Name: Controllo spaziale e temporale di attivazione delle cellule T utilizzando un agonista fuse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Impara a controllare spazialmente e temporalmente l'attivazione delle cellule T utilizzando un agonista fotoattivabile. Questo metodo consente di indurre segnalazione polarizzata nei linfociti T e studiare la trasduzione dei segnali localizzati.

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Ringraziamo i membri del laboratorio Huse per consulenza e assistenza. Supportato da l'US National Institutes of Health (R01-AI087644 di M.H.) e P30-CA008748 al Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.

1. preparazione delle superfici di vetro stimolatore
<ol><li>Coprioggetto cappotto otto pozzetti camerata con biotinilati poli-L-lisina (Bio-PLL) diluito 1: 500 in acqua distillata e deionizzata (ddH2O). Incubare per 30 min a temperatura ambiente (TA).</li>
	<li>Lavare con H2O.</li>
	<li>A secco per 2 h a RT.</li>
	<li>Blocco di Bio-PLL rivestito superfici con tampone bloccante (tamponata HEPES salino [10 mM HEPES a pH 7.4, 150 mM NaCl], con 2% BSA) per 30 minuti a TA.<ol>
<li>Sciogliere 5 mg di poli-L-lisina hydrobromide in 1 mL di 10 mM NaPO4, pH 8.5.</li>
		<li>Aggiungere 125 μmol (0,55 mg) di NHS-biotina (da uno stock di 100 mg/mL in DMSO) e controllare il pH della reazione. Se il pH è inferiore a 8,5, aggiungere 2 μL di 4 N NaOH per elevarlo a tra pH 8.5 e 9.5.</li>
		<li>Vortexare per 30 min.</li>
		<li>Placare la reazione con 50 µ l di 100 mM glicina disciolta in 20 millimetri Tris pH 8.0.</li>
		<li>Gira alla massima potenza per 10 min e trasferire il surnatante in una nuova provetta. Nota: Qualità Bio-PLL è in genere rispetto al precedente preparazioni del rivestimento diluizioni seriali del materiale su una piastra a 96 pozzetti ELISA e quantificare il contenuto in biotina dopo incubazione con fosfatasi alcalina accoppiato streptavidina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere il tampone di bloccaggio. Non lasciare asciugare pozzetti. Aggiungere streptavidina (100 µ g/mL in tampone bloccante). Incubare per 1 h a 4 ° C.</li>
	<li>Lavare HBS. Riempire e invertire pozzi diapositiva camera 4 - 5 volte, rimozione di HBS dai pozzi. Non lasciare asciugare pozzetti.</li>
	<li>Aggiungere il biotinilati pMHC ligandi e molecole di adesione alla superficie. Nota: MCC e ovuli possono essere photocaged con l'aggiunta di ortho-nitrobenzyl basato su gruppi di protezione (ad es., nitrophenylethyl (NPE) o nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) per il gruppo ε-amminico di Lisine chiave (K12 in MCC, K7 in ovuli). Photocaged MCC e ovuli possono essere ottenuti da produttori commerciali. Dopo la ricostituzione in tampone acquoso, essi sono ripiegati in batterico espressa-Ek e H2-Kb utilizzando gli approcci stabiliti11,12.</li>
	<li>Convalida del peptide MCC o ovuli fuse<ol>
<li>Decage peptidi NVOC protetto UV irradiando con una lampada UV portatile (Vedi Tabella materiali) per 20 minuti a TA.</li>
		<li>Torio impulso 1.0 x 105 APC con 1 µM del peptide nonstimulatory (controllo negativo, ad esempio Hb), fuse peptide, peptide irradiati fuse e peptide agonista (controllo positivo, per esempio, MCC) per 1 h a durante la notte a 37 ° C.</li>
		<li>Per stimolare le cellule T che esprimono il 5C. C7/2B4/AND TCR, utilizzare celle CH12 o CH27 B. Per stimolare le cellule T OT1, utilizzare EL4 thymoma cellule o RMA-s.</li>
		<li>Mescolare le APCs pulsato con un numero uguale di cellule T nel 96 pozzetti tondo piastre inferiori ad un volume finale di 200 µ l. Incubare a 37 ° C per 12-24 h.</li>
		<li>Recuperare i surnatanti da ciascun pozzetto e analizzare il-2 da ELISA con rilevazione colorimetrica di streptavidina-rafano perossidasi. Nota: Conferma dello status ingabbiamento di tutti i peptidi mediante spettrometria di massa electrospray prima del ripiegamento in complessi MHC, è fortemente raccomandato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire la piegatura e la purificazione di MHC in modo da minimizzare l'esposizione alla luce. Ad esempio, avvolgere pieghevole reazioni nella carta stagnola e svolgere cromatografia di gel filtrazione con la lampada UV. Nota: È stato trovato quel fuse MCC-I-Ek e OVA - H2-Kb indurre attivazione indipendente delle cellule di T UV ad alta densità, probabilmente a causa di ingabbiamento funzionale incompleta. Quindi, il pMHC di fuse è diluito in un eccesso di x di 10-30 di nonstimulatory pMHC (per esempio -Ek contenente il peptide di64-76 di emoglobina (Hb)) durante la fase di immobilizzazione. Questo migliora il rapporto segnale-rumore del successivo esperimento di formazione immagine.</li>
