Controllo spaziale e temporale di attivazione delle cellule T utilizzando un agonista fuse
25 aprile 2018
Questo protocollo descrive un metodo basato su formazione immagine per attivare i linfociti T usando fuse peptide-MHC, consentendo un controllo preciso spazio-temporale dell'attivazione delle cellule T.
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di descrivere l'uso del peptide fotoattivabile MHC per indurre la segnalazione polarizzata nei linfociti T. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella trasduzione del segnale delle cellule immunitarie, come ad esempio il modo in cui i linfociti trasducono segnali localizzati rapidi e quindi montano risposte cellulari polarizzate a tali segnali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che offre un controllo temporale spaziale della segnalazione delle cellule T.
Lo fa fissando l'ora e la posizione precise dell'attivazione del recettore delle cellule T. A dimostrare la procedura sarà Elisa Sanchez, una studentessa laureata del mio laboratorio. Iniziare aggiungendo la poli-L-lisina biotinilata, o bio-PLL, diluita da uno a 500 in acqua distillata deionizzata in un vetro di copertura a otto pozzetti.
Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare con acqua distillata deionizzata e poi asciugare per due ore a temperatura ambiente. Bloccare le superfici rivestite in bio-PLL con tampone di blocco costituito da soluzione salina tamponata HEPES con il 2% di BSA per 30 minuti a temperatura ambiente.
Dopo l'incubazione, rimuovere il tampone di blocco dalle superfici rivestite in bio-PLL senza lasciare asciugare i pozzetti. Quindi aggiungere la streptavidina e incubare a quattro gradi Celsius. Dopo un'ora, lavare le superfici rivestite in HBS.
Riempire e capovolgere i pozzetti dello scivolo della camera quattro o cinque volte, rimuovendo l'HBS dai pozzetti. Non lasciare asciugare i pozzetti. Aggiungere alle superfici rivestite di bio-PLL i ligandi del complesso maggiore di istocompatibilità del peptide fotoattivabile biotinilato specifico e le molecole di adesione per le cellule T CD4 positive o per le cellule CD8 positive.
Proteggere dalla luce e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare come prima e lasciare in HBS fino al momento della semina. Infine, aggiungere 200.000 cellule T CD4 positive o CD8 positive che esprimono il TCR appropriato nei pozzetti corretti e lasciare che le cellule aderiscano a 37 gradi Celsius per 15 minuti.
Una volta che le cellule si sono attaccate e diffuse sulla superficie, sono pronte per la fotoattivazione e l'imaging. Per l'acquisizione delle immagini è possibile utilizzare un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale invertito dotato di un obiettivo 150X compatibile con i raggi UV. Monitora le sonde in entrambi i canali verde e rosso utilizzando laser di eccitazione a 488 nanometri e 561 nanometri, rispettivamente.
Dopo aver montato il vetrino della camera contenente le cellule T, regolare le impostazioni del microscopio per ottenere l'illuminazione TIRF o a epifluorescenza, se necessario. In modalità Live, selezionare un campo di celle che esprimono le sonde fluorescenti di interesse. Stabilire regioni su scala micron per la fotoattivazione sotto le singole cellule utilizzando il controllo software.
Quindi, inizia l'acquisizione. In genere, sono necessari 80 punti temporali con un intervallo di cinque secondi tra ciascuno. Ciò lascia il tempo per esposizioni sequenziali a 488 nanometri e 563 nanometri nel caso di esperimenti a doppio colore.
Quindi, dopo aver acquisito 10 punti temporali, fotoattivare le regioni selezionate aprendo l'otturatore digitale a diaframma da uno a 1,5 secondi. Al termine del time lapse, selezionare un nuovo campo di celle e ripetere il processo. Iniziare determinando l'intensità della fluorescenza di una regione di fondo al di fuori della cella da utilizzare per la correzione dello sfondo.
Disegna una regione quadrata di dimensioni micron all'esterno della cella e crea una maschera. Per determinare l'intensità della fluorescenza, fare clic su Analizza, Statistiche maschera. Selezionare Intensità di fluorescenza media ed esportare i valori.
Determina l'intensità della fluorescenza all'interno della regione fotoattivata per ogni punto temporale. Seleziona Maschera per evidenziare la regione che è stata fotoattivata. Per determinare l'intensità della fluorescenza, fare clic su Analizza, Statistiche maschera.
