Name: I cambiamenti di monitoraggio della concentrazione di calcio intracellulare ed efficacia Synaptic nel Mollusco Aplysia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Scopri come monitorare simultaneamente la concentrazione di calcio intracellulare e l'efficacia sinaptica nel mollusco Aplysia. Questo metodo combina l'imaging del calcio con la registrazione intracellulare per studiare la plasticità sinaptica.

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Una borsa di studio PHS (MH51393) ha sostenuto questo lavoro. Alcuni dei Aplysia usiamo sono fornite dal Risorse Nazionale per l&#39;Aplysia dell&#39;Università di Miami sotto Grant RR10294 dal Centro nazionale per le risorse di ricerca, NIH.

1. Preparazione <ol><li> Anestetizzare l&#39;animale mediante iniezione di 75-100 ml di soluzione isotonica di cloruro di magnesio. L&#39;Aplysia che usiamo per l&#39;imaging sono in genere 150-200 grammi e sono ottenuti da Marinus scientifico. </li><li> Pin anestetizzato l&#39;animale a un piatto coperto di cera. Aghi per siringhe funzionano bene per questo scopo; tecniche sterili non sono necessari. Utilizzo di pinze e forbici lordi standard, fare un&#39;incisione nel piede dell&#39;animale ed esporre la massa buccale. Individuare il ganglio vestibolare. Utilizzo di forbici e pinze a molla raffinati, cura gratuitamente il ganglio, tagliando tutti i nervi vestibolari. </li><li> Rimuovere il ganglio e metterlo in un piatto rivestito Sylgard contenente acqua di mare artificiale. Mettere un paio di perni di insetti attraverso i nervi buccale per stabilizzare il ganglio. Desheath il ganglio vestibolare con pinze e forbici ultrafini primavera, in modo da esporre i neuroni per la registrazione intracellulare. Poi ri-pin del ganglio con circa 15 insetti fine (minutien) pin. Il ganglio deve essere tenuta saldamente in posizione come qualsiasi movimento sarà problematica durante l&#39;esposizione. </li></ol> 2. Preparare Elettrodi <ol><li> Tirare elettrodi con tubo capillare di vetro con filamento (ad esempio WPI TW100F-4) e di un estrattore. Le impostazioni dovrebbero essere determinato individualmente per creare elettrodi della necessaria resistenza. Quando riempito con 3 M Kac (acetato di potassio), la nostra resistenza elettrodo è generalmente di circa 10 MOhm se gli elettrodi devono essere smussati, o circa 5 MOhm se la fase di smussatura viene omesso. </li><li> Riempire una serie di elettrodi con una soluzione contenente 3 M KCl KAc/30 mM con una siringa e l&#39;ago Microfil. Questi elettrodi saranno utilizzati per elettrofisiologia. </li><li> Riempire una seconda serie di elettrodi con il colorante indicatore calcio immergendo l&#39;estremità posteriore dell&#39;elettrodo in tintura, precedentemente ricostituito con ca. 40 microlitri di acqua distillata per tintura 500μg. Quando la punta dell&#39;elettrodo è riempito, riempimento posteriore circa 1/4 pollicedella estremità dell&#39;elettrodo con 200 mM KCl per assicurare un buon contatto elettrico. </li><li> È vantaggioso per smussare gli elettrodi, ciò facilita l&#39;iniezione colorante e riduce il danno di membrana penetrazioni multiple. Usiamo un beveler personalizzato che genera un flusso di una sospensione di acqua salata / allumina polvere. L&#39;elettrodo è montato su un supporto e la sua punta entra nel flusso con un angolo di 45 °. Resistenza dell&#39;elettrodo viene continuamente monitorata e la smussatura terminato quando la resistenza raggiunge circa 5 MOhm per gli elettrodi KAC pieni. Gli elettrodi colorante piene sono smussati per un uguale periodo di tempo e in genere hanno resistenze di MOhm 15-20. </li></ol> 3. Caricamento del colorante indicatore di calcio <ol><li> Mettere il preparato su una piattaforma elettrofisiologia e individuare visivamente il neurone presinaptico di interesse. Molti dei nostri esperimenti sono fatti con un neurone identificato sensoriale utilizzata durante l&#39;alimentazione, B21 5, 6. La Positio relativamente fisson, dimensioni (~ 100 micron), e la forma allungata del soma B21 lo rendono facile da individuare. </li><li> Impalare