	<li>A photoactivate CD4+ T cellule, collettivamente utilizzare una miscela di biotinylated Hb-I-Ek (3 µ g/mL), biotinylated fuse MCC-I-Ek (0.1 µ g/mL) e anticorpi biotinilati contro la classe I di MHC H2-Kk (0,5 µ g / mL). incoraggia l'anticorpo anti-H2-Kk 5 C. C7/2B4/AND T cellule, che esprimono H2-Kk, di diffondere sulla superficie di vetro senza in fase di attivazione.</li>
	<li>Per CD8+ T cellule, utilizzare una miscela di biotinylated H2-Db recanti il peptide KAVYDFATL (1 µ g/mL), fuse biotinilati OVA-H2-Kb (0,1 µ g/mL) e il dominio extracellulare della molecola di adesione ICAM-1 (2 µ g/mL prodotto da cellule di insetto cultura13). L'ICAM-1 incoraggia stretto contatto formazione coinvolgendo l'integrina LFA1 sulla superficie delle cellule T.</li>
	<li>Applicare tutte le miscele della proteina in tampone bloccante, seguita da incubazione per 1h a RT o almeno 2 ore a 4 ° C. Nota: La densità molecolare su superfici di questo tipo per essere ~ 8000 a µm2 è stata determinata in precedenza6. Dato che fuse pMHC rappresenta ~1/30th della proteina biotinilato sulla superficie, la sua densità sarà ~ 267 molecole al µm2, prima del decaging.</li>
	<li>Lavare come al punto 1.6 e lasciare in HBS fino all'uso.</li>
	<li>Aggiungere 200.000 CD4+ o CD8+ T cellule che esprimono TCR appropriato in ogni pozzetto e permettono alle cellule di aderire a 37 ° C per 15 min. Una volta che le cellule hanno attaccato al e distribuire sulla superficie, sono pronti per fotoattivazione e imaging. Nota: Retroviral trasduzione di cellule T effettrici con imaging sonde fluorescenti è descritto in dettaglio altrove6,7. Segnalazione del calcio possono essere studiate anche utilizzando cellule di T untransduced caricate con il colorante sensibile del calcio Fluo-46. Il colorante raziometrici Fura-2 non è raccomandato perché richiede eccitazione nella gamma UV, che induce anche la decaging della pMHC di fuse.</li>
</ol>2. acquisizione immagini
<ol><li>Usare un microscopio rovesciato di TIRF provvisti di un UV compatibile 150 X obiettivo obiettivo per acquisizione di immagini. UV irradiare regioni definite dall'utente utilizzando un sistema a membrana digitale collegato ad una lampada a mercurio 100 W (HBO). Diretta UV luce da questa lampada sul campione utilizzando un mirror di passaggio lungo 400 nm.</li>
	<li>Utilizzare software di analisi di immagine per fotoattivazione localizzata e l'acquisizione di time-lapse. Nella maggior parte degli esperimenti, monitorare le sonde in entrambi i canali, verde e rossi, utilizzando 488 nm e laser di eccitazione 561 nm, rispettivamente. Luce laser è diretto sul campione utilizzando uno specchio dicroico dual-banda passante che trasmette anche nella gamma UV (per abilitare decaging). Per ulteriori informazioni sulla configurazione del microscopio, vedere la Tabella dei materiali e la Figura 6 .</li>
	<li>Dopo aver montato la diapositiva di camera che contiene le cellule di T, regolare le impostazioni per ottenere illuminazione TIRF o epifluorescenza, come necessario. In modalità live, selezionare un campo di cellule che esprimono il sonde fluorescenti di interesse. Stabilire regioni di micron-scala per fotoattivazione sotto singole celle utilizzando software di controllo.</li>
	<li>Iniziare l'acquisizione di time-lapse. In genere, 80 punti temporali vengono acquisiti, con un intervallo di 5 s tra ogni punto del tempo. Questo lascia più di abbastanza tempo per sequenziale 488 nm e 563 nm esposizioni, nel caso di esperimenti di doppio colore.</li>
	<li>Dopo 10 punti temporali, photoactivate le regioni selezionate aprendo il diaframma digitale dell'otturatore per 1-1,5 s.</li>
	<li>Dopo aver completato il lasso di tempo, selezionare un nuovo campo di cellule e ripetere il processo.</li>
</ol>3. analisi dei dati
