Name: Unanalisi di gradiente di temperatura per determinare le preferenze termiche delle larve di Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Scopri come determinare le preferenze termiche delle larve di Drosophila melanogaster utilizzando un gradiente termico continuo. Questo metodo permette di analizzare i meccanismi della somatosensazione in modo riproducibile.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C.M. è supportato da finanziamenti da nia (EY008117, EY010852), NIDCD (DC007864, DC016278) e il NIAID (1DP1AI124453).

<ol><li>Fowler, M. A., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+TRP+channels+and+animal+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Drosophila TRP channels and animal behavior.</a> Life Sci. 92, 394-403 (2013).</li>
<li>Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+thermosensation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals.</a> Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).</li>
<li>Vriens, J., Nilius, B., Voets, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+thermosensation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Peripheral thermosensation in mammals.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (9), 573-589 (2014).</li>
<li>Rosenzweig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+ortholog+of+vertebrate+TRPA1+regulates+thermotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis.</a> Genes Dev. 19, 419-424 (2005).</li>
<li>Kwon, Y., Shim, H. S., Wang, X., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+thermotactic+behavior+via+coupling+of+a+TRP+channel+to+a+phospholipase+C+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Control of thermotactic behavior via coupling of a TRP channel to a phospholipase C signaling cascade.</a> Nat Neurosci. 11, 871-873 (2008).</li>
<li>Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+thermotactic+discrimination+between+the+optimal+and+slightly+cooler+temperatures+via+a+TRPV+channel+in+chordotonal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons.</a> J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).</li>
<li>Shen, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+rhodopsin+in+temperature+discrimination+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Function of rhodopsin in temperature discrimination in Drosophila.</a> Science. 331 (6022), 1333-1336 (2011).</li>
<li>Sokabe, T., Chen, H. S., Luo, J., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+switch+in+thermal+preference+in+Drosophila+larvae+depends+on+multiple+rhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A switch in thermal preference in Drosophila larvae depends on multiple rhodopsins.</a> Cell Rep. 17, 336-344 (2016).</li>
<li>Ni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ionotropic+Receptors+IR21a+and+IR25a+mediate+cool+sensing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila.</a> Elife. 5, 13254(2016).</li>
<li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigational+decision+making+in+Drosophila+thermotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Navigational decision making in Drosophila thermotaxis.</a> J Neurosci. 30 (12), 4261-4272 (2010).</li>
<li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+a+laboratory+handbook%22">Drosophila: a laboratory handbook</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Per garantire il successo di questo protocollo, è importante adottare misure per ottenere un numero adeguato di larve per eseguire gli esperimenti. Questi includono pre-alimentazione le mosche in flaconcini contenenti pasta di lievito per 2-3 d migliorare la deposizione delle uova. I flaconcini devono essere collocati in una vaschetta contenente acqua fiale e racchiuso in un sacchetto di plastica trasparente, che mantiene l'umidità del cibo e promuove l'alimentazione efficace dalle larve permettendo l'esposizione a cicli...

Termotassi sono impiegato dagli animali mobili per selezionare un ambiente con condizioni più favorevoli1,2,3. Se il clima è troppo caldo o troppo freddo, questo comportamento è vitale per la sopravvivenza. Inoltre, molti animali sono sensibili alle differenze molto piccole di temperatura nella gamma confortevole e cercano un ambiente con una temperatura ideale. Questo è di particolare importanza per gli organismi pecilotermi come mosche della frutta, che equilibrare la loro temperatura corporea con l'ambiente. Saggi per monitorare termotassi larvali sono stati strumentali nell'individuare e chiarire i ruoli di sensori molecolari come Drosophila transitoria potenziale del ricevitore (TRP) canali4,5,6, Rhodopsins7,8e ionotropici recettore recettori (IRs)9, che dotare questi animali con le sensibilità di temperatura negli intervalli di temperatura diversi.
Un test a scelta a due vie fornisce un approccio per lo studio termiche preferenze in larve6,7. L'analisi comporta che istituisce due zone di temperatura distinte e permette agli animali di selezionare un lato rispetto a altro. I risultati dalle prove di scelta bidirezionale possono essere robusti, soprattutto se le differenze di temperatura tra le due opzioni sono grandi. Inoltre, poiché ogni dosaggio comporta tabulando solo due gruppi, i dati possono essere espresso come un indice semplice preferenza. La facilità e la semplicità di analisi scelta bidirezionale sono anche suscettibili di schermi genetici. Tuttavia, una limitazione importante è che molti esperimenti sono necessari per stabilire la temperatura preferita degli animali wild-type o mutanti.
Un'analisi di gradiente offre la possibilità di stabilire la temperatura preferita in una sola analisi8. Inoltre, a differenza del test a scelta a due vie, permette la valutazione della distribuzione di un gruppo di animali, quando si confronta con una serie continua di temperature. Un gradiente test utilizza una capsula di Petri e singoli animali ed è adatto per caratterizzare il comportamento dettagliato dei singoli animali10. Tuttavia, poiché le capsule di Petri sono rotondi, le dimensioni delle zone di temperatura variano e sono progressivamente più piccole a seconda della distanza dal centro. Pertanto, questa configurazione non è ideale per monitorare le selezioni di temperatura delle popolazioni di animali.
Un apparato di gradiente termico continuo che ben si adatta per valutare le preferenze di temperatura dei gruppi delle larve impiega un'arena rettangolare ed è descritto qui. L'apparato è semplice da costruire e assemblare. Inoltre, la sfumatura è lineare ed è flessibile in quanto può essere utilizzato per valutare la termotassi sopra ampi range di temperatura da 10 ° C a 42 ° C. Il dosaggio è rapido e semplice da eseguire e produce dati riproducibili. Oltre a segnalare la temperatura favorita delle larve, rivela le preferenze della popolazione degli animali nel corso di un'intera gamma lineare in un singolo esperimento. A causa di questi vantaggi, è una scelta eccellente per l'identificazione dei geni richiesti per la termotassi.