il neurone di interesse con un elettrodo contenente il colorante indicatore di calcio. B21 identità può essere verificata impalandoli postsinaptica neurone B8. Depolarizzazione di B21 con ~ 8 corrente nA attiverà punte e risultati nel facilitare PSP in B8 7. </li><li> Iniettare colorante nel neurone presinaptico di interesse passando impulsi iperpolarizzante (tipicamente -15 nA, 1 Hz, duty cycle del 75%) per circa 30 minuti. Se il caricamento colorante è successo, soma del neurone acquisirà un colore rosa tenue. Rimuovere il colorante contenente elettrodo lentamente ritirando dal neurone. </li><li> Lascia i preparativi per circa 30 minuti per permettere al colorante di diffondersi nei processi sottili che fanno contatto sinaptico con i neuroni follower. </li></ol> 4. Calcio Imaging e registrazione elettrofisiologica <ol><li> Mettere il preparato sul microsc immaginiOpe. Il piatto con la preparazione si svolge su un tavolo di raffreddamento con pezzi di filo sigillante Permagum che, a differenza di argilla, rimane appiccicosa quando è bagnato. Il microscopio palcoscenico fisso concentra spostando l&#39;obiettivo. Lo stadio resta fermo, che permette di collegare manipolatori magnete montato. Come l&#39;ingrandimento elevato rende le vibrazioni (in particolare il movimento laterale) un problema, il programma di installazione di imaging intero deve essere posto su una piattaforma di isolamento dalle vibrazioni. </li><li> Impale neuroni presinaptici e postsinaptici con elettrodi contenenti normale soluzione elettrolitica. </li><li> Selezionare un blocco filtro adatto al calcio Arancione immagine (eccitazione 549 nm, emissione 576 nm) 8 e regolare la telecamera. La maggior parte scientifici telecamere CCD permettono al ricercatore di scegliere un sottoinsieme di cellule CCD che vengono lette. Inoltre, le cellule possono essere combinati (categorizzate). Selezionando un piccolo sottoinsieme velocità aumenta, mentre aumenta la sensibilità binning. Queste due impostazioni, insieme con il tempo di esposizione, determinanoil frame rate cioè quante immagini possono essere acquisite al secondo. Impostazioni adatte volontà immagine su una superficie di 580 x 350 micron 2 con 500 x 300 pixel (con una lente 10x e un adattatore per fotocamera 0.5x). Aggiungere filtri a densità neutra al percorso di luce per regolare l&#39;intensità di illuminazione per la quantità minima che fornisce esposizione corretta con un tempo di esposizione &lt;25 ms. Queste impostazioni dovrebbe portare a un frame rate di circa 30 Hz - che in Aplysia è abbastanza veloce per singola immagine evocata picco alterazioni di calcio. Infine, chiudere il diaframma di campo in modo che solo l&#39;area imaged è illuminato. </li><li> Nel software di imaging segnare regioni del neurone che si desidera misurare. Nella AR Elements questo viene fatto in &quot;Tempo di misura&quot; sezione mettendo regioni di interesse (ROI). B21 è un neurone bipolare e lavoro precedente ha dimostrato che i suoi contatti processo laterale del neurone postsinaptico di interesse 9. In genere l&#39;immagine primaria, reggiseno secondaria e terziarianches del processo laterale mettendo una ROI su ogni parte del neurone. Un ulteriore ROI vicino al neurone colorante riempito viene misurata per fornire un valore di sfondo che viene successivamente sottratto da tutti gli altri punti dati. </li><li> Istruire l&#39;acquisizione elettrofisiologia (in questi esperimenti Spike II) attendere un segnale di trigger fornito dal &quot;lettura frame&quot; del segnale della telecamera. Avviare l&#39;acquisizione delle immagini (elementi AR); Spike II ora avviare automaticamente la registrazione quando la fotocamera prende il primo fotogramma. È inoltre possibile utilizzare una uscita TTL del Potere 1401 a passare brevemente in un LED montato nella porta fotocamera del microscopio. Ciò fornirà un segnale per sincronizzare successivamente imaging e dati elettrofisiologici. </li><li> Stimolare il neurone presinaptico iniettando una serie di brevi impulsi depolarizzanti corrente alla frequenza desiderata. È