Nota: Localizzata fotoattivazione di ligandi immobilizzati crea una regione ben definita, stazionaria stimolatore che può essere utilizzata per l'analisi quantitativa di segnalazione eventi rimodellamento del citoscheletro e risposte. Analisi protocolli tipicamente coinvolgono o quantificare l'intensità di fluorescenza all'interno della regione irradiata o utilizzando la regione irradiata come endpoint posizionale per misurazioni della distanza (ad es. per la valutazione della polarizzazione del centrosoma per la irradiati regione). Entrambi i protocolli di analisi sono descritti di seguito. Vari programmi di analisi di immagine interattiva consente di rendere intensità e misurazioni della distanza, che possono poi essere uscita per ulteriore elaborazione e analisi.
<ol><li>
Intensità di fluorescenza
	<ol>
<li>Determinare l'intensità di fluorescenza (FI) di una regione di sfondo all'esterno della cella (FIb). Verrà utilizzato per la correzione di fondo.<ol>
<li>Disegnare un'area quadrata micron imprese fuori della cellula e fare una maschera. Per determinare l'intensità di fluorescenza, fare clic su Analyze | Mascherare le statistiche. Selezionare Media intensità di fluorescenza ed esportare i valori. Nota: Dettagli procedurali (ad es. 3.1.1.1) fare riferimento al software Slidebook (Vedi Tabella materiali). Attuazione del presente protocollo utilizzando altri pacchetti software (ad es., FIJI) sarà leggermente diverso.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Determinare il FI all'interno della regione di fotoattivazione per ciascun punto di tempo.<ol>
<li>Selezionare maschera per evidenziare la regione che era fotoattivazione. Per determinare l'intensità di fluorescenza, fare clic su Analyze | Mascherare le statistiche. Selezionare Media intensità di fluorescenza ed esportare i valori.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sottrarre lo sfondo FI dai valori misurati FI all'interno della regione. Quindi, normalizzare le misure FI corrette dividendo per la media, sfondo corretto FI dei primi 9 fotogrammi prima di fotoattivazione. ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)). Nota: Il grafico ΔF/F in funzione del tempo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Distanza
	<ol>
<li>Ottenere la x e y le coordinate del centro della regione di fotoattivazione.<ol>
<li>Per determinare gli assi x e y le coordinate del centro della regione fotoattivazione, selezionare maschera per evidenziare la regione che era fotoattivazione. Una volta evidenziata la regione di fotoattivazione, selezionare Analyze | Mascherare le statistiche | Centro della zona ed esportare i valori.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Determinare gli assi x e y coordinate per la sonda fluorescente di interesse per ogni punto di tempo. Questo è tipicamente realizzato attraverso manuali o automatizzate delle particelle di rilevamento.<ol>
<li>Per determinare gli assi x e y coordinate della sonda fluorescente di interesse, selezionare Manuale Particle Tracking e cliccare sulla sonda fluorescente di interesse nel corso del tempo. Una volta che sono stati monitorati tutti i punti di tempo, selezionare Analyze | Mascherare le statistiche | Centro della zona ed esportare i valori.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Calcolare la distanza tra la proteina fluorescente di interesse e il centro della regione di fotoattivazione per ciascun punto di tempo usando l'equazione: distanza = √ ((x2x -1)2+ (y2y -1)2), in cui x2 e y2 sono le coordinate della proteina fluorescente di interesse e x1 e1 di y sono le coordinate del centro della regione di fotoattivazione.</li>
		<li>Grafico della distanza in funzione del tempo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Negli ultimi anni, la luce è emerso come un ottimo strumento per l'attivazione spatiotemporally controllata dei processi cellulari. Sono state sviluppate varie metodologie, ciascuno con associati vantaggi e svantaggi. Il sistema descritto qui, che è basato su decaging di ligandi extracellulari, immobilizzati, è ideale per l'analisi delle risposte di segnalazione rapide, subcellulare, polarizzate. Questo approccio è stato applicato per esaminare è formazione in cellule di T, come descritto in precedenza. Inoltre, sono sta...

