Controllo spaziale e temporale di attivazione delle cellule T utilizzando un agonista fuse

Questo protocollo descrive un metodo basato su formazione immagine per attivare i linfociti T usando fuse peptide-MHC, consentendo un controllo preciso spazio-temporale dell'attivazione delle cellule T.

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di descrivere l'uso del peptide fotoattivabile MHC per indurre la segnalazione polarizzata nei linfociti T. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella trasduzione del segnale delle cellule immunitarie, come ad esempio il modo in cui i linfociti trasducono segnali localizzati rapidi e quindi montano risposte cellulari polarizzate a tali segnali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che offre un controllo temporale spaziale della segnalazione delle cellule T.

Lo fa fissando l'ora e la posizione precise dell'attivazione del recettore delle cellule T. A dimostrare la procedura sarà Elisa Sanchez, una studentessa laureata del mio laboratorio. Iniziare aggiungendo la poli-L-lisina biotinilata, o bio-PLL, diluita da uno a 500 in acqua distillata deionizzata in un vetro di copertura a otto pozzetti.

Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare con acqua distillata deionizzata e poi asciugare per due ore a temperatura ambiente. Bloccare le superfici rivestite in bio-PLL con tampone di blocco costituito da soluzione salina tamponata HEPES con il 2% di BSA per 30 minuti a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione, rimuovere il tampone di blocco dalle superfici rivestite in bio-PLL senza lasciare asciugare i pozzetti. Quindi aggiungere la streptavidina e incubare a quattro gradi Celsius. Dopo un'ora, lavare le superfici rivestite in HBS.

Riempire e capovolgere i pozzetti dello scivolo della camera quattro o cinque volte, rimuovendo l'HBS dai pozzetti. Non lasciare asciugare i pozzetti. Aggiungere alle superfici rivestite di bio-PLL i ligandi del complesso maggiore di istocompatibilità del peptide fotoattivabile biotinilato specifico e le molecole di adesione per le cellule T CD4 positive o per le cellule CD8 positive.

Proteggere dalla luce e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare come prima e lasciare in HBS fino al momento della semina. Infine, aggiungere 200.000 cellule T CD4 positive o CD8 positive che esprimono il TCR appropriato nei pozzetti corretti e lasciare che le cellule aderiscano a 37 gradi Celsius per 15 minuti.

Una volta che le cellule si sono attaccate e diffuse sulla superficie, sono pronte per la fotoattivazione e l'imaging. Per l'acquisizione delle immagini è possibile utilizzare un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale invertito dotato di un obiettivo 150X compatibile con i raggi UV. Monitora le sonde in entrambi i canali verde e rosso utilizzando laser di eccitazione a 488 nanometri e 561 nanometri, rispettivamente.

Dopo aver montato il vetrino della camera contenente le cellule T, regolare le impostazioni del microscopio per ottenere l'illuminazione TIRF o a epifluorescenza, se necessario. In modalità Live, selezionare un campo di celle che esprimono le sonde fluorescenti di interesse. Stabilire regioni su scala micron per la fotoattivazione sotto le singole cellule utilizzando il controllo software.

Quindi, inizia l'acquisizione. In genere, sono necessari 80 punti temporali con un intervallo di cinque secondi tra ciascuno. Ciò lascia il tempo per esposizioni sequenziali a 488 nanometri e 563 nanometri nel caso di esperimenti a doppio colore.

Quindi, dopo aver acquisito 10 punti temporali, fotoattivare le regioni selezionate aprendo l'otturatore digitale a diaframma da uno a 1,5 secondi. Al termine del time lapse, selezionare un nuovo campo di celle e ripetere il processo. Iniziare determinando l'intensità della fluorescenza di una regione di fondo al di fuori della cella da utilizzare per la correzione dello sfondo.

Disegna una regione quadrata di dimensioni micron all'esterno della cella e crea una maschera. Per determinare l'intensità della fluorescenza, fare clic su Analizza, Statistiche maschera. Selezionare Intensità di fluorescenza media ed esportare i valori.

Determina l'intensità della fluorescenza all'interno della regione fotoattivata per ogni punto temporale. Seleziona Maschera per evidenziare la regione che è stata fotoattivata. Per determinare l'intensità della fluorescenza, fare clic su Analizza, Statistiche maschera.

Selezionare Intensità di fluorescenza media ed Esporta i valori. Ottieni le coordinate X e Y del centro della regione fotoattivata selezionando Maschera per evidenziare la regione che è stata fotoattivata. Una volta evidenziata la regione di fotoattivazione, selezionare Analizza, Statistiche maschera, Centro area ed Esporta i valori.

Determinare le coordinate X e Y della sonda fluorescente di interesse. Selezionare Tracciamento manuale delle particelle e fare clic sulla sonda fluorescente di interesse nel tempo. Una volta tracciati tutti i punti temporali, selezionare Analizza, Statistiche maschera, Centro area ed Esporta i valori.

Le cellule T sono state attaccate a un vetro di copertura a camera contenente MCC-IEFK fotoattivabile. C1-GFP, una sonda per il secondo messaggero lipidico DAG, è stata ripresa utilizzando la microscopia TIRF e RFP-Tubulina in modalità epifluorescenza. La fotoattivazione localizzata della superficie sotto la cellula T induce l'accumulo di DAG nella zona irradiata.

Questo è seguito in pochi secondi dal riorientamento del centrosoma nella stessa regione. L'accumulo di C1-GFP può essere quantificato calcolando nel tempo l'intensità di fluorescenza normalizzata dopo la correzione dello sfondo al centro della regione fotoattivata. Il riorientamento del centrosoma in risposta alla fotoattivazione può essere quantificato calcolando la distanza tra il centrosoma e il centro della regione fotoattivata in funzione del tempo.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di un giorno se eseguita correttamente. In genere generiamo da 15 a 20 filmati time lapse per l'analisi in questo periodo. Questo approccio ha spianato la strada ai ricercatori per esplorare la cinetica precisa e la polarizzazione dell'attivazione della segnalazione nelle cellule T.

È stato anche adattato per studiare la segnalazione inibitoria nelle cellule natural killer. Di conseguenza, ora abbiamo una migliore comprensione di come le interazioni comunicative tra cellule immunitarie vengono assemblate e dissolte.