importante monitorare ogni impulso (ad esempio con un oscilloscopio stimolo attivato) per determinare se un potenziale di azione è successfully generato. Mentre Arancione calcio è molto foto-stabile rispetto ad altri coloranti, è una buona idea registrare un processo di controllo senza stimolazione per controllare la quantità di colorante sbiancamento si verifica. </li><li> In esperimenti in cui vengono manipolate concentrazioni di calcio intracellulare, un farmaco come EGTA viene introdotto nel neurone presinaptico e le fasi di acquisizione e stimolazione dati sopra descritte vengono ripetute. </li></ol> 5. Analisi dei dati rappresentativi <ol><li> Esportare i dati di imaging (l&#39;elenco dei valori di intensità misurati per ogni ROI) scrivendo in un file di testo. Uno script personalizzato in Spike II quindi possibile importare il file di testo. Questo script normalizza anche i valori della sonda con zona dell&#39;individuo, e sottrae il valore della sonda sfondo. I punti dati vengono poi tracciate a fianco i dati di elettrofisiologia come &quot;virtuale RealWave&quot; canale. Il &quot;canale di processo / funzione Time Shift&quot; di Spike II viene utilizzato per allineare con precisione l&#39;imaging dati pointi, utilizzando il led di segnalazione come riferimento. </li><li> Per ottenere valori come variazione percentuale, analizzare i dati di imaging calcolando la variazione relativa di fluorescenza come dF / F o = (FF o) / F o. F o denota il livello di fluorescenza appena prima dello stimolo e F la fluorescenza durante lo stimolo. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Schema generale della sperimentazione. Gli esperimenti sono condotti in un preparato ganglio di Aplysia. Variazioni di calcio intracellulare sono ripreso con un colorante fluorescente, che è iontophoretically introdotto nel neurone presinaptico. Neuroni pre-e post-sinaptico sono poi impalato con elettrodi appuntiti in modo che la trasmissione sinaptica può essere indotto e controllato. <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig2.jpg" alt="Figura 2" /> <strong&gt; Figura 2. immagini di calcio e la registrazione intracellulare dai neuroni individuate nel ganglio vestibolare di Aplysia. (A) Foto del ramo laterale immaginata di neurone B21. Confezione indica la regione misurata di interesse. (B1) stimolazione intracellulare di B21 evoca potenziali d&#39;azione (linea di fondo) e favorire potenziali postsinaptici (PSP) nel neurone postsinaptico seguace B8 (metà traccia) facendolo sparare anche potenziali d&#39;azione. Aumenti nella fluorescenza di calcio presinaptico sono mostrati nella traccia superiore. (B2) Effetto della EGTA presinaptica di facilitazione homosynaptic. EGTA stato iniettato in intracellularmente B21 ~ 15 minuti prima della stimolazione intracellulare. Si pensa che EGTA è un chelante del calcio in qualità lento, che a basse concentrazioni non è abbastanza veloce per sopprimere la trasmissione sinaptica. Notare la riduzione del segnale di calcio diffusa e la corrispondente riduzione del PSP ampiezza. (C) L&#39;ampiezza PSP correla con la Calciu presinapticam segnale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3907/3907fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

<ol><li>Zucker, R. S., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Short-term synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).</li>
<li>Eberhard, M., Erne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+binding+to+fluorescent+calcium+indicators%3A+Calcium+green%2C+calcium+orange+and+calcium+crimson%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophysical+Res.+Comm%22%5BJournal%5D)">Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson.</a> Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).</li>
<li>Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+properties+of+DM-nitrophen+and+calcium+indicators%3A+rapid+transient+response+to+flash+photolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis.</a> Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).</li>
