Name: Unanalisi di gradiente di temperatura per determinare le preferenze termiche delle larve di Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Scopri come determinare le preferenze termiche delle larve di Drosophila melanogaster utilizzando un gradiente termico continuo. Questo metodo permette di analizzare i meccanismi della somatosensazione in modo riproducibile.

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<ol><li>Fowler, M. A., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+TRP+channels+and+animal+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Drosophila TRP channels and animal behavior.</a> Life Sci. 92, 394-403 (2013).</li>
<li>Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+thermosensation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals.</a> Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).</li>
<li>Vriens, J., Nilius, B., Voets, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+thermosensation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Peripheral thermosensation in mammals.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (9), 573-589 (2014).</li>
<li>Rosenzweig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+ortholog+of+vertebrate+TRPA1+regulates+thermotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis.</a> Genes Dev. 19, 419-424 (2005).</li>
<li>Kwon, Y., Shim, H. S., Wang, X., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+thermotactic+behavior+via+coupling+of+a+TRP+channel+to+a+phospholipase+C+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Control of thermotactic behavior via coupling of a TRP channel to a phospholipase C signaling cascade.</a> Nat Neurosci. 11, 871-873 (2008).</li>
<li>Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+thermotactic+discrimination+between+the+optimal+and+slightly+cooler+temperatures+via+a+TRPV+channel+in+chordotonal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons.</a> J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).</li>
<li>Shen, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+rhodopsin+in+temperature+discrimination+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Function of rhodopsin in temperature discrimination in Drosophila.</a> Science. 331 (6022), 1333-1336 (2011).</li>
<li>Sokabe, T., Chen, H. S., Luo, J., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+switch+in+thermal+preference+in+Drosophila+larvae+depends+on+multiple+rhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A switch in thermal preference in Drosophila larvae depends on multiple rhodopsins.</a> Cell Rep. 17, 336-344 (2016).</li>
<li>Ni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ionotropic+Receptors+IR21a+and+IR25a+mediate+cool+sensing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila.</a> Elife. 5, 13254(2016).</li>
<li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigational+decision+making+in+Drosophila+thermotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Navigational decision making in Drosophila thermotaxis.</a> J Neurosci. 30 (12), 4261-4272 (2010).</li>
<li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+a+laboratory+handbook%22">Drosophila: a laboratory handbook</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Per garantire il successo di questo protocollo, è importante adottare misure per ottenere un numero adeguato di larve per eseguire gli esperimenti. Questi includono pre-alimentazione le mosche in flaconcini contenenti pasta di lievito per 2-3 d migliorare la deposizione delle uova. I flaconcini devono essere collocati in una vaschetta contenente acqua fiale e racchiuso in un sacchetto di plastica trasparente, che mantiene l'umidità del cibo e promuove l'alimentazione efficace dalle larve permettendo l'esposizione a cicli...