Linfociti T (cellule T) gioca un ruolo centrale nell'immunità cellulare riconoscendo peptidi antigenici visualizzate nel contesto della superficie cellulare MHC. Riconoscimento dell'antigene, che è mediata dal TCR, spinge la differenziazione delle cellule T naive e promuove la consegna delle risposte citolitiche e comunicative di effettori. Impegno di TCR inoltre induce cambiamenti drammatici nell'architettura cellulare. In pochi minuti, le cellule T gloms sul lato della cella presentanti l'antigene (APC), formando un'interfaccia polarizzata, conosciuta come la sinapsi immunologica (IS)1,2. L'IS rafforza le risposte delle cellule T effettrici abilitando il direzionale rilascio di citochine o, nel caso dei linfociti T citotossici (CTL), proteine litiche che distruggono l'APC.
Impegno di TCR di pMHC induce la fosforilazione rapida di più molecole di adattatore a valle, compreso il Linker per le celle di attivazione di T (LAT), che in definitiva promuove robusto rimodellamento del citoscheletro sinaptica2. Corticale actina filamentosa (F-actina) unità delle cellule di T di diffusione sopra la superficie APC e poi si risolve in una struttura anulare caratterizzata da accumulo di F-actina alla periferia IS e svuotamento dal centro. Formazione di anello di F-actina è strettamente per il riorientamento del centro organizzatore dei microtubuli (MTOC, chiamato anche il centrosoma in cellule di T) ad una posizione appena sotto il centro dell'interfaccia. Entrambi gli eventi si verificano all'interno di minuti di riconoscimento iniziale dell'antigene e stabilire il contesto architettonico in cui gli eventi di attivazione successiva ed effettrici si ottiene una risposta.
Per studiare la formazione di IS, vari laboratori hanno sviluppato approcci in cui la APC è sostituito da una superficie di vetro che contiene immobilizzato TCR ligandi o supporta un bilayer del lipido che a sua volta contiene i ligandi3,4. T cellule formano IS-come contatti su queste superfici che possono essere imaged di microscopio a fluorescenza riflessione interna totale (TIRF) o microscopia confocale, permettendo studi ad alta risoluzione di attivazione delle cellule T iniziale e la formazione di IS.
Sebbene questi approcci hanno permesso per visualizzazione eccellente del è completamente assemblato, gran parte della legatura TCR:pMHC seguente segnalazione si verifica in pochi secondi, che complica gli sforzi per determinare la sequenza degli eventi che seguono l'attivazione TCR con precisione . Per ovviare a questo problema, è stato sviluppato un approccio di fotoattivazione, in cui fuse pMHC viene utilizzato per realizzare il controllo spazio-temporale di TCR attivazione5,6,7. In questo sistema, le cellule T sono attaccate alle superfici di vetro contenente pMHC di fuse che è non-stimolatori per il TCR, fino a quando irradiato con luce ultravioletta (UV). Irradiazione UV di una regione di graduate micron della superficie sotto la cellula T rimuove il photocage creando una zona di stimolatorio che possa essere riconosciuta dalle cellule T. Eventi successivi di segnalazione e il rimodellamento del citoscheletro sono quindi monitorati utilizzando reporter fluorescenti geneticamente codificato. Due versioni di fuse di peptidi antigenici, lepidottero del citocromo c88-103 (MCC) e ovoalbumina257-264 (OVA), che vengono presentati nel contesto della classe II MHC-Ek e la classe I di MHC H2-Kb, rispettivamente, sono stati sviluppato (Figura 1). Questo permette l'analisi di entrambi CD4+ T cellule specifiche per MCC-I-Ek (esprimendo il 5 C. C7, 2B4, o AND TCR) e CD8+ T cellule specifiche per OVA-H2-Kb (che esprimono TCR OT1).
Nell'ultimo decennio, l'approccio di fotoattivazione e formazione immagine di TCR è stata utilizzata per stabilire la precisa cinetica di TCR primi passi di segnalazione e anche per identificare i meccanismi molecolari che regolano polarizzata in rimodellamento del citoscheletro5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10. ad esempio, il dosaggio è stato strumentale nel determinare tale centrosoma riorientamento verso l'APC è mediato da una sfumatura localizzata del lipido secondo messaggero diacilglicerolo centrato presso l'IS. Si prevede che questa metodologia continuerà ad essere prezioso per applicazioni che richiedono analisi di imaging ad alta risoluzione della funzione delle cellule T.