<li>Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+spike-mediated+synaptic+transmission+by+presynaptic+background+Ca2%2B+in+leech+heart+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons.</a> J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).</li>
<li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+synaptic+connections+between+peptidergic+radula+mechanoafferent+neurons+and+neurons+in+the+feeding+system+of+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).</li>
<li>Ludwar, B. C. h, Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+mechanisms+mediate+potentiating+effects+of+depolarization+on+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission.</a> J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).</li>
<li>Evans, C. G., Ludwar, B. C. h, Askansas, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+holding+potential+on+the+dynamics+of+homosynaptic+facilitation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation.</a> J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).</li>
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</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Dimostriamo tecniche che possono essere utilizzati per monitorare simultaneamente la concentrazione intracellulare di calcio e di valutare l&#39;efficacia della trasmissione sinaptica. Queste tecniche sono utili per determinare in che modo le varie forme di plasticità a breve termine sono mediati. L&#39;immagine viene eseguita con un microscopio a fluorescenza e camera CCD. Questi requisiti apparecchiature sono relativamente modesta se confrontata con la maggior parte di imaging funzionale s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commento </td></tr><tr><td> Calcio Arancione </td><td> Invitrogen </td><td> C-3013 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E-4378 </td><td></td></tr><tr><td> Calcio kit di calibrazione del buffer </td><td> Invitrogen </td><td> C-3008MP </td><td> utile per testare la sensibilità e la gamma dinamica del segnale </td></tr><tr><td> Magnesio cloruro esaidrato </td><td> Sigma </td><td> M0250 </td><td> utilizzato in soluzione 0,33 M di anestetizzare animale </td></tr></tbody></table> Reagenti Tabella 1. Usato. <table border="1"><tbody><tr><td> Attrezzature Nome </td><td> Azienda </td><td> Commento </td></tr><tr><td> FN-1 microscopio a fluorescenza in posizione verticale </td><td> Nikon Instruments </td><td> con Narishige ITS-FN1 stadio </td></tr><tr><td> NMN-21 manipolatori </td><td> Narishige </td><td> montato sul palco con i magneti </td></tr><tr><td> CoolSNAP HQ 2 CCD </td><td> Fotometrici </td><td></td></tr><tr><td> NIS elementi AR (Versione 3.22) </td><td> Nikon Instruments </td><td> software di imaging utilizzato per acquisire dati di fluorescenza </td></tr><tr><td> 10X/0.3w Plan Fluor obiettivo </td><td> Nikon Instruments </td><td> questa lente immersione ha una distanza molto lunga di 3,5 mm </td></tr><tr><td> X-Cite 120 lampada ad alogenuri metallici PC </td><td> EXFO </td><td> utilizzata per l&#39;imaging di fluorescenza </td></tr><tr><td> LS-DWL lampada alogena </td><td> Sumica </td><td></td></tr><tr><td> ET-CY3 filtro set </td><td> Tecnologia Chroma </td><td>; </td></tr><tr><td> Potenza 1401 A / D converter </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td> il campionamento è stato fatto a 3 kHz </td></tr><tr><td> Spike II (Versione 7,07) </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td> Il software utilizzato per l&#39;acquisizione dei dati di elettrofisiologia </td></tr><tr><td> SEC-10 LX amplificatore </td><td> NPI elettronica </td><td> utilizzato con un headstage 10X </td></tr><tr><td> Modello 410 amplificatore </td><td> Brownlee di precisione </td><td> utilizzato per amplificare e filtrare il segnale </td></tr><tr><td> WS-4 </td><td> meno k Tecnologia </td><td> isolamento dalle vibrazioni per l&#39;imaging </td></tr><tr><td> tavolo di raffreddamento </td><td> su misura </td><td> lastra di ottone attraverso cui l&#39;acqua viene pompata ghiaccio a tasso variabile </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Attrezzatura utilizzata.