Termotassi sono impiegato dagli animali mobili per selezionare un ambiente con condizioni più favorevoli1,2,3. Se il clima è troppo caldo o troppo freddo, questo comportamento è vitale per la sopravvivenza. Inoltre, molti animali sono sensibili alle differenze molto piccole di temperatura nella gamma confortevole e cercano un ambiente con una temperatura ideale. Questo è di particolare importanza per gli organismi pecilotermi come mosche della frutta, che equilibrare la loro temperatura corporea con l'ambiente. Saggi per monitorare termotassi larvali sono stati strumentali nell'individuare e chiarire i ruoli di sensori molecolari come Drosophila transitoria potenziale del ricevitore (TRP) canali4,5,6, Rhodopsins7,8e ionotropici recettore recettori (IRs)9, che dotare questi animali con le sensibilità di temperatura negli intervalli di temperatura diversi.
Un test a scelta a due vie fornisce un approccio per lo studio termiche preferenze in larve6,7. L'analisi comporta che istituisce due zone di temperatura distinte e permette agli animali di selezionare un lato rispetto a altro. I risultati dalle prove di scelta bidirezionale possono essere robusti, soprattutto se le differenze di temperatura tra le due opzioni sono grandi. Inoltre, poiché ogni dosaggio comporta tabulando solo due gruppi, i dati possono essere espresso come un indice semplice preferenza. La facilità e la semplicità di analisi scelta bidirezionale sono anche suscettibili di schermi genetici. Tuttavia, una limitazione importante è che molti esperimenti sono necessari per stabilire la temperatura preferita degli animali wild-type o mutanti.
Un'analisi di gradiente offre la possibilità di stabilire la temperatura preferita in una sola analisi8. Inoltre, a differenza del test a scelta a due vie, permette la valutazione della distribuzione di un gruppo di animali, quando si confronta con una serie continua di temperature. Un gradiente test utilizza una capsula di Petri e singoli animali ed è adatto per caratterizzare il comportamento dettagliato dei singoli animali10. Tuttavia, poiché le capsule di Petri sono rotondi, le dimensioni delle zone di temperatura variano e sono progressivamente più piccole a seconda della distanza dal centro. Pertanto, questa configurazione non è ideale per monitorare le selezioni di temperatura delle popolazioni di animali.
Un apparato di gradiente termico continuo che ben si adatta per valutare le preferenze di temperatura dei gruppi delle larve impiega un'arena rettangolare ed è descritto qui. L'apparato è semplice da costruire e assemblare. Inoltre, la sfumatura è lineare ed è flessibile in quanto può essere utilizzato per valutare la termotassi sopra ampi range di temperatura da 10 ° C a 42 ° C. Il dosaggio è rapido e semplice da eseguire e produce dati riproducibili. Oltre a segnalare la temperatura favorita delle larve, rivela le preferenze della popolazione degli animali nel corso di un'intera gamma lineare in un singolo esperimento. A causa di questi vantaggi, è una scelta eccellente per l'identificazione dei geni richiesti per la termotassi.

<table><tbody><tr><td>Apparecchio per saggi a gradiente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PolyScience 9106, Bagno circolante refrigerato/riscaldato da 6 litri</td><td>Thomas Scientific</td><td>9106</td><td>Questo modello è fuori produzione. I modelli sostitutivi aggiornati includono: 1186R00 e 1197U04 per 120 V, 60 Hz, o 1184L08 e 1197U04 per 240 V, 50 Hz.</td></tr><tr><td>Piastra di analisi in alluminio (per gradiente unidirezionale)</td><td></td><td></td><td>Dimensioni esterne: 14 x 10,1 x 0,9 cm, dimensioni interne: 12,9 x 8,7 x 0,8 cm, anodizzato nero.</td></tr><tr><td>Piastra in alluminio (per gradiente bidirezionale)</td><td></td><td></td><td>25 x 22 x 0,2 cm, anodizzata nera.</td></tr><tr><td>Dimensioni</td><td></td><td></td><td>esterne: 25,5 x 5 x 1,4 cm, i parametri dei canali interni sono mostrati nella Figura 1D.</td></tr><tr><td>Connettore per blocchi e tubi in alluminio</td><td>McMaster-Carr</td><td>91355K82</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Tubi in silicone sanitario</td><td>Tygon</td><td>57296</td><td>1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Articoli e reagenti per assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pestle</td><td>USA Scientific</td><td>17361</td><td>Pestello per provette da microcentrifuga da 1,5 mL</td></tr><tr><td>Termometro</td><td>Fluke</td><td>51II</td><td></td></tr><tr><td>Termocoppia</td><td>Fluke</td><td>tipo</td><td></td>K</tr><tr><td>Coperchio universale per micropiastre</td><td>Corning</td><td>6980A77</td><td></td></tr><tr><td>piatto da 35 mm</td><td>Corning</td><td>9380D40</td><td></td></tr><tr><td>Nastro per etichettatura (per gradiente bidirezionale)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-951</td><td>Fisherbrand Nastro per etichettatura 2 pollici x 14 yds</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Invitrogen</td> 16500500 <td>Preparare una soluzione all'1%</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma</td><td>S0389-5KG</td><td>Preparare una soluzione al 18% subito prima di iniziare il test</td></tr><tr><td>Pennello</td><td>Fisher Scientific</td><td>11860</td><td></td></tr><tr><td>Provette</td> <td>da centrifuga da 50 mlDenville</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>Scoopula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>500 mL flacone rotondo a bocca larga</td><td>Pyrex</td><td>1395-500</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare (poro 300 mm)</td><td>PluriSelect</td><td>43-50300</td><td>Articolo opzionale per il lavaggio delle larve</td></tr><tr><td>Scatola di cartone (vassoio per fiale)</td><td>Genesee Scientific</td><td>FS32-124</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Drosophila food</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acqua</td><td></td><td></td> distillata <td>22.400 ml</td></tr><tr><td>Farina di mais, gialla (maglia extra fine, floccata) 20 kg</td><td>LabScientific Inc.</td><td>NC0535320</td><td>1.609 g</td></tr><tr><td>Lievito di birra 100 libbre</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN90331280</td><td>379 g</td></tr><tr><td>NutriSoy&reg; Farina di soia (10 kg/unità)</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-115</td><td>221 g</td></tr><tr><td>Drosophila Agar, Tipo II (5 kg)</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td>190 g</td></tr><tr><td>Sciroppo di mais leggero Karo</td><td>Karo</td><td></td><td>1.700 mL</td></tr><tr><td>Metil 4-idrossibenzoato (sospendere in etanolo 200 proof)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H5501-5KG</td><td>72 g/240 mL</td></tr><tr><td>Acido propionico puriss. p.a., >99,5% (GC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81910-1 L</td><td>108 mL</td></tr><tr><td>Acido fosforico&nbsp; Reagente ACS, &ge; 85 % in peso in H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>438081-500 mL</td><td>8,5 mL</td></tr></tbody></table>

