Controllo spaziale e temporale di attivazione delle cellule T utilizzando un agonista fuse
April 25th, 2018
Questo protocollo descrive un metodo basato su formazione immagine per attivare i linfociti T usando fuse peptide-MHC, consentendo un controllo preciso spazio-temporale dell'attivazione delle cellule T.
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di descrivere l'uso del peptide fotoattivabile MHC per indurre la segnalazione polarizzata nei linfociti T. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella trasduzione del segnale delle cellule immunitarie, come ad esempio il modo in cui i linfociti trasducono segnali localizzati rapidi e quindi montano risposte cellulari polarizzate a tali segnali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che offre un controllo temporale spaziale della segnalazione delle cellule T.
Lo fa fissando l'ora e la posizione precise dell'attivazione del recettore delle cellule T. A dimostrare la procedura sarà Elisa Sanchez, una studentessa laureata del mio laboratorio. Iniziare aggiungendo la poli-L-lisina biotinilata, o bio-PLL, diluita da uno a 500 in acqua distillata deionizzata in un vetro di copertura a otto pozzetti.
Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare con acqua distillata deionizzata e poi asciugare per due ore a temperatura ambiente. Bloccare le superfici rivestite in bio-PLL con tampone di blocco costituito da soluzione salina tamponata HEPES con il 2% di BSA per 30 minuti a temperatura ambiente.
Dopo l'incubazione, rimuovere il tampone di blocco dalle superfici rivestite in bio-PLL senza lasciare asciugare i pozzetti. Quindi aggiungere la streptavidina e incubare a quattro gradi Celsius. Dopo un'ora, lavare le superfici rivestite in HBS.
Riempire e capovolgere i pozzetti dello scivolo della camera quattro o cinque volte, rimuovendo l'HBS dai pozzetti. Non lasciare asciugare i pozzetti. Aggiungere alle superfici rivestite di bio-PLL i ligandi del complesso maggiore di istocompatibilità del peptide fotoattivabile biotinilato specifico e le molecole di adesione per le cellule T CD4 positive o per le cellule CD8 positive.
Proteggere dalla luce e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare come prima e lasciare in HBS fino al momento della semina. Infine, aggiungere 200.000 cellule T CD4 positive o CD8 positive che esprimono il TCR appropriato nei pozzetti corretti e lasciare che le cellule aderiscano a 37 gradi Celsius per 15 minuti.
Una volta che le cellule si sono attaccate e diffuse sulla superficie, sono pronte per la fotoattivazione e l'imaging. Per l'acquisizione delle immagini è possibile utilizzare un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale invertito dotato di un obiettivo 150X compatibile con i raggi UV. Monitora le sonde in entrambi i canali verde e rosso utilizzando laser di eccitazione a 488 nanometri e 561 nanometri, rispettivamente.
Dopo aver montato il vetrino della camera contenente le cellule T, regolare le impostazioni del microscopio per ottenere l'illuminazione TIRF o a epifluorescenza, se necessario. In modalità Live, selezionare un campo di celle che esprimono le sonde fluorescenti di interesse. Stabilire regioni su scala micron per la fotoattivazione sotto le singole cellule utilizzando il controllo software.
Quindi, inizia l'acquisizione. In genere, sono necessari 80 punti temporali con un intervallo di cinque secondi tra ciascuno. Ciò lascia il tempo per esposizioni sequenziali a 488 nanometri e 563 nanometri nel caso di esperimenti a doppio colore.
Quindi, dopo aver acquisito 10 punti temporali, fotoattivare le regioni selezionate aprendo l'otturatore digitale a diaframma da uno a 1,5 secondi. Al termine del time lapse, selezionare un nuovo campo di celle e ripetere il processo. Iniziare determinando l'intensità della fluorescenza di una regione di fondo al di fuori della cella da utilizzare per la correzione dello sfondo.
Disegna una regione quadrata di dimensioni micron all'esterno della cella e crea una maschera. Per determinare l'intensità della fluorescenza, fare clic su Analizza, Statistiche maschera. Selezionare Intensità di fluorescenza media ed esportare i valori.
Determina l'intensità della fluorescenza all'interno della regione fotoattivata per ogni punto temporale. Seleziona Maschera per evidenziare la regione che è stata fotoattivata. Per determinare l'intensità della fluorescenza, fare clic su Analizza, Statistiche maschera.
Selezionare Intensità di fluorescenza media ed Esporta i valori. Ottieni le coordinate X e Y del centro della regione fotoattivata selezionando Maschera per evidenziare la regione che è stata fotoattivata. Una volta evidenziata la regione di fotoattivazione, selezionare Analizza, Statistiche maschera, Centro area ed Esporta i valori.
Determinare le coordinate X e Y della sonda fluorescente di interesse. Selezionare Tracciamento manuale delle particelle e fare clic sulla sonda fluorescente di interesse nel tempo. Una volta tracciati tutti i punti temporali, selezionare Analizza, Statistiche maschera, Centro area ed Esporta i valori.
Le cellule T sono state attaccate a un vetro di copertura a camera contenente MCC-IEFK fotoattivabile. C1-GFP, una sonda per il secondo messaggero lipidico DAG, è stata ripresa utilizzando la microscopia TIRF e RFP-Tubulina in modalità epifluorescenza. La fotoattivazione localizzata della superficie sotto la cellula T induce l'accumulo di DAG nella zona irradiata.