<table><tbody><tr><td>Apparecchio per saggi a gradiente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PolyScience 9106, Bagno circolante refrigerato/riscaldato da 6 litri</td><td>Thomas Scientific</td><td>9106</td><td>Questo modello è fuori produzione. I modelli sostitutivi aggiornati includono: 1186R00 e 1197U04 per 120 V, 60 Hz, o 1184L08 e 1197U04 per 240 V, 50 Hz.</td></tr><tr><td>Piastra di analisi in alluminio (per gradiente unidirezionale)</td><td></td><td></td><td>Dimensioni esterne: 14 x 10,1 x 0,9 cm, dimensioni interne: 12,9 x 8,7 x 0,8 cm, anodizzato nero.</td></tr><tr><td>Piastra in alluminio (per gradiente bidirezionale)</td><td></td><td></td><td>25 x 22 x 0,2 cm, anodizzata nera.</td></tr><tr><td>Dimensioni</td><td></td><td></td><td>esterne: 25,5 x 5 x 1,4 cm, i parametri dei canali interni sono mostrati nella Figura 1D.</td></tr><tr><td>Connettore per blocchi e tubi in alluminio</td><td>McMaster-Carr</td><td>91355K82</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Tubi in silicone sanitario</td><td>Tygon</td><td>57296</td><td>1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Articoli e reagenti per assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pestle</td><td>USA Scientific</td><td>17361</td><td>Pestello per provette da microcentrifuga da 1,5 mL</td></tr><tr><td>Termometro</td><td>Fluke</td><td>51II</td><td></td></tr><tr><td>Termocoppia</td><td>Fluke</td><td>tipo</td><td></td>K</tr><tr><td>Coperchio universale per micropiastre</td><td>Corning</td><td>6980A77</td><td></td></tr><tr><td>piatto da 35 mm</td><td>Corning</td><td>9380D40</td><td></td></tr><tr><td>Nastro per etichettatura (per gradiente bidirezionale)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-951</td><td>Fisherbrand Nastro per etichettatura 2 pollici x 14 yds</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Invitrogen</td> 16500500 <td>Preparare una soluzione all'1%</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma</td><td>S0389-5KG</td><td>Preparare una soluzione al 18% subito prima di iniziare il test</td></tr><tr><td>Pennello</td><td>Fisher Scientific</td><td>11860</td><td></td></tr><tr><td>Provette</td> <td>da centrifuga da 50 mlDenville</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>Scoopula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>500 mL flacone rotondo a bocca larga</td><td>Pyrex</td><td>1395-500</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare (poro 300 mm)</td><td>PluriSelect</td><td>43-50300</td><td>Articolo opzionale per il lavaggio delle larve</td></tr><tr><td>Scatola di cartone (vassoio per fiale)</td><td>Genesee Scientific</td><td>FS32-124</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Drosophila food</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acqua</td><td></td><td></td> distillata <td>22.400 ml</td></tr><tr><td>Farina di mais, gialla (maglia extra fine, floccata) 20 kg</td><td>LabScientific Inc.</td><td>NC0535320</td><td>1.609 g</td></tr><tr><td>Lievito di birra 100 libbre</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN90331280</td><td>379 g</td></tr><tr><td>NutriSoy&reg; Farina di soia (10 kg/unità)</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-115</td><td>221 g</td></tr><tr><td>Drosophila Agar, Tipo II (5 kg)</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td>190 g</td></tr><tr><td>Sciroppo di mais leggero Karo</td><td>Karo</td><td></td><td>1.700 mL</td></tr><tr><td>Metil 4-idrossibenzoato (sospendere in etanolo 200 proof)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H5501-5KG</td><td>72 g/240 mL</td></tr><tr><td>Acido propionico puriss. p.a., >99,5% (GC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81910-1 L</td><td>108 mL</td></tr><tr><td>Acido fosforico&nbsp; Reagente ACS, &ge; 85 % in peso in H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>438081-500 mL</td><td>8,5 mL</td></tr></tbody></table>