<table><tbody><tr><td>Nunc Lab-Tek Coverglass camerato</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>Idrobromuro di poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td>Dovrà produrre poli-L-lisina biotinilata</td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-Biotin</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>20217</td><td>Dovrà produrre poli-L-lisina streptavidina biotinilata</td></tr><tr><td></td><td>Thermofischer Scientific</td><td>434301</td><td></td></tr><tr><td>BirA-500: Kit di reazione standard BirA biotina-proteina ligasi</td><td>Avidity</td><td>BirA500</td><td>Sarà utilizzato per biotinilare le proteine</td></tr><tr><td>Hb biotinilato I-EK&nbsp; </td><td></td><td></td><td>Per il ripiegamento delle proteine, vedere il riferimento 6. Per la biotinilazione, utilizzare il kit BirA</td></tr><tr><td>Biotinilato NPE-MCC I-EK&nbsp; </td><td>Anaspec</td><td></td><td>Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) può essere acquistato da Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinilated &alpha; Anticorpo H2-Kk</td><td>BD Biosciences</td><td>553591</td><td></td></tr><tr><td>NPE-OVA biotinilato H2-Kb</td><td>Anaspec</td><td></td><td>Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) può essere acquistato da Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinilato KAVY H2-Db&nbsp;</td><td>La</td><td>proteina sintetizzata personalizzata Anaspec (KAVYDFATL) può essere acquistata da Anaspec</td>Biotinilated ICAM1&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Per il ripiegamento delle proteine, vedere il riferimento nel protocollo. Per la biotinilazione, utilizzare il kit BirA</td></tr><tr><td>Lampada UV portatile</td><td>UVP</td><td>UVGL-25</td><td>La lampada è tenuta a < 1 cm dal campione.&nbsp; 30 s di luce 365 sono sufficienti per il decaggio rilevabile, 20 minuti per il decaggio quantitativo.</td></tr><tr><td>Sistema Olympus IX-81 OMAC TIRF.</td><td>Olympus</td><td></td><td>Ulteriori informazioni sul sistema di imaging sono disponibili in Figura 6</td></tr><tr><td>Diaframma digitale a mosaico</td><td>Software Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook</td><td>Innovazioni</td><td></td><td></td> di imaging intelligente</tr></tbody></table>

