I cambiamenti di monitoraggio della concentrazione di calcio intracellulare ed efficacia Synaptic nel Mollusco Aplysia

Il calcio intracellulare è stato implicato come una parte importante di diversi meccanismi di plasticità sinaptica. Queste idee possono essere testate monitorando contemporaneamente i cambiamenti nel calcio e le alterazioni nell'efficacia sinaptica. Qui dimostriamo come ciò si ottenga combinando l'imaging del calcio con la registrazione intracellulare.

I nostri esperimenti sono condotti con un ganglio del mollusco Aplysia Cahora. Questa preparazione ha una serie di vantaggi come i grandi neuroni identificati, le basse temperature che sono naturali per l'apia, i segnali lenti e facilitano l'imaging, ma le tecniche generali che dimostriamo sono facilmente trasferibili ad altri sistemi. Ciao, sono Colin Evans nel laboratorio di Elizabeth Cropper nel Dipartimento di Neuroscienze di Fishburg e nel Freedman Brain Institute presso la Mount Sinai School of Medicine di New York City.

Oggi dimostreremo l'imaging simultaneo dei cambiamenti nella concentrazione intracellulare di calcio e nell'efficacia sinaptica nel ganglio buccale del mollusco Aplysia cahora. Per rilevare il calcio intracellulare, inietteremo un neurone pre-sinaptico con il colorante indicatore di calcio permeant IMP cellulare arancio calcio. La preparazione viene quindi spostata al microscopio e i neuroni pre e postsinaptici vengono impalati con elettrodi affilati.

La stimolazione presinaptica ripetuta si traduce in una maggiore risposta postsinaptica visibile come aumento del potenziale postsinaptico o dell'ampiezza della PSP. La misurazione del segnale fluorescente del colorante indicatore di calcio ci consentirà di rilevare cambiamenti simultanei nel calcio intracellulare presinaptico. Per iniziare anestetizzare un animale adulto del peso di circa 150 grammi iniettando 75 mil di soluzione isotonica di cloruro di magnesio, fissare l'animale anestetizzato a un piatto ricoperto di cera, quindi usando una pinza grossolana e forbici, praticare un'incisione nel piede dell'animale ed esporre la massa buccale.

Il ganglio buccale si trova sul lato ventrale della massa buccale ed è costituito da due emigangli collegati. Contiene diverse centinaia di neuroni che, insieme ai neuroni di altri gangli, contribuiscono alla generazione e al controllo del comportamento alimentare dell'animale. Libera con cura il ganglio tagliando tutti i nervi piegati con forbici sottili e rimuovilo dall'animale.

Quindi appuntare il ganglio liberato alla base di un piatto rivestito di protezione del sil riempito con acqua di mare artificiale. Il ganglio è avvolto in una guaina di tessuto connettivo, che deve essere rimossa per esporre i singoli neuroni. Usa una pinza di verifica, forbici dell'iride e un'estrema cura per tagliare questa guaina.

Per evitare di danneggiare i neuroni, stabilizzare il ganglio della guaina con perni di circa 15 minuti poiché qualsiasi movimento sarà problematico durante l'imaging. Per preparare gli elettrodi affilati per la registrazione intracellulare e l'iniezione del colorante, tirare il tubo capillare con un estrattore di micro elettrodi. Utilizziamo filamento a parete sottile in vetro silicato boa con un diametro esterno di un millimetro.

Gli elettrodi di registrazione dovrebbero avere una resistenza di circa 10 mega quando riempiti con acetato di potassio a tre molari, quindi regoliamo l'estrattore di conseguenza per riempire gli elettrodi D. Immergere la parte posteriore dell'elettrodo estratto in una soluzione da 10 millimolari dell'azione capillare del colorante arancione calcio lungo il filamento di vetro all'interno dell'elettrodo attirerà il colorante nella punta, quindi riempire nuovamente l'elettrodo con 200 millimolari di cloruro di potassio per garantire un buon contatto elettrico. Utilizziamo un Bela costruito su misura per migliorare le proprietà dell'elettrodo e abbassare la resistenza dell'elettrodo di registrazione a circa cinque mega.

L'elettrodo è tenuto a un angolo di 45 gradi in un flusso di una sospensione di ossido di alluminio. La miscelazione del cloruro di sodio nella sospensione e il collegamento di un misuratore di sodio consentono di monitorare la resistenza dell'elettrodo. Durante il processo di smussatura, trasferiamo la capsula contenente i gangli della fibbia ingannati su un impianto di elettrofisiologia e localizziamo i neuroni di interesse impalandoli con elettrodi e verificandone l'identità.