i cambiamenti di monitoraggio della concentrazione di calcio intracellulare ed efficacia synaptic nel mollusco<em&gt; aplysia</em

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

È stato suggerito che le variazioni di calcio intracellulare mediano l&#39;induzione di un certo numero di importanti forme di plasticità sinaptica (ad esempio, facilitazione homosynaptic) 1. Queste ipotesi possono essere testati contemporaneamente seguire l&#39;evoluzione del calcio intracellulare e alterazioni in termini di efficacia sinaptica. Si dimostra come questo può essere realizzato combinando calcium imaging con tecniche di registrazione intracellulari. I nostri esperimenti sono condotti in un ganglio vestibolare del mollusco Aplysia californica. Questa preparazione ha una serie di caratteristiche vantaggiose sperimentalmente: Ganglia può essere facilmente rimosso dal Aplysia ed esperimenti utilizzare neuroni adulti che rendono normali connessioni sinaptiche e hanno una distribuzione normale canale ionico. A causa del basso tasso metabolico dell&#39;animale e le temperature relativamente basse (14-16 ° C) che sono naturali per Aplysia, preparati sono stabili per lunghi periodi di tempo. ent &quot;&gt; Per rilevare le variazioni di calcio libero intracellulare useremo la versione impermeant cella di calcio Orange 2 che è facilmente &#39;caricato&#39; in un neurone tramite ionoforesi. Quando questo colorante fluorescente lunghezza d&#39;onda lunga si lega al calcio, aumenta l&#39;intensità di fluorescenza. calcio Orange ha veloci proprietà cinetiche 3 e, a differenza di coloranti raziometrici (ad esempio, Fura 2), non necessita di ruota portafiltri per l&#39;imaging. E &#39;abbastanza stabile e meno foto fototossiche di altri coloranti (ad esempio, fluo-3) 2,4. Come tutti i non-raziometrico coloranti, calcio Arancione indica variazioni relative di concentrazione di calcio. Ma, poiché non è possibile tener conto delle variazioni concentrazione di colorante dovute al carico e diffusione, non può essere calibrato per fornire concentrazioni di calcio assoluti. Un montante, fisso stadio, microscopio composto è stato usato per i neuroni di immagine con una fotocamera CCD in grado di registrare circa 30 fotogrammi al secondo. In questo Aplysia risoluzione temporaleè più che sufficiente per rilevare anche un singolo picco alterazione indotta nella concentrazione di calcio intracellulare. Elettrodi Sharp sono contemporaneamente utilizzati per indurre e registrare la trasmissione sinaptica in neuroni identificati pre-e post-sinaptico. Al termine di ogni prova, uno script personalizzato combina elettrofisiologia e dati di imaging. Per garantire la corretta sincronizzazione usiamo un impulso di luce da un LED montato nella porta fotocamera del microscopio. La manipolazione dei livelli di calcio presinaptici (ad esempio tramite iniezione intracellulare EGTA) ci permette di testare ipotesi specifiche, riguardanti il ​​ruolo del calcio intracellulare nel mediare le varie forme di plasticità.

Si dimostra come cambiamenti nella concentrazione di calcio libero intracellulare ed efficacia sinaptica possono monitorare in un preparato di ganglio<em&gt; Aplysia</em&gt;. Abbiamo immagine calcio intracellulare utilizzando un colorante fluorescente, Orange calcio, e indurre e controllare la trasmissione sinaptica con taglienti (intracellulare) elettrodi.

I cambiamenti di monitoraggio della concentrazione di calcio intracellulare ed efficacia Synaptic nel Mollusco<em&gt; Aplysia</em

È stato suggerito che le variazioni del calcio intracellulare medino l'induzione di diverse forme importanti di plasticità sinaptica (ad esempio, ...