un'analisi di gradiente di temperatura per determinare le preferenze termiche delle larve di drosophila

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

Molti animali, tra cui la Mosca della frutta, Drosophila melanogaster, sono in grado di discriminare minuscole differenze nella temperatura ambientale, che permette loro di cercare il loro paesaggio termale preferito. Per definire le preferenze di temperatura delle larve in un definito intervallo lineare, abbiamo sviluppato un'analisi usando un gradiente di temperatura. Per stabilire un gradiente di singolo-direzionale, due blocchi di alluminio sono collegati ai bagni di acqua indipendenti, ognuno dei quali controlla la temperatura dei singoli blocchi. I due blocchi impostare i limiti superiori e inferiori della sfumatura. Il gradiente di temperatura viene stabilito dall'immissione una piastra di alluminio rivestite su agarosio sopra i due blocchi d'acqua controllato in modo che la piastra si estende la distanza tra di loro. Le estremità della piastra in alluminio che è situato in cima ai blocchi d'acqua definisce le temperature minime e massime, e le regioni-tra i due blocchi formano una sfumatura lineare di temperatura. Il dosaggio di sfumato può essere applicato alle larve di diversa età e può essere utilizzato per identificare i mutanti che presentano fenotipi, come quelli con mutazioni a carico di geni che codificano per canali TRP e opsine, che sono necessari per la discriminazione di temperatura.

Per stabilire un singolo 18 ° C - 28 ° C-direzionale gradienti, abbiamo impostato le temperature dei due bagni a 16,8 ° C e 31 ° C. Otteniamo le temperature a 13 punti misurando la temperatura a 26 posizioni all'interno di porzioni superiore ed inferiore di tutte le 6 zone, le linee di confine tra le zone e alle estremità della superficie del gel di agarosio (Figura 2, 2E). La distribuzione di temperatura lungo il gradiente era quasi lineare ...

Qui, presentiamo un protocollo per determinare la temperatura ambientale preferita delle larve di Drosophila utilizzando un gradiente termico continuo.

Un'analisi di gradiente di temperatura per determinare le preferenze termiche delle larve di Drosophila

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

Questo metodo può essere utilizzato per affrontare una questione chiave nel campo della somatosensazione, il meccanismo attraverso il quale un animale, come la drosophila melanogaster, seleziona la sua temperatura ambientale preferita. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può stabilire la temperatura preferita del gruppo di larve in un unico test quando si confronta con un intervallo continuo di temperature. Oltre a fornire informazioni sulle preferenze di temperatura delle larve di Drosophila, la piastra impress può anche essere adattata per l'uso con altri organismi modello come il verme, C elegans.Per prima cosa, prepara la pasta di lievito per preparare le fiale per una croce. Mescolare i granuli di lievito in acqua distillata e macinarli in una pasta con un pestello. Quindi, aggiungi una piccola quantità di pasta di lievito vicino alle pareti interne delle fiale di drosofila standard, appena sopra la superficie del cibo.Per produrre le larve, raccogli da 12 a 35 femmine e fino alla metà dei maschi, ma non più di 10 maschi. Unire questi gruppi nel flaconcino contenente pasta di lievito. Caricare le fiale preparate in una vaschetta da 100 fiale.Includere 20 fiale aper

a-temperature-gradient-assay-to-determine-thermal-preferences

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

In questo articolo dimostriamo saggi per studiare nocicezione...

Metodi locale e globale valutazione nocicezione termica in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

Questo video descrive il saggio delle preferenze gustative, un metodo comportamentale utilizzato per misurare l'attrazione o l'evitamento verso soluzioni colorate che hanno un sapore diverso valutando la colorazione addominale della mosca dopo l'ingestione della sostanza preferita. Il protocollo presentato dimostra la procedura utilizzata per misurare la preferenza dei moscerini verso soluzioni con concentrazioni variabili di saccarosio.

