I cambiamenti di monitoraggio della concentrazione di calcio intracellulare ed efficacia Synaptic nel Mollusco

Il calcio intracellulare è stato indicato come una componente importante di diversi meccanismi di plasticità sinaptica. Queste ipotesi possono essere verificate monitorando contemporaneamente le variazioni di calcio e le alterazioni dell'efficacia sinaptica. Qui illustriamo come ciò venga realizzato combinando l'imaging del calcio con la registrazione intracellulare.

I nostri esperimenti sono condotti con un ganglio del mollusco Aplysia Cahora. Questo preparato presenta diversi vantaggi, come neuroni di grandi dimensioni e identificati, le basse temperature naturali per Aplysia, segnali lenti e un'immagine facilitata, ma le tecniche generali che dimostriamo possono essere facilmente trasferite ad altri sistemi. Ciao, sono Colin Evans nel laboratorio di Elizabeth Cropper del Dipartimento di Neuroscienze Fishburg e dell'Istituto Neurologico Freedman presso la Mount Sinai School of Medicine di New York City.

Oggi, dimostreremo l'imaging simultaneo dei cambiamenti nella concentrazione di calcio intracellulare e dell'efficacia sinaptica nel ganglio buccale del mollusco Aplysia cahora. Per rilevare il calcio intracellulare, inietteremo un neurone pre-sinaptico con il colorante indicatore di calcio permeabile alle IMP cellulari, calcium orange. Il preparato viene quindi spostato sotto il microscopio e i neuroni pre- e post-sinaptici vengono impalati con elettrodi affilati.

Una stimolazione presinaptica ripetuta provoca una risposta postsinaptica potenziata, visibile come aumento del potenziale postsinaptico o dell'ampiezza del PSP. La misurazione del segnale fluorescente del colorante indicatore del calcio ci permetterà di rilevare variazioni simultanee del calcio intracellulare presinaptico. Per iniziare, anestetizzare un animale adulto del peso di circa 150 grammi iniettando 75 ml di soluzione isotonica di cloruro di magnesio, fissare l'animale anestetizzato su una capsula ricoperta di cera, quindi, utilizzando pinze e forbici grossolane, praticare un'incisione nel piede dell'animale ed esporre la massa buccale.

Il ganglio buccale si trova sulla faccia ventrale della massa buccale ed è costituito da due emigangli connessi. Contiene alcune centinaia di neuroni che, insieme ai neuroni di altri gangli, contribuiscono alla generazione e al controllo del comportamento alimentare dell'animale. Liberare con cura il ganglio recidendo tutti i nervi piegati con forbici fini ed estrarlo dall'animale.

Quindi fissare il ganglio liberato alla base di una piastra rivestita con sil guard riempita di acqua di mare artificiale. Il ganglio è avvolto da una guaina di tessuto connettivo, che deve essere rimossa per esporre i singoli neuroni. Utilizzare pinze a pressione, forbici da iridectomia e la massima cautela per asportare questa guaina.

Per evitare di danneggiare i neuroni, stabilizzare il ganglio descheletrizzato con circa 15 spilli, poiché qualsiasi movimento risulterà problematico durante l'acquisizione delle immagini. Per preparare elettrodi affilati per la registrazione intracellulare e l'iniezione di colorante, tirare il tubo capillare con un estrattore per microelettrodi. Utilizziamo vetro borosilicato sottile con filamento e un diametro esterno di un millimetro.

Gli elettrodi di registrazione dovrebbero avere una resistenza di circa 10 mega quando sono riempiti con acetato di potassio tre molare, quindi regoliamo il puller di conseguenza per riempire gli elettrodi D. Immergere la parte posteriore dell'elettrodo tirato in una soluzione millimolare 10 del colorante orange di calcio; l'azione capillare lungo il filamento di vetro all'interno dell'elettrodo attirerà il colorante verso la punta, quindi riempire nuovamente l'elettrodo con cloruro di potassio 200 millimolare per garantire un buon contatto elettrico. Utilizziamo un Bela appositamente costruito per migliorare le proprietà dell'elettrodo e ridurre la resistenza dell'elettrodo di registrazione a circa cinque mega.

L'elettrodo viene mantenuto a un angolo di 45 gradi all'interno di un flusso di sospensione di ossido di alluminio. Mescolando cloruro di sodio nella sospensione e collegando un ohmmetro, è possibile monitorare la resistenza dell'elettrodo. Durante il processo di affilatura, trasferiamo la piastra contenente i gangli pleurici decapitati su un apparato di elettrofisiologia e localizziamo i neuroni di interesse infilzandoli con elettrodi e verificandone l'identità.