Selezionare Intensità di fluorescenza media ed Esporta i valori. Ottieni le coordinate X e Y del centro della regione fotoattivata selezionando Maschera per evidenziare la regione che è stata fotoattivata. Una volta evidenziata la regione di fotoattivazione, selezionare Analizza, Statistiche maschera, Centro area ed Esporta i valori.
Determinare le coordinate X e Y della sonda fluorescente di interesse. Selezionare Tracciamento manuale delle particelle e fare clic sulla sonda fluorescente di interesse nel tempo. Una volta tracciati tutti i punti temporali, selezionare Analizza, Statistiche maschera, Centro area ed Esporta i valori.
Le cellule T sono state attaccate a un vetro di copertura a camera contenente MCC-IEFK fotoattivabile. C1-GFP, una sonda per il secondo messaggero lipidico DAG, è stata ripresa utilizzando la microscopia TIRF e RFP-Tubulina in modalità epifluorescenza. La fotoattivazione localizzata della superficie sotto la cellula T induce l'accumulo di DAG nella zona irradiata.
Questo è seguito in pochi secondi dal riorientamento del centrosoma nella stessa regione. L'accumulo di C1-GFP può essere quantificato calcolando nel tempo l'intensità di fluorescenza normalizzata dopo la correzione dello sfondo al centro della regione fotoattivata. Il riorientamento del centrosoma in risposta alla fotoattivazione può essere quantificato calcolando la distanza tra il centrosoma e il centro della regione fotoattivata in funzione del tempo.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di un giorno se eseguita correttamente. In genere generiamo da 15 a 20 filmati time lapse per l'analisi in questo periodo. Questo approccio ha spianato la strada ai ricercatori per esplorare la cinetica precisa e la polarizzazione dell'attivazione della segnalazione nelle cellule T.
È stato anche adattato per studiare la segnalazione inibitoria nelle cellule natural killer. Di conseguenza, ora abbiamo una migliore comprensione di come le interazioni comunicative tra cellule immunitarie vengono assemblate e dissolte.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo basato sull'imaging per attivare i linfociti T mediante peptidi-MHC fotoattivabili, consentendo un controllo spaziotemporale preciso dell'attivazione dei linfociti T. Questa tecnica permette ai ricercatori di studiare come i linfociti trasducono segnali localizzati rapidi e attivano risposte cellulari polarizzate.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Immunologia
- Comunicazione cellulare
- Neuroscienze
Sfondo
- Comprendere l'attivazione dei linfociti T è fondamentale per la ricerca sulle risposte immunitarie.
- Il peptide-MHC fotoattivabile offre un approccio innovativo per lo studio della trasduzione del segnale nei linfociti T.
- Questo metodo consente di indagare la dinamica spaziotemporale nelle cellule immunitarie.
- La segnalazione polarizzata nei linfociti T è essenziale per risposte immunitarie efficaci.
Scopo dello studio
- Descrivere un metodo per indurre un segnale polarizzato nei linfociti T.
- Esplorare i meccanismi della trasduzione del segnale localizzata e rapida nelle cellule immunitarie.
- Fornire un protocollo dettagliato affinché i ricercatori possano replicare lo studio.
Metodi Utilizzati
- Uso di poli-L-lisina biotinilata (bio-PLL) su vetrini con camera.
- Applicazione del peptide-MHC fotoattivabile per l'attivazione dei linfociti T.
- Tecniche di imaging per monitorare le risposte dei linfociti T.
- Dimostrazione della procedura da parte di uno studente laureato.
Risultati principali
- Attivazione riuscita dei linfociti T con controllo spaziale preciso.
- Dimostrazione di segnalazione polarizzata in risposta a stimoli localizzati.
- Forniti spunti sulle dinamiche dell'attivazione del recettore dei linfociti T.
- Consentito un'ulteriore esplorazione delle vie di segnalazione delle cellule immunitarie.
Conclusioni
- Il protocollo offre uno strumento prezioso per lo studio dell'attivazione dei linfociti T.
- Il controllo spaziotemporale migliora la comprensione delle risposte immunitarie.