Saggio delle preferenze gustative: un metodo per misurare il comportamento alimentare in Drosophila

Le larve di Drosophila hanno neuroni sensoriali dedicati, nocicettori, la cui risposta a stimoli termici potenzialmente dannosi innesca comportamenti avversivi, o cosiddetti "nocifensivi", nell'animale. Questo video descrive un metodo per valutare la nocicezione termica registrando il comportamento larvale in risposta all'applicazione locale di una sonda termica sulla cuticola. Questo metodo è quindi chiamato saggio della sonda di calore locale.

Saggio con sonda termica locale: un metodo per valutare la nocicezione delle alte temperature nelle larve di Drosophila

I moscerini della frutta Drosophila possono distinguere piccoli cambiamenti di temperatura e quindi selezionare ambienti con condizioni termiche favorevoli. Questo video descrive un test comportamentale che verifica la preferenza di temperatura delle larve di Drosophila su un gradiente termico lineare.

Saggio del gradiente di temperatura: un metodo per testare la preferenza di temperatura nelle larve di Drosophila

Recentemente abbiamo identificato un nuovo uscita circadiana Drosophila, ritmo di preferenza della temperatura (TPR), in cui la temperatura preferita nelle mosche aumenta durante il giorno e cade durante la notte. Il TPR è regolato indipendentemente da un'altra uscita circadiana, l'attività locomotoria. Qui descriviamo la progettazione e l'analisi del TPR in Drosophila.

Progettazione e analisi del comportamento delle preferenze di temperatura e del suo ritmo circadiano in Drosophila

Questo rapporto descrive un metodo per misurare l'attività larvale di Drosophila utilizzando il TriKinetics Drosophila Activity Monitor. Il dispositivo utilizza raggi infrarossi per rilevare i movimenti di un massimo di 16 singoli animali. I dati possono essere analizzati per rappresentare i parametri di movimento, tra cui i tassi e le posizioni degli animali all'interno delle camere di saggio.

Misura della larvali attività nel<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Qui mostriamo un nuovo metodo di analisi per studiare nocicezione freddo in Drosophila larve. Questo dosaggio utilizza una sonda custom-built Peltier in grado di applicare una focale stimolo freddo nociva e si traduce in comportamenti specifici a freddo quantificabili. Questa tecnica consentirà un'ulteriore dissezione cellulari e molecolari della nocicezione freddo.

Nuovo metodo di analisi per Cold nocicezione in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

Qui presentiamo un protocollo per determinare automaticamente le prestazioni dell'apparato locomotore di Drosophila alle variazioni di temperatura usando un arena di temperatura programmabile che produce i cambiamenti di temperatura veloce ed accurato nel tempo e nello spazio.

Un metodo automatizzato per determinare le prestazioni della drosofila in risposta a variazioni di temperatura nello spazio e nel tempo

I limiti termici possono prevedere gli ambienti che gli organismi tollerano, che sono informazioni preziose di fronte al rapido cambiamento climatico. Qui descritti sono protocolli ad alto rendimento per valutare il minimo termico critico e il tempo di abbattimento del calore negli insetti. Entrambi i protocolli massimizzano la velocità effettiva e riducono al minimo il costo dei test.

Analisi ad alta velocità di produzione dei limiti termici critici negli insetti

Gli insetti hanno un intervallo di temperatura ambientale ottimale in cui cercano di rimanere all'interno e molti fattori esterni e interni possono alterare questa preferenza. Qui, descriviamo un metodo economico e semplice per studiare la scelta della temperatura, che consente agli insetti di esibire liberamente i loro comportamenti naturali.

Determinazione della preferenza di temperatura di zanzare e altri ectotermi

Questo rapporto descrive un metodo per misurare il tempo di abbattimento della Drosophila melanogaster adulta utilizzando un monitor di attività della Drosophila (DAM2) in risposta a un fattore di stress del calore di conduzione dell'aria all'interno di una camera dell'incubatrice. Il DAM2 misura l'attività registrando i movimenti delle singole mosche mentre attraversano un raggio infrarosso. L'analisi dei dati è facilitata da un nuovo file eseguibile creato dagli autori.

Saggi di tolleranza al calore con il sistema di monitoraggio dell'attività della Drosophila : una guida a un'applicazione eseguibile per l'analisi dei dati

Scopri come determinare le preferenze termiche delle larve di Drosophila melanogaster utilizzando un gradiente termico continuo. Questo metodo permette di analizzare i meccanismi della somatosensazione in modo riproducibile.

Un'analisi di gradiente di temperatura per determinare le preferenze termiche delle larve di Drosophila

Esplora altri video