Per preparare il neurone per l'imaging del calcio, inseriamo prima un elettrodo riempito di colorante nella cellula soma e carichiamo teoricamente l'elettro colorante con 30 minuti di impulsi di corrente iperpolarizzanti da 15 nano ampere. Quando l'arancio calcio D entra nella cellula, il SOR acquisirà un colore rosa tenue. Quindi ritraiamo con cura gli elettrodi di registrazione e lasciamo riposare la preparazione per almeno 30 minuti per consentire al colorante di diffondersi nei processi fini del neurone.

Quindi, trasferire il piatto con la preparazione in un microscopio fluorescente. Utilizziamo una lente a immersione in acqua 10 volte NA 0,3 su un microscopio verticale a tavolino fisso, che mette a fuoco spostando la lente e non il tavolino. In questo modo è più facile montare i manipolatori.

Per gli elettrodi di registrazione selezionare un blocco filtro appropriato. Un blocco di tre filtri SI fornirà i filtri di eccitazione ed emissione corretti per l'arancio calcio, regolerà i parametri della fotocamera e l'intensità dell'illuminazione con filtri a densità neutra e l'apertura del campo. Più luce si tradurrà in meno rumore, ma può potenzialmente sbiancare la preparazione.

La fotocamera CCD a scatto freddo è in grado di catturare un campo di 500 x 300 pixel a un frame rate di circa 30 fotogrammi al secondo e un buon rapporto segnale/rumore. Ridurre al minimo l'illuminazione dei neuroni del foglio mantenendo l'otturatore delle sorgenti luminose chiuso quando possibile. Nel software di imaging, selezionare le regioni di interesse o R ois.

Queste regioni definiscono dove il software effettuerà le misurazioni dell'intensità. Generalmente immaginiamo i rami primari, secondari e terziari del neurone presinaptico. Posiziona un ROI aggiuntivo accanto al neurone difi per ottenere un valore di sfondo che viene successivamente sottratto da tutti gli altri punti dati.

Gli elettrodi di registrazione intracellulare nei neuroni pre e post sinaptici vengono utilizzati per indurre e monitorare la trasmissione sinaptica. È possibile garantire la sincronizzazione tra l'acquisizione dei dati elettrofisiologici e di imaging se si utilizza il segnale di trigger frame out della fotocamera per avviare il software di acquisizione dati. Un altro modo per garantire la sincronizzazione è montare un LED all'interno della porta della fotocamera.

Questo LED si accende brevemente all'inizio della sessione di registrazione e fornisce quindi un segno di sincronizzazione. Durante un tipico esperimento, si innescano potenziali d'azione nel neurone presinaptico mediante l'iniezione di brevi impulsi di corrente. In questo esempio, mostriamo un'esplosione di picchi e i corrispondenti aumenti del segnale del calcio per testare ipotesi specifiche.

Il segnale del calcio può essere manipolato e gli effetti sulla trasmissione sinaptica possono essere determinati. Ad esempio, farmaci come il chelante del calcio EGTA possono essere iniettati presinapticamente o applicati attraverso il sistema di perfusione. I dati vengono analizzati esportandoli dal software di imaging in un file di testo e poi nel software che è stato utilizzato per acquisire i dati elettrofisiologici, che nel nostro caso è spike two di Cambridge Electronic Design.

Utilizziamo uno script scritto su misura per tracciare i valori di intensità del ROI e le corrispondenti variazioni del potenziale di membrana, quantifichiamo le variazioni del segnale di calcio sottraendo il segnale di fondo ottenuto dal ROI di fondo e calcolando la variazione relativa con l'equazione mostrata. F zero è la fluorescenza appena prima della stimolazione e F è la fluorescenza durante la stimolazione. Qui mostriamo i risultati di un esperimento in cui abbiamo ripreso i cambiamenti nella fluorescenza del calcio nel neurone B 21 identificato.

La regione che abbiamo ripreso è indicata in A, in B uno, abbiamo indotto un burst di picchi in B 21, che ha indotto potenziali postsinaptici in B otto e un cambiamento nel segnale del calcio. B due mostra l'effetto dell'iniezione del chelante del calcio. I picchi di EGTA in B 21 non inducono più aumenti diffusi della fluorescenza del calcio e l'ampiezza del potenziale postsinaptico è diminuita.

In conclusione, abbiamo dimostrato tecniche che possono essere utilizzate per monitorare contemporaneamente la concentrazione intracellulare di calcio e valutare l'efficacia della trasmissione sinaptica. Queste tecniche richiedono solo un'attrezzatura modesta rispetto alla maggior parte dell'imaging funzionale e sono facili e veloci da imparare.