Il calcio intracellulare è stato indicato come una componente importante di diversi meccanismi di plasticità sinaptica. Queste ipotesi possono essere verificate monitorando contemporaneamente le variazioni di calcio e le alterazioni dell'efficacia sinaptica. Qui illustriamo come ciò venga realizzato combinando l'imaging del calcio con la registrazione intracellulare.I nostri esperimenti sono condotti con un ganglio del mollusco Aplysia Cahora. Questo preparato presenta diversi vantaggi, come neuroni di grandi dimensioni e identificati, le basse temperature naturali per Aplysia, segnali lenti e un'immagine facilitata, ma le tecniche generali che dimostriamo possono essere facilmente trasferite ad altri sistemi. Ciao, sono Colin Evans nel laboratorio di Elizabeth Cropper del Dipartimento di Neuroscienze Fishburg e dell'Istituto Neurologico Freedman presso la Mount Sinai School of Medicine di New York City.Oggi, dimostreremo l'imaging simultaneo dei cambiamenti nella concentrazione di calcio intracellulare e dell'efficacia sinaptica nel ganglio buccale del mollusco Aplysia cahora. Per rilevare il calcio intracellulare, inietteremo un neurone pre-sinaptico con il colorante indicatore di calcio permeabile alle IMP cellulari, calcium orange. Il preparato viene quindi spostato sotto il microscopio e i neuroni pre- e post-sinaptici vengono impalati con elettrodi affilati.Una stimolazione presinaptica ripetuta provoca una risposta postsinaptica potenziata, visibile come aumento del potenziale postsinaptico o dell'ampiezza del PSP. La misurazione del segnale fluorescente del colorante indicatore del calcio ci permetterà di rilevare variazioni simultanee del calcio intracellulare presinaptico. Per iniziare, anestetizzare un animale adulto del peso di circa 150 grammi iniettando 75 ml di soluzione isotonica di cloruro di magnesio, fissare l'animale anestetizzato su una capsula ricoperta di cera, quindi, utilizzando pinze e forbici grossolane, praticare un'incisione nel piede dell'animale ed esporre la massa buccale.Il ganglio buccale si trova sulla faccia ventrale della massa buccale ed è costituito da due emigangli connessi. Contiene alcune centinaia di neuroni che, insieme ai neuroni di altri gangli, contribuiscono alla generazione e al controllo del comportamento alimentare dell'animale. Liberare con cura il ganglio recidendo tutti i nervi piegati con forbici fini ed estrarlo dall'animale.Quindi fissare il ganglio liberato alla base di una piastra rivestita con sil guard riempita di acqua di mare artificiale. Il ganglio è avvolto da una guaina di tessuto connettivo, che deve essere rimossa per esporre i singoli neuroni. Utilizzare pinze a pressione, forbici da iridectomia e la massima cautela per asportare questa guaina.Per evitare di danneggiare i neuroni, stabilizzare il ganglio descheletrizzato con circa 15 spilli, poiché qualsiasi movimento risulterà problematico durante l'acquisizione delle immagini. Per preparare elettrodi affilati per la registrazione intracellulare e l'iniezione di colorante, tirare il tubo capillare con un estrattore per microelettrodi. Utilizziamo vetro borosilicato sottile con filamento e un diametro esterno di un millimetro.Gli elettrodi di registrazione dovrebbero avere una resistenza di circa 10 mega quando sono riempiti con acetato di potassio tre molare, quindi regoliamo il puller di conseguenza per riempire gli elettrodi D. Immergere la parte posteriore dell'elettrodo tirato in una soluzione millimolare 10 del colorante orange di calcio; l'azione capillare lungo il filamento di vetro all'interno dell'elettrodo attirerà il colorante verso la punta, quindi riempire nuovamente l'elettrodo con cloruro di potassio 200 millimolare per garantire un buon contatto elettrico. Utilizziamo un Bela appositamente costruito per migliorare le proprietà dell'elettrodo e ridurre la resistenza dell'elettrodo di registrazione a circa cinque mega.L'elettrodo viene mantenuto a un angolo di 45 gradi all'interno di un flusso di sospensione di ossido di alluminio. Mescolando cloruro di sodio nella sospensione e collegando un ohmmetro, è possibile monitorare la resistenza dell'elettrodo. Durante il processo di affilatura, trasferiamo la piastra contenente i gangli pleurici decapitati su un apparato di elettrofisiologia e localizziamo i neuroni di interesse infilzandoli con elettrodi e verificandone l'identità.Per preparare i neuroni all'acquisizione dell'immagine del calcio, inseriamo innanzitutto un elettrodo riempito con un colorante nel soma cellulare e carichiamo il colorante elettrofisiologicamente mediante impulsi di