un'analisi di gradiente di temperatura per determinare le preferenze termiche delle larve di drosophila

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

Molti animali, tra cui la Mosca della frutta, Drosophila melanogaster, sono in grado di discriminare minuscole differenze nella temperatura ambientale, che permette loro di cercare il loro paesaggio termale preferito. Per definire le preferenze di temperatura delle larve in un definito intervallo lineare, abbiamo sviluppato un'analisi usando un gradiente di temperatura. Per stabilire un gradiente di singolo-direzionale, due blocchi di alluminio sono collegati ai bagni di acqua indipendenti, ognuno dei quali controlla la temperatura dei singoli blocchi. I due blocchi impostare i limiti superiori e inferiori della sfumatura. Il gradiente di temperatura viene stabilito dall'immissione una piastra di alluminio rivestite su agarosio sopra i due blocchi d'acqua controllato in modo che la piastra si estende la distanza tra di loro. Le estremità della piastra in alluminio che è situato in cima ai blocchi d'acqua definisce le temperature minime e massime, e le regioni-tra i due blocchi formano una sfumatura lineare di temperatura. Il dosaggio di sfumato può essere applicato alle larve di diversa età e può essere utilizzato per identificare i mutanti che presentano fenotipi, come quelli con mutazioni a carico di geni che codificano per canali TRP e opsine, che sono necessari per la discriminazione di temperatura.

Per stabilire un singolo 18 ° C - 28 ° C-direzionale gradienti, abbiamo impostato le temperature dei due bagni a 16,8 ° C e 31 ° C. Otteniamo le temperature a 13 punti misurando la temperatura a 26 posizioni all'interno di porzioni superiore ed inferiore di tutte le 6 zone, le linee di confine tra le zone e alle estremità della superficie del gel di agarosio (Figura 2, 2E). La distribuzione di temperatura lungo il gradiente era quasi lineare ...

Qui, presentiamo un protocollo per determinare la temperatura ambientale preferita delle larve di Drosophila utilizzando un gradiente termico continuo.