controllo spaziale e temporale di attivazione delle cellule t utilizzando un agonista fuse

Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

Linfociti T impegnano nella segnalazione rapida, polarizzati, che si verificano pochi minuti dopo l'attivazione del TCR. Ciò induce la formazione di sinapsi immunologica, una giunzione cellulare stereotipato che regola l'attivazione delle cellule T e direzionalmente gli obiettivi le risposte effettrici. Per studiare questi processi in modo efficace, è necessario un approccio imaging che è su misura per catturare le risposte veloci, polarizzate. Questo protocollo descrive tale sistema, che si basa su un fuse peptide-major istocompatibilità (pMHC) che è non-stimolatore fino a quando è esposto a luce ultravioletta. Decaging mirati di questo reagente durante gli esperimenti di videomicroscopia consente controllo preciso spazio-temporale dell'attivazione di TCR e monitoraggio ad alta risoluzione delle successive risposte cellulari di riflessione interna totale (TIRF) imaging. Questo approccio è anche compatibile con le strategie di perturbazione genetici e farmacologici. In questo modo per il montaggio delle vie molecolari ben definite che collegano TCR segnalazione alla formazione delle strutture citoscheletriche polarizzate che sottendono la sinapsi immunologica.

L'approccio di fotoattivazione e imaging consente per l'osservazione e facile quantificazione delle risposte di segnalazione rapide, polarizzate. Per illustrare le sue capacità, riprodotta qui è un esperimento esaminando la spatiotemporal correlazione tra accumulo di TCR-indotta DAG e centrosoma riorientamento. 5 C. Gli scoppi di cella C7 T retrovirally sono state trasdotte con due reporter fluorescenti: un biosensore DAG contenente i domini di C1 tandem da chinasi di proteina C-θ collega...

Questo protocollo descrive un metodo basato su formazione immagine per attivare i linfociti T usando fuse peptide-MHC, consentendo un controllo preciso spazio-temporale dell'attivazione delle cellule T.

Controllo spaziale e temporale di attivazione delle cellule T utilizzando un agonista fuse

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di descrivere l'uso del peptide fotoattivabile MHC per indurre la segnalazione polarizzata nei linfociti T. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella trasduzione del segnale delle cellule immunitarie, come ad esempio il modo in cui i linfociti trasducono segnali localizzati rapidi e quindi montano risposte cellulari polarizzate a tali segnali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che offre un controllo temporale spaziale della segnalazione delle cellule T.Lo fa fissando l'ora e la posizione precise dell'attivazione del recettore delle cellule T. A dimostrare la procedura sarà Elisa Sanchez, una studentessa laureata del mio laboratorio. Iniziare aggiungendo la poli-L-lisina biotinilata, o bio-PLL, diluita da uno a 500 in acqua distillata deionizzata in un vetro di copertura a otto pozzetti.Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare con acqua distillata deionizzata e poi asciugare per due ore a temperatura ambiente. Bloccare le superfici rivestite in bio-PLL con tampone di blocco costituito da soluzione salina tamponata HEPES con il 2% di BSA per 30 minuti a temperatura ambiente.Dopo l'incubazione, rimuovere il tampone di blocco dalle superfici rivestite in bio-PLL senza lasciare asciugare i pozzetti. Quindi aggiungere la streptavidina e incubare a quattro gradi Celsius. Dopo un'ora, lavare le superfici rivestite in HBS.Riempire e capovolgere i pozzetti dello scivolo della camera quattro o cinque volte, rimuovendo l'HBS dai pozzetti. Non lasciare asciugare i pozzetti. Aggiungere alle superfici rivestite di bio-PLL i ligandi del complesso maggiore di istocompatibilità del peptide fotoattivabile biotinilato specifico e le molecole di adesione per le cellule T CD4 positive o per le cellule CD8 positive.Proteggere dalla luce e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare come prima e lasciare in HBS fino al momento della semina. Infine, aggiungere 200.000 cellule T CD4 positive o CD8 positive che esprimono il TCR appropriato nei pozzetti corretti e lasciare che le cellule aderiscano a 37 gradi Celsius per 15 minuti.Una volta che le cellule si sono attaccate e diffuse sulla superficie, sono pronte per la fotoattivazione e l'imaging. Per l'acquisizione delle immagini è possibile utilizzare un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale invertito dotato di un obiettivo 150X compatibile con i raggi UV. Monitora le sonde in entrambi i canali verde e rosso utilizzando laser di eccitazione a 488 nanometri e 561 nanometri, rispettivamente.Dopo aver montato il vetrino della camera contenente le cellule T, regolare le impostazioni del microscopio per ottenere l'illuminazione TIRF o a epifluorescenza, se necessario. In modalità Live, selezionare un campo di celle che esprimono le sonde fluorescenti di interesse. Stabilire regioni su scala micron per la fotoattivazione sotto le singole cellule utilizzando il controllo software.Quindi, inizia l'acquisizione. In genere, sono necessari 80 punti temporali con un intervallo di cinque secondi tra ciascuno. Ciò lascia il tempo per esposizioni sequenziali a 488 nanometri e 563 nanometri nel caso di esperimenti a doppio colore.Quindi, dopo aver acquisito 10 punti temporali, fotoattivare le regioni selezionate aprendo l'otturatore digitale a diaframma da uno a 1,5 secondi. Al termine del time lapse, selezionare un nuovo campo di celle e ripetere il processo. Iniziare determinando l'intensità della fluorescenza di una regione di fondo al di fuori della cella da utilizzare per la correzione dello sfondo.Disegna una regione quadrata di dimensioni micron all'esterno della cella e crea una maschera. Per determinare l'intensità della fluorescenza, fare clic su Analizza, Statistiche maschera. Selezionare Intensità di fluorescenza media ed esportare i valori.Determina l'intensità della fluorescenza all'interno della regione fotoattivata per ogni punto temporale. Seleziona Maschera per evidenziare la regione che è stata fotoattivata. Per determinare l'intensità della fluorescenza, fare clic su Analizza, Statistiche maschera.Selezionare Intensità di fluorescenza media ed Esporta i valori. Ottieni le coordinate X e Y del centro della regione fotoattivata selezionando Maschera per evidenziare la regione che è stata fotoattivata. Una volta evidenziata la regione di fotoattivazione, selezionare Analizza, Statistiche maschera, Centro area ed Esporta i valori.Determinare le coordinate X e Y della sonda fluorescente di interesse. Selezionare Tracciamento manuale delle particelle e fare clic sulla sonda fluorescente di interesse nel tempo. Una volta tracciati tutti i punti temporali, selezionare Analizza, Statistiche maschera, Centro area ed Esporta i valori.Le cellule T sono state attaccate a un vetro di copertura a camera contenente MCC-IEFK fotoattivabile. C1-GFP, una sonda per il secondo messaggero lipidico DAG, è stata ripresa utilizzando la microscopia TIRF e RFP-Tubulina in modalità epifluorescenza. La fotoattivazione localizzata della superficie sotto la cellula T induce l'accumulo di DAG nella zona irradiata.Questo è seguito in pochi secondi dal riorientamento del centrosoma nella stessa regione. L'accumulo di C1-GFP può essere quantificato calcolando nel tempo l'intensità di fluorescenza normalizzata dopo la correzione dello sfondo al centro della regione fotoattivata. Il riorientamento del centrosoma in risposta alla fotoattivazione può essere quantificato calcolando la distanza tra il centrosoma e il centro della regione fotoattivata in funzione del tempo.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di un giorno se eseguita correttamente. In genere generiamo da 15 a 20 filmati time lapse per l'analisi in questo periodo. Questo approccio ha spianato la strada ai ricercatori per esplorare la cinetica precisa e la polarizzazione dell'attivazione della segnalazione nelle cellule T.È stato anche adattato per studiare la segnalazione inibitoria nelle cellule natural killer. Di conseguenza, ora abbiamo una migliore comprensione di come le interazioni comunicative tra cellule immunitarie vengono assemblate e dissolte.