- Questo metodo può portare a progressi nella ricerca immunologica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
Questo protocollo consente un controllo preciso spazio-temporale dell'attivazione del recettore delle cellule T, rispondendo a un'esigenza fondamentale nella ricerca immunologica e nell'immunoterapia, finalizzata a scomporre eventi di segnalazione rapidi e polarizzati. Collegando la stimolazione del TCR alla riorganizzazione citoscheletrica a valle, fornisce uno strumento meccanicistico per la riduzione del rischio nella validazione degli obiettivi terapeutici che coinvolgono le cellule T. L'approccio supporta una maggiore affidabilità predittiva nelle fasi iniziali della scoperta, permettendo un monitoraggio quantitativo ad alta risoluzione della dinamica della trasduzione del segnale, rilevante per lo sviluppo di immunomodulatori biologici e di piccole molecole.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche consentendo l'attivazione localizzata del TCR per chiarire le vie di segnalazione che portano alla formazione della sinapsi immunologica.
- Valore operativo: Favorisce la validazione funzionale del bersaglio mediante letture di risposte polarizzate, come l'accumulo di DAG e il riposizionamento del centrosoma.
- Valore predittivo: Aumenta la fiducia nella selezione del bersaglio rivelando parametri cinetici e spaziali della trasduzione del segnale, fondamentali per l'efficacia degli immunomodulatori.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi validati di interazione tra linfociti T e pMHC per lo screening di composti o anticorpi successivi, con temporizzazione controllata dell'attivazione.
- Output quantitativi: Permette la misurazione standardizzata delle variazioni di intensità di fluorescenza nei sonde lipidiche (ad esempio, C1-GFP) e nel riposizionamento degli organelli come letture funzionali.
- Scalabilità e riutilizzabilità: Compatibile con perturbazioni genetiche e farmacologiche, consente il riutilizzo della piattaforma attraverso diverse classi di bersagli e strategie di perturbazione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Modella la formazione della sinapsi immunologica, un processo chiave nell'immunità mediata dai linfociti T, rilevante per indicazioni autoimmuni, infettive e oncologiche.
- Continuità traslazionale: Collega gli eventi di segnalazione iniziali agli esiti funzionali, supportando decisioni di avanzamento con rischio calibrato nei modelli preclinici.
- De-risking meccanicistico: Chiarisce la causalità tra l'attivazione del recettore dei linfociti T (TCR) e la polarizzazione del citoscheletro, riducendo l'ambiguità negli studi sul meccanismo d'azione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, supportando la verifica delle ipotesi nella validazione del bersaglio e consentendo lo sviluppo di saggi per lo screening di immunomodulatori prima dell'identificazione del capostazione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi isolando l'attivazione del TCR come variabile indipendente per analizzare i nodi di segnalazione a valle e le dipendenze tra percorsi.
- Screening: Garantisce prontezza del saggio mediante attivazione riproducibile controllata dalla luce e letture fluorescenti quantificabili, compatibili con imaging adatto all'automazione.
- Analisi: Produce misurazioni quantitative di variabili dipendenti (ad esempio, intensità di fluorescenza normalizzata, spostamento del centrosoma) che permettono il confronto tra condizioni e la modellizzazione della dinamica del segnale.
- Ricerca traslazionale: Collega eventi molecolari iniziali alla polarizzazione cellulare, in linea con saggi funzionali associati a biomarcatori nella validazione preclinica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di imaging riutilizzabile per il controllo spaziotemporale, applicabile a diverse coppie TCR–pMHC e tipi di cellule immunitarie.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica negli eventi iniziali della segnalazione del TCR.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità mediante un'attivazione controllata dalla luce precisa e letture quantificabili basate su TIRF.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento o interruzione dello sviluppo consentendo una valutazione precoce della fedeltà del segnale e della capacità di polarizzazione degli immunomodulatori.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sulla gestione del rischio collegando l'interazione con l'obiettivo alla formazione della sinapsi funzionale, un indicatore dell'efficacia terapeutica.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di cellule T, nella trasfezione di sonde fluorescenti e nella microscopia a fluorescenza con riflessione totale interna.
- Richiede ottiche compatibili con l'UV, reagenti pMHC fotoattivabili e un'infrastruttura per l'acquisizione di immagini a doppio colore.
- Necessita di standardizzazione dei tempi di fotoattivazione, della selezione delle regioni e della correzione del fondo tra diversi utenti e sedi.
- Comporta considerazioni di adattamento per diverse specificità del TCR, sonde fluorescenti e sottotipi di cellule immunitarie (ad esempio, cellule NK).
- I limiti pratici includono i rischi di fototossicità derivanti dall'esposizione all'UV e la necessità di un'acquisizione rapida delle immagini per catturare dinamiche di segnalazione sub-secondo.