Un'analisi di gradiente di temperatura per determinare le preferenze termiche delle larve di Drosophila

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

Questo metodo può essere utilizzato per affrontare una questione chiave nel campo della somatosensazione, il meccanismo attraverso il quale un animale, come la drosophila melanogaster, seleziona la sua temperatura ambientale preferita. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può stabilire la temperatura preferita del gruppo di larve in un unico test quando si confronta con un intervallo continuo di temperature. Oltre a fornire informazioni sulle preferenze di temperatura delle larve di Drosophila, la piastra impress può anche essere adattata per l'uso con altri organismi modello come il verme, C elegans.Per prima cosa, prepara la pasta di lievito per preparare le fiale per una croce. Mescolare i granuli di lievito in acqua distillata e macinarli in una pasta con un pestello. Quindi, aggiungi una piccola quantità di pasta di lievito vicino alle pareti interne delle fiale di drosofila standard, appena sopra la superficie del cibo.Per produrre le larve, raccogli da 12 a 35 femmine e fino alla metà dei maschi, ma non più di 10 maschi. Unire questi gruppi nel flaconcino contenente pasta di lievito. Caricare le fiale preparate in una vaschetta da 100 fiale.Includere 20 fiale aperte caricate con acqua nel vassoio per fornire umidità. Quindi, sigillare il vassoio in un sacchetto di plastica trasparente e incubarlo a 25 gradi Celsius per 48 ore. Dopo 48 ore di alimentazione e accoppiamento, trasferisci le mosche in nuove fiale di cibo per raccogliere le uova.Toccali. Non utilizzare anidride carbonica. Quindi, lascia che le mosche depongano le uova per tre ore a 25 gradi Celsius.Successivamente, rimuovere gli adulti e rimettere le fiale contenenti le uova nella vaschetta con le fiale d'acqua e chiudere il sacchetto. Quindi, sviluppa le uova a 25 gradi Celsius fino allo stadio larvale desiderato. Per preparare un gradiente unidirezionale, creare prima un ambiente umano per il saggio.Posiziona due blocchi di alluminio collegati a bagnomaria separati su tovaglioli di carta bagnati, a 10 centimetri di distanza. I bagni d'acqua devono essere riscaldati in anticipo. Quindi, preparare 100 millilitri di agarosio all'1% e aggiungere 25 millilitri a ciascuna piastra di analisi su una superficie piana.Una volta che l'agarosio si è solidificato, strofinare delicatamente la superficie con una spugna melaminica per rendere la superficie leggermente ruvida. Quindi, per favorire un efficiente trasferimento della temperatura, riempire eventuali spazi tra i blocchi di alluminio nelle piastre del saggio con acqua erogata da un flacone spray. Ora, posiziona le piastre di analisi sui blocchi di alluminio e assicurati che le demarcazioni siano a due centimetri da entrambi i bordi per corrispondere esattamente ai bordi dei blocchi di alluminio.Quindi, spruzzare una pellicola d'acqua sulla superficie delle piastre in modo che i gel non si secchino. Successivamente, coprire il sistema con una scatola di cartone per ridurre l'evaporazione e aiutare a stabilizzare la temperatura della superficie del gel. Attendere da cinque a 10 minuti per consentire alla temperatura di stabilizzarsi.Quindi, controlla la temperatura superficiale sulla piastra in almeno 12 punti per assicurarti che ci sia una temperatura uniforme dappertutto, più o meno due gradi Celsius. Quindi riposizionare il coperchio della scatola fino all'esecuzione del test. Per isolare le larve pulite, aggiungere prima circa 40 millilitri di soluzione di saccarosio al 18% in una provetta da 50 millilitri.Quindi trasferisci le larve dai mucchi di cibo nella soluzione, usando una scoopula. Quindi, mescola accuratamente le larve nella soluzione, usando la scoopula. Ora, attendi da 30 a 60 secondi affinché le larve galleggino nello strato superiore del tubo.Quindi versare la soluzione con le larve in un altro tubo da 50 millilitri e completare con saccarosio fresco al 18%. Ancora una volta, attendi che le larve galleggino. La presenza di cibo può influenzare i risultati.Pertanto, al fine di ottenere risultati riproducibili, è importante pulire accuratamente le larve per ridurre al minimo la contaminazione con il cibo. Fallo delicatamente, per evitare danni alle larve. Quindi, posizionare un filtro