Un saggio e strumenti migliorati per misurare la nocicezione meccanica nelle larve di Drosophila

Questo protocollo è significativo perché consente all'utente di costruire uno strumento che può essere utilizzato per misurare con precisione le risposte meccaniche alla nocicezione nelle larve di Drosophila geneticamente trattabili. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza materiali semplici per costruire strumenti personalizzati che possono essere utilizzati per misurare la nocicezione meccanica dalla sottosoglia all'intervallo di risposta completa. Questi strumenti e metodi possono essere utilizzati per misurare la nocicezione meccanica di base e la sensibilizzazione nocicettiva a seguito di lesioni o malattie.

Sondare le larve con filamenti personalizzati richiede pratica. Gli utenti dovrebbero essere in grado di generare curve dose-risposta con larve di controllo prima di tentare un esperimento. Per costruire una sonda meccanica, utilizzare un piccolo tronchese per tagliare ogni filamento di Nitinol alla lunghezza specificata perpendicolarmente al suo asse lungo.

I filamenti sono disponibili in tre diversi diametri preimpostati. Esaminare la punta dei filamenti con uno stereomicroscopio per assicurarsi che non rimangano bordi taglienti o irregolari che potrebbero causare danni ai tessuti della pelle della larva e interferire con la calibrazione. Quindi utilizzare una pietra per affilare per levigare manualmente i bordi della sonda fino a quando non persistono irregolarità taglienti.

Quindi, usa un ago ipodermico per fare un buco vicino all'estremità di un bastoncino di ghiacciolo di legno. Applicare la colla per legno su un singolo filamento di Nitinol e inserire il filamento rivestito di colla nella fessura dell'ago. Quando la colla si è asciugata, premere la sonda contro la scala fino a quando la sonda non si piega per determinare la forza massima che può essere registrata in grammi.

Usa la formula per convertire la massa registrata in forza in millinewton. Quindi dividere la forza misurata per l'area superficiale della punta del filamento per convertire la forza calcolata in kilopascal di pressione. La preparazione di più sonde utilizzando filamenti di diversi diametri e lunghezze genererà un set completo, che copre la gamma di risposta per le larve di Drosophila.

Per preparare le larve di Drosophila per un esperimento, allevare la progenie larvale con cibo standard in un'incubatrice a 25 gradi Celsius per circa 96 ore. Quando le larve raggiungono il terzo stadio di stadio, preparare un tappo di cibo per mosche in una piccola capsula di Petri per le larve da testare e utilizzare una pinza per separare delicatamente le larve di medie dimensioni del terzo stadio dal secondo e all'inizio del terzo stadio più piccole e dalle larve più grandi del terzo stadio tardivo o errante. Quindi usa la pinza per trasferire da 20 a 30 larve di metà terzo stadio in una piccola capsula di Petri contenente un piccolo tappo di cibo per mosche inumidito con acqua a temperatura ambiente.

Per eseguire un test di nocicezione meccanica, utilizzare una pinza per posizionare una larva di stadio medio del terzo stadio su un cuscinetto di vinile scuro e sottile sotto uno stereomicroscopio a campo chiaro e disporre le luci a fibre ottiche tra le lenti dell'obiettivo del microscopio e il tampone. Usa un tovagliolo di carta per rimuovere l'acqua in eccesso che circonda la larva e sposta il cuscinetto per orientare la testa e la bocca della larva verso la mano non dominante del ricercatore. Selezionare una sonda meccanica e applicare la sonda sul lato dorsale posteriore della larva a circa il segmento addominale A8 per uno o due secondi, comprimendo accuratamente la larva nel cuscinetto sottostante nel punto di contatto della sonda fino a quando la sonda non si piega e suscita la quantità di pressione precedentemente misurata.

Una risposta nocicettiva positiva è indicata se la larva mostra un rotolo completo di cavatappi di 360 gradi lungo l'asse del suo corpo entro tre secondi. Registra la risposta comportamentale per ogni larva. Quindi scartare la larva testata e preparare la larva successiva per il saggio.

Queste sonde meccaniche personalizzate con filamenti di Nitinol possono essere utilizzate per suscitare comportamenti evocati meccanicamente e per generare una curva dose-risposta comportamentale completa utilizzando sonde meccaniche innocue e nocive di varia intensità. Come dimostrano i risultati di questi test comportamentali, le sonde che esercitano una pressione di 200 kilopascal o meno non provocano una risposta avversiva di rotolamento nelle larve di Drosophila. Come previsto, queste sonde meccaniche sottosoglia o non nocive non provocano danni visibili al tessuto neuronale.

Al contrario, le sonde super soglia o nocive suscitano una risposta comportamentale aumentata e danni tissutali ai neuroni sensoriali periferici stessi in modo dose-dipendente. Queste sonde possono essere utilizzate anche per misurare l'ipersensibilità meccanica dopo un infortunio. Circa il 20% delle larve risponde con un rotolamento avversivo già due ore dopo il trattamento UV, mentre il 50% ha risposto quattro ore rispetto agli animali finti irradiati con raggi UV.

Poiché la sonda utilizzata per questa analisi era normalmente sottosoglia di 200 kilopascal, questa risposta è stata considerata un'allodinia meccanica. In punti temporali successivi, la risposta comportamentale delle larve trattate con UV è leggermente aumentata ma non statisticamente diversa da quella del gruppo di controllo irradiato simulato. Le larve sondate con una sonda da 462 kilopascal a quattro, otto e 16 ore dopo il trattamento UV mostrano un aumento significativo della risposta avversiva al rotolamento, con quattro ore che sono il picco dell'ipersensibilità comportamentale poiché lo stimolo era inizialmente nocivo.

La risposta è stata considerata iperalgesia meccanica. La preparazione della sonda e la selezione e la compressione delle larve sono fondamentali per il successo del processo. L'uso di queste sonde ha portato alla nocicezione di base e l'ipersensibilità nocicettiva meccanica può essere misurata dopo la lesione.

Utilizzando questi strumenti e saggi, le basi molecolari e genetiche della nocicezione meccanica e dell'ipersensibilità nocicettiva possono essere misurate nel modello di Drosophila geneticamente trattabile.