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Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Un metodo per spazio-temporale controllo delle attività di piccola GTPasi dalla luce viene descritta. Questo metodo si basa sulla rapamicina indotta FKBP-FRB eterodimerizzazione e foto-gabbie sistemi. Ottimizzazione di irradiazione di luce permette l'attivazione spazio-temporalmente controllato delle piccole GTPasi a livello subcellulare.

Manipolazione spazio-temporale di attività GTPasi Piccolo a livello subcellulare e su scala temporale di secondi nelle cellule viventi

La compartimentazione delle proteine ​​sia all'interno della membrana plasmatica o in sedi intracellulari è un meccanismo di regolazione che possono influenzare notevolmente i risultati di segnalazione, di conseguenza, per comprendere la segnalazione è importante studiare il comportamento spaziale e temporale delle proteine ​​coinvolte. Descriviamo qui un sistema basato TIRF microscopia a studiare trasduzione del segnale in cellule T, ma è ampiamente applicabile.

Una tecnica di microscopia TIRF per Real-time, Imaging simultanea del TCR e delle sue proteine ​​associate segnalazione

Questo video mostra un metodo per dedurre un complesso di istocompatibilità peptide-maggiore fotoattivabile utilizzando l'irradiazione UV. Il processo di deforestazione espone la sequenza peptidica nativa, consentendo un'attivazione precisa delle cellule T.