cellulare da 300 micron sopra un tubo da 50 millilitri, quindi rimuovere eventuali corpi adulti morti e detriti galleggianti dalla superficie della soluzione di saccarosio.Ora, versa le larve attraverso il colino per raccoglierle sullo schermo a rete. Quindi, fai scorrere circa 50 millilitri di acqua attraverso il colino due volte per pulire ulteriormente le larve. Quindi, su un piatto vuoto da 35 millimetri, sciacquare la maggior parte delle larve dal colino, usando acqua.Usa un pennello per trasferire le larve rimanenti sulla rete. Quindi, aspirare la maggior parte dell'acqua dal piatto utilizzando una micropipetta. Quindi posizionare il coperchio sul piatto capovolto in modo che le larve non possano scappare.Ora, lasciare che le larve si riprendano per 10-20 minuti prima di iniziare il test. Per prima cosa, rimuovi la scatola di cartone sopra il gel e controlla rapidamente la temperatura superficiale del gel. Se la superficie è asciutta, spruzzare una piccola quantità d'acqua sulla superficie.Se il gel è buono, caricare da 100 a 200 larve al centro di ogni piastra, usando un piccolo pennello. Quindi, posizionare un coperchio su ciascuna piastra di analisi per intrappolare le larve e coprire il set-up con una scatola di cartone per evitare l'esposizione alla luce. Il test è ora in corso.Dopo 10-30 minuti, rimuovere la scatola di cartone e il coperchio della micropiastra. Quindi, fotografa le lastre dall'alto per registrare la posizione delle larve. Posiziona la scatola sopra la fotocamera per evitare riflessi sulla superficie del gel.Per ripulire la piastra, aspirare tutte le larve ovunque si siano disperse. Ora, calcola la distribuzione percentuale delle larve in ogni zona, utilizzando un software di analisi delle immagini. Tracciare linee ogni due centimetri, in base alle demarcazioni sulla piastra di analisi e contare il numero di larve in ciascuna zona.Durante il conteggio, ignorare le larve distribuite in creste a 0,5 centimetri da ciascun bordo poiché lo spessore del gel e le condizioni di temperatura non sono uniformi vicino al bordo. Da 18 gradi Celsius a 28 gradi Celsius, il gradiente unidirezionale è stato realizzato utilizzando bagni d'acqua impostati su 16,8 gradi Celsius e 31 gradi Celsius. La distribuzione della temperatura lungo il gradiente è risultata essere quasi lineare.Le larve di controllo sono state analizzate a varie età. Le larve del primo, secondo e dell'inizio del terzo stadio hanno mostrato preferenze di picco per la zona dei 24 gradi Celsius. Durante la metà del terzo stadio, la maggior parte delle larve si è accumulata nella zona dei 18 gradi Celsius.Le larve non vaganti del tardo terzo stadio erano strettamente raggruppate nella zona dei 18 gradi Celsius. La propensione ad accumularsi nella zona di 18 gradi Celsius nel ceppo di controllo, che era White 1118, non era dovuta a un effetto bordo, poiché le larve di fine terzo stadio si accumulavano ancora nella zona di 18 gradi Celsius, utilizzando un gradiente bidirezionale. Quando abbiamo analizzato le mutazioni che ospitano larve di terzo stadio necessarie per discriminare la temperatura, i risultati sono cambiati.Le larve con una mutazione nulla in trpA1 si distribuivano equamente su tutto il gradiente da 18 gradi Celsius a 28 gradi Celsius. Anche le larve prive solo delle isoforme A e B o delle isoforme C e D di trpA1 hanno mostrato gravi menomazioni. Anche le larve con una mutazione in uno dei due geni che codificano per la fosfolipasi c beta, norpA, sono state interrotte.Tuttavia, le larve con una mutazione in un gene che codifica per l'altra fosfolipasi c beta, plc21c, si sono comportate normalmente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una chiara comprensione di come ottenere risultati riproducibili utilizzando un gradiente termico continuo, che ti permetterà di confrontare le preferenze di temperatura delle larve di drosophila wild type e mutante. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti per un singolo test.Durante il tentativo di questa procedura, è importante prestare attenzione alle condizioni delle fiale di mosca e non utilizzare le larve se sono essiccate. Questa tecnica semplifica la scoperta di nuovi geni necessari alle larve di drosophila per selezionare la loro temperatura preferita nell'intervallo confortevole.

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