corrente iperpolarizzante da 15 nanoampere per 30 minuti. Mentre il D calcium orange entra nella cellula, il SOR assumerà un colore rosa pallido. Successivamente ritiriamo con attenzione gli elettrodi di registrazione e lasciamo il preparato a riposo per almeno 30 minuti, consentendo al colorante di diffondere nei processi fini del neurone.Successivamente, trasferire la piastra con il preparato su un microscopio a fluorescenza. Utilizziamo un obiettivo ad immersione in acqua con ingrandimento 10 volte e apertura numerica 0,3 su un microscopio verticale con piatto fisso, che mette a fuoco spostando l'obiettivo invece del piatto. Questo rende più semplice il montaggio dei manipolatori.Per gli elettrodi di registrazione, selezionare un blocco filtro appropriato. Un blocco filtro SI a tre posizioni fornirà i filtri di eccitazione e di emissione corretti per il calcium orange; regolare i parametri della telecamera e l'intensità dell'illuminazione mediante filtri neutri di densità e l'apertura del campo. Una maggiore intensità luminosa ridurrà il rumore, ma potrebbe causare lo sbiancamento del preparato.La fotocamera CCD cool snap può acquisire un campo di 500 per 300 pixel a una frequenza di circa 30 fotogrammi al secondo, con un buon rapporto segnale-rumore. Minimizzare l'illuminazione dei neuroni fil mantenendo chiuso lo scatto delle sorgenti luminose ogni volta che possibile. Nel software di acquisizione, selezionare le regioni di interesse o ROI.Queste regioni definiscono i punti in cui il software effettuerà le misurazioni dell'intensità. In genere si acquisiscono immagini dei rami primari, secondari e terziari del neurone presinaptico. Posizionare un'ulteriore area di interesse (ROI) accanto al neurone difi per ottenere un valore di fondo che verrà successivamente sottratto da tutti gli altri punti dati.Si utilizzano elettrodi per la registrazione intracellulare nei neuroni pre- e post-sinaptici per indurre e monitorare la trasmissione sinaptica. È possibile garantire la sincronizzazione tra l'acquisizione dei dati elettrofisiologici e quella delle immagini utilizzando il segnale di trigger di uscita dei fotogrammi della telecamera per avviare il software di acquisizione dati. Un altro modo per assicurare la sincronizzazione consiste nell'installare un LED all'interno della porta della telecamera.Questo LED viene acceso brevemente all'inizio della sessione di registrazione, fornendo così un marcatore di sincronizzazione. Durante un esperimento tipico, si inducono potenziali d'azione nel neurone presinaptico iniettando impulsi di corrente brevi. In questo esempio, mostriamo un burst di picchi e i corrispondenti aumenti del segnale di calcio per verificare ipotesi specifiche.Il segnale del calcio può essere manipolato e gli effetti sulla trasmissione sinaptica possono essere determinati. Ad esempio, farmaci come il chelante del calcio EGTA possono essere iniettati presinapticamente o applicati attraverso il sistema di perfusione. I dati vengono analizzati esportandoli dal software di imaging in un file di testo e successivamente nel software utilizzato per acquisire i dati elettrofisiologici, che nel nostro caso è spike two di Cambridge Electronic Design.Utilizziamo uno script scritto su misura per tracciare i valori di intensità delle ROI e le corrispondenti variazioni del potenziale di membrana, e per quantificare le variazioni nel segnale del calcio sottraendo il segnale di fondo ottenuto dalla ROI di fondo e calcolando la variazione relativa mediante l'equazione mostrata. F zero è la fluorescenza appena prima della stimolazione, e F è la fluorescenza durante la stimolazione. Qui mostriamo i risultati di un esperimento in cui abbiamo osservato le variazioni della fluorescenza del calcio nel neurone identificato B 21.La regione che abbiamo acquisito è indicata in A; in B uno, abbiamo indotto un burst di potenziali d'azione in B 21, che ha provocato potenziali postsinaptici in B otto e un cambiamento nel segnale del calcio. B due mostra l'effetto dell'iniezione del chelante del calcio. Gli potenziali d'azione in B 21 non inducono più aumenti diffusi della fluorescenza del calcio e l'ampiezza del potenziale postsinaptico è ridotta.In conclusione, abbiamo dimostrato tecniche che possono essere utilizzate per monitorare simultaneamente la concentrazione intracellulare di calcio e valutare l'efficacia della trasmissione sinaptica. Queste tecniche richiedono soltanto attrezzature modeste rispetto alla maggior parte delle tecniche di imaging funzionale ed è facile e rapido impararle.

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