Questo è seguito in pochi secondi dal riorientamento del centrosoma nella stessa regione. L'accumulo di C1-GFP può essere quantificato calcolando nel tempo l'intensità di fluorescenza normalizzata dopo la correzione dello sfondo al centro della regione fotoattivata. Il riorientamento del centrosoma in risposta alla fotoattivazione può essere quantificato calcolando la distanza tra il centrosoma e il centro della regione fotoattivata in funzione del tempo.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di un giorno se eseguita correttamente. In genere generiamo da 15 a 20 filmati time lapse per l'analisi in questo periodo. Questo approccio ha spianato la strada ai ricercatori per esplorare la cinetica precisa e la polarizzazione dell'attivazione della segnalazione nelle cellule T.
È stato anche adattato per studiare la segnalazione inibitoria nelle cellule natural killer. Di conseguenza, ora abbiamo una migliore comprensione di come le interazioni comunicative tra cellule immunitarie vengono assemblate e dissolte.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo basato sull'imaging per attivare i linfociti T utilizzando peptide-MHC fotoattivabile, consentendo un preciso controllo spazio-temporale dell'attivazione dei linfociti T. Questa tecnica permette ai ricercatori di studiare come i linfociti trasducono segnali localizzati rapidi e innescano risposte cellulari polarizzate.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Immunologia
- Segnalazione cellulare
- Neuroscienze
Sfondo
- Comprendere l'attivazione dei linfociti T è cruciale per la ricerca sulle risposte immunitarie.
- Il peptide-MHC fotoattivabile fornisce un nuovo approccio per studiare la segnalazione dei linfociti T.
- Questo metodo consente l'indagine delle dinamiche spazio-temporali nelle cellule immunitarie.
- La segnalazione polarizzata nei linfociti T è essenziale per risposte immunitarie efficaci.
Obiettivo dello studio
- Descrivere un metodo per indurre una segnalazione polarizzata nei linfociti T.
- Esplorare i meccanismi di trasduzione del segnale localizzato rapido nelle cellule immunitarie.
- Fornire un protocollo dettagliato per i ricercatori per replicare lo studio.
Metodi utilizzati
- Utilizzo di poli-L-lisina biotinilata (bio-PLL) in una camera di copertura in vetro.
- Applicazione di peptide-MHC fotoattivabile per l'attivazione dei linfociti T.
- Tecniche di imaging per monitorare le risposte dei linfociti T.
- Dimostrazione della procedura da parte di uno studente di dottorato.
Risultati principali
- Attivazione con successo dei linfociti T con preciso controllo spaziale.
- Segnalazione polarizzata dimostrata in risposta a stimoli localizzati.
- Fornito approfondimenti sulle dinamiche dell'attivazione del recettore dei linfociti T.
- Consentito ulteriore esplorazione dei percorsi di segnalazione delle cellule immunitarie.
Conclusioni
- Il protocollo offre un prezioso strumento per studiare l'attivazione dei linfociti T.
- Il controllo spazio-temporale migliora la comprensione delle risposte immunitarie.
- Questo metodo può portare a progressi nella ricerca immunologica.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This protocol enables precise spatiotemporal control of T cell receptor activation, addressing a critical need in immunology and immunotherapy research to dissect rapid, polarized signaling events. By linking TCR stimulation to downstream cytoskeletal reorganization, it provides a mechanistic de-risking tool for target validation in T cell–engaging therapies. The approach supports predictive confidence in early discovery by enabling quantitative, high-resolution monitoring of signal transduction dynamics relevant to biologic and small‑molecule immunomodulator development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by enabling localized TCR activation to clarify signaling pathways leading to immunological synapse formation.
- Operational Value: Supports functional target validation through polarized response readouts such as DAG accumulation and centrosome reorientation.
- Predictive Value: Enhances confidence in target selection by revealing kinetic and spatial parameters of signal transduction critical for immunomodulator efficacy.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated T cell–pMHC interaction systems for downstream compound or antibody screening with controlled activation timing.
- Quantitative Outputs: Enables standardized measurement of fluorescence intensity changes in lipid probes (e.g., C1-GFP) and organelle repositioning as functional readouts.
- Scalability & Reuse: Compatible with genetic and pharmacological perturbations, allowing platform reuse across target classes and perturbation strategies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models immunological synapse formation, a key process in T cell–mediated immunity relevant to autoimmune, infectious, and oncology indications.
- Translational Continuity: Bridges early signaling events to functional outcomes, supporting risk-adjusted advancement decisions in preclinical models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies causality between TCR engagement and cytoskeletal polarization, reducing ambiguity in mechanism-of-action studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in target validation and enabling assay development for immunomodulator screening prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating TCR activation as an independent variable to probe downstream signaling nodes and pathway dependencies.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible, light-controlled activation and quantifiable fluorescent readouts compatible with automation-friendly imaging.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (e.g., normalized fluorescence intensity, centrosome displacement) that enable condition comparison and signal dynamics modeling.
- Translational Research: Connects molecular initiation events to cellular polarization, aligning with biomarker-linked functional assays in preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for spatiotemporal control applicable across TCR–pMHC pairs and immune cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in early TCR signaling events.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via precise light-controlled activation and quantifiable TIRF‑based readouts.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of signal fidelity and polarization capacity of immunomodulators.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by linking target engagement to functional synapse formation, a predictor of therapeutic efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in T cell culture, fluorescent probe transfection, and total internal reflection fluorescence microscopy.
- Depends on UV-compatible optics, photoactivatable pMHC reagents, and dual‑color imaging infrastructure.
- Necessitates standardization of photoactivation timing, region selection, and background correction across users and sites.
- Involves adaptation considerations for different TCR specificities, fluorescent probes, and immune cell subtypes (e.g., NK cells).
- Practical limitations include phototoxicity risks from UV exposure and the need for rapid image acquisition to capture subsecond signaling dynamics.
