bassa frequenza. In questo grafico della percentuale di rispondenti appartenenti a ciascuna categoria, si osserva un limite superiore nella risposta larvale alla nocicezione termica. Nel test con la sonda termica, il 100% delle larve risponde rapidamente fino a una temperatura della sonda di 52 gradi Celsius.

Tuttavia, a 54 gradi Celsius e temperature superiori, il 90% o più delle larve non risponde nemmeno dopo 20 secondi di contatto. Sebbene queste larve continuino a muoversi dopo il 22° taglio, il numero di rotolamenti o il tempo trascorso nel comportamento di ritiro avversivo può comunque essere misurato e riportato in grafico. Sorprendentemente, sembra esserci una relazione inversa tra la temperatura di ingresso della sonda e l'intensità della risposta, poiché temperature più basse sembrano provocare un numero maggiore di rotolamenti.

Si osservano cinque comportamenti locomotori stereotipati quando il larva immerso in acqua viene trasferito sulla piastra riscaldata. Qui sono mostrate le latenze medie alle quali questi comportamenti vengono osservati, così come le temperature medie della goccia d'acqua misurate per ciascuna latenza nelle condizioni ottimali del saggio qui presentate; la percentuale di larve che mostrano ciascun comportamento distinto varia dal 77 al 100%. Sebbene occasionalmente i comportamenti di rotolamento e di frustata possano essere omessi, sovrapporsi o verificarsi in ordine inverso, qui è riportata la percentuale di larve sopravvissute dopo l'inizio del comportamento di paralisi nel saggio sulla piastra riscaldata. Le larve sono state riscaldate fino alla paralisi e successivamente rimosse per essere riposte in condizioni standard di coltura per il recupero.

Le larve trattate come controllo hanno ricevuto un trattamento equivalente, ad eccezione dell'esposizione al calore, e la formazione di PPE negli adulti vitali è stata quantitativa dal giorno sette al tredici. Qui, MD G quattro induce l'espressione di transgeni regolati da UAS in tutte e quattro le classi di neuroni sensoriali periferici multidendritici. UAS o one delta C esprime una versione modificata del canale del potassio rettificatore aperto di drosophila necessario per la trasmissione sinaptica e UAS orrc uno delta NC esprime una versione ulteriormente modificata dello stesso canale che non interferisce con la trasmissione sinaptica.

Si noti che solo le larve portatrici sia del driver MD GAL4 che del transgene UAS ORC1ΔC mostrano latenze aumentate in quattro dei cinque comportamenti osservati. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come misurare le risposte locali e globali delle larve di GEs a stimoli termici nocicettivi. Queste procedure possono essere combinate con altri metodi, come l'analisi genetica, per identificare i geni necessari per la nocicezione termica. Quando si esegue il saggio con la sonda termica, è importante ricordare di minimizzare le variazioni di pressione, posizione e angolo di contatto della sonda.