Valutazione dell'attivazione controllata delle cellule T con un peptide MHC fotoattivabile

Si descrive un metodo live-cell imaging che permette di comprendere dinamica della proteina durante il processo di attivazione delle cellule T. Dimostriamo l'utilizzo combinato della cellula T diffusione saggio, microscopia confocale e analisi di imaging per produrre risultati quantitativi di seguire segnalamento formazione di complessi durante l'attivazione delle cellule T.

Tempo reale Imaging in diretta di cellule T Signaling formazione del complesso

Qui, viene presentata una procedura per attivare selettivamente una proteina neuronale con un breve impulso di luce codificando geneticamente un amminoacido innaturale foto-reattivo in una proteina neuronale bersaglio espressa in neuroni in coltura o in vivo.

Controllo ottico di una proteina neuronale Utilizzando un acido Innaturale Amino geneticamente codificata in neuroni

In questo protocollo, gabbia della proteina chinasi A (PKA), un bioeffector di trasduzione del segnale cellulare, era immobilizzata su una superficie di nanoparticelle, microiniettata nel cytosol e attivata da upconverted UV luce da irradiazione di vicino infrarosso (NIR), che inducono disintegrazione di fibra a valle dello stress nel citosol.

Un sistema integrato di attivare remotamente la trasduzione del segnale intracellulare di fotoattivazione Upconversion Nanoparticle-mediata della chinasi

Qui, presentiamo un protocollo per analizzare la cellula--cellula trasferimento di informazioni oscillatori di optogenetica controllo e monitoraggio dell'espressione genica live. Questo approccio fornisce una piattaforma unica per testare un significato funzionale dei programmi di espressione genica dinamici nei sistemi pluricellulari.

Un metodo di optogenetica per controllare e analizzare il pattern di espressione genica nelle interazioni della cellula--cellula

Questo protocollo descrive l'uso di singola catena MHC di classe I complessi di indagare interazioni molecolari nell'attivazione di cellule T CD8 + umano: generazione di cellule che esprimono la catena singola presentanti l'antigene ingegnerizzato costruisce, cultura del clone di cellule T CD8 + umano ed esperimenti di attivazione delle cellule T.

Uso della tecnologia di MHC di singola catena di indagare Co-agonismo in umano CD8 + attivazione delle cellule T

Questo protocollo descrive la generazione di chimere di midollo osseo murino misto con i centri germinali autoimmune spontanei, in cui autoreattive linfociti trasportano un reporter di proteina fluorescente verde (GFP-PA) fuse. Questo fornisce la possibilità di collegare posizione cellulare nei tessuti con analisi molecolari e funzionali a valle.

Interrogando i centri germinali autoreattive individuali di fotoattivazione in un modello misto chimerico dell'autoimmunità

Questo protocollo descrive l'applicazione di un dominio di commutazione allosterica attivato dalla luce blu (LightR) ingegnerizzato per il controllo spaziotemporale reversibile dell'attività proteica. Utilizzando la tirosin-chinasi Src come modello, questo studio offre un protocollo elaborato per lo sviluppo e la caratterizzazione di Src regolata dalla luce (LightR-Src). Dimostra la versatilità di questo approccio in tutte le classi di enzimi.

Controllo spazio-temporale dell'attività proteica attraverso la regolazione allosterica optogenetica

Questo protocollo descrive i passaggi essenziali per la coltivazione delle cellule T primarie, inclusi il loro isolamento, attivazione, espansione e trasfezione transitoria tramite elettroporazione dell'mRNA. Inoltre, viene proposto un flusso di lavoro e un pannello di anticorpi per l'analisi citometrica a flusso del fenotipo, dei marcatori di attivazione, della vitalità e dell'espressione del recettore antigenico chimerico (CAR).

Isolamento, coltivazione e trasfezione transitoria delle cellule T primarie umane per generare cellule T del recettore antigenico chimerico (CAR)

Impara a controllare spazialmente e temporalmente l'attivazione delle cellule T utilizzando un agonista fotoattivabile. Questo metodo consente di indurre segnalazione polarizzata nei linfociti T e studiare la trasduzione dei segnali localizzati.

Controllo spaziale e temporale di attivazione delle cellule T utilizzando un agonista fuse

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