Per preparare i neuroni all'acquisizione dell'immagine del calcio, inseriamo innanzitutto un elettrodo riempito con un colorante nel soma cellulare e carichiamo il colorante elettrofisiologicamente mediante impulsi di corrente iperpolarizzante da 15 nanoampere per 30 minuti. Mentre il D calcium orange entra nella cellula, il SOR assumerà un colore rosa pallido. Successivamente ritiriamo con attenzione gli elettrodi di registrazione e lasciamo il preparato a riposo per almeno 30 minuti, consentendo al colorante di diffondere nei processi fini del neurone.

Successivamente, trasferire la piastra con il preparato su un microscopio a fluorescenza. Utilizziamo un obiettivo ad immersione in acqua con ingrandimento 10 volte e apertura numerica 0,3 su un microscopio verticale con piatto fisso, che mette a fuoco spostando l'obiettivo invece del piatto. Questo rende più semplice il montaggio dei manipolatori.

Per gli elettrodi di registrazione, selezionare un blocco filtro appropriato. Un blocco filtro SI a tre posizioni fornirà i filtri di eccitazione e di emissione corretti per il calcium orange; regolare i parametri della telecamera e l'intensità dell'illuminazione mediante filtri neutri di densità e l'apertura del campo. Una maggiore intensità luminosa ridurrà il rumore, ma potrebbe causare lo sbiancamento del preparato.

La fotocamera CCD cool snap può acquisire un campo di 500 per 300 pixel a una frequenza di circa 30 fotogrammi al secondo, con un buon rapporto segnale-rumore. Minimizzare l'illuminazione dei neuroni fil mantenendo chiuso lo scatto delle sorgenti luminose ogni volta che possibile. Nel software di acquisizione, selezionare le regioni di interesse o ROI.

Queste regioni definiscono i punti in cui il software effettuerà le misurazioni dell'intensità. In genere si acquisiscono immagini dei rami primari, secondari e terziari del neurone presinaptico. Posizionare un'ulteriore area di interesse (ROI) accanto al neurone difi per ottenere un valore di fondo che verrà successivamente sottratto da tutti gli altri punti dati.

Si utilizzano elettrodi per la registrazione intracellulare nei neuroni pre- e post-sinaptici per indurre e monitorare la trasmissione sinaptica. È possibile garantire la sincronizzazione tra l'acquisizione dei dati elettrofisiologici e quella delle immagini utilizzando il segnale di trigger di uscita dei fotogrammi della telecamera per avviare il software di acquisizione dati. Un altro modo per assicurare la sincronizzazione consiste nell'installare un LED all'interno della porta della telecamera.

Questo LED viene acceso brevemente all'inizio della sessione di registrazione, fornendo così un marcatore di sincronizzazione. Durante un esperimento tipico, si inducono potenziali d'azione nel neurone presinaptico iniettando impulsi di corrente brevi. In questo esempio, mostriamo un burst di picchi e i corrispondenti aumenti del segnale di calcio per verificare ipotesi specifiche.

Il segnale del calcio può essere manipolato e gli effetti sulla trasmissione sinaptica possono essere determinati. Ad esempio, farmaci come il chelante del calcio EGTA possono essere iniettati presinapticamente o applicati attraverso il sistema di perfusione. I dati vengono analizzati esportandoli dal software di imaging in un file di testo e successivamente nel software utilizzato per acquisire i dati elettrofisiologici, che nel nostro caso è spike two di Cambridge Electronic Design.

Utilizziamo uno script scritto su misura per tracciare i valori di intensità delle ROI e le corrispondenti variazioni del potenziale di membrana, e per quantificare le variazioni nel segnale del calcio sottraendo il segnale di fondo ottenuto dalla ROI di fondo e calcolando la variazione relativa mediante l'equazione mostrata. F zero è la fluorescenza appena prima della stimolazione, e F è la fluorescenza durante la stimolazione. Qui mostriamo i risultati di un esperimento in cui abbiamo osservato le variazioni della fluorescenza del calcio nel neurone identificato B 21.

La regione che abbiamo acquisito è indicata in A; in B uno, abbiamo indotto un burst di potenziali d'azione in B 21, che ha provocato potenziali postsinaptici in B otto e un cambiamento nel segnale del calcio. B due mostra l'effetto dell'iniezione del chelante del calcio. Gli potenziali d'azione in B 21 non inducono più aumenti diffusi della fluorescenza del calcio e l'ampiezza del potenziale postsinaptico è ridotta.

In conclusione, abbiamo dimostrato tecniche che possono essere utilizzate per monitorare simultaneamente la concentrazione intracellulare di calcio e valutare l'efficacia della trasmissione sinaptica. Queste tecniche richiedono soltanto attrezzature modeste rispetto alla maggior parte delle tecniche di imaging funzionale ed è facile e rapido impararle.