Ottimizzato Analisi della metilazione del DNA e l'espressione genica da piccole aree anatomicamente definiti del cervello

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare il DNA. La metilazione e l'espressione genica cambiano in seguito allo stress precoce della vita. Ciò si ottiene sottoponendo prima i cuccioli di topo appena nati alla separazione materna per indurre lo stress della prima infanzia come seconda fase aree cerebrali di interesse qui, i PVN sono ottenuti mediante micro dissezione in loco e il DNA e l'RNA sono isolati contemporaneamente da un singolo punzone tissutale.

Successivamente, il DNA ottenuto viene trattato con solfito e la regione di interesse viene amplificata mediante PCR con bi solfito. Questo viene poi legato in un vettore e trasformato in batteri. Le trasformazioni riuscite sono identificate dall'espressione del marcatore e dalla dimensione del frammento PCR.

Infine, il sequenziamento del bisolfuro viene utilizzato per valutare lo stato di metilazione. Il vantaggio principale di questo flusso di lavoro è che consente una comoda analisi della programmazione epigenetica in risposta a stimoli ambientali. Questo metodo può fornire informazioni sulla programmazione epigenetica in base alle avversità della prima infanzia.

Può essere applicato anche ad altri sistemi. Ovunque la metilazione e l'espressione genica siano analizzate in ambienti altamente specifici per i tessuti e ovunque la disponibilità di tessuto sia limitata per indurre stress precoce. La separazione materna viene eseguita sui cuccioli da gravide cronometrate C 57 nere sei N madri per influenzare la separazione materna.

Trasferisci ogni cucciolata in una gabbia riscaldata e pulita per tre ore al giorno dal primo al decimo giorno dopo la nascita, lasciando indisturbati i cuccioli di controllo non stressati. A parte la separazione di tre ore, tutte le cucciolate vengono lasciate con le loro madri fino allo svezzamento del 21° giorno postnatale. Quindi i cuccioli vengono alloggiati in gruppi di sesso abbinato, da tre a cinque topi per gabbia in condizioni di stabulazione standard per avviare la raccolta del tessuto cerebrale, i cervelli dei topi vengono rimossi dai crani e immediatamente congelati in ghiaccio secco isop e conservati a meno 80 gradi Celsius.

Quando sei pronto per raccogliere i pugni di tessuto, rimuovi i cervelli dal congelatore a meno 80 gradi e mettili su ghiaccio secco. Inizia con la criosezione del cervello in sezioni coronali di 10 micron dal rostrale al coccolare. Montare le sezioni su vetrini super frost e asciugarle per la colorazione viola cresta.

È possibile prelevare ulteriori vetrini e conservarli a meno 20 gradi per ulteriori analisi, come l'ibridazione in situ di due. Quando sei pronto a prendere i pugni, colora i vetrini con il viola crestale per identificare le strutture cerebrali di interesse. Quindi, utilizzando un ago da punzonatura, prelevare punzoni da 0,8 millimetri delle regioni di interesse utilizzando la microdissezione in loco.

I punzoni devono essere conservati a meno 80 gradi Celsius. È di fondamentale importanza che il micro punching venga eseguito in modo standardizzato poiché l'espressione genica e la metilazione sono altamente specifiche del tessuto. Omogeneizzare i punzoni in 400 microlitri di tampone tiocianato di qadio utilizzando una pipetta, quindi agitare a temperatura ambiente.

Quindi, passare il lisato risultante attraverso una siringa da 29 gauge. Più volte il punzone non dovrebbe essere più visibile. Dividere il lisato in parti uguali.

Uno per elaborare l'RNA, che dovrebbe essere fatto per primo e l'altro per elaborare il DNA, che può essere conservato a temperatura ambiente fino a quando l'RNA non viene elaborato per la purificazione dell'RNA a un decimo volume di acetato di sodio, un volume di acquafenolo e un mezzo volume di 24 a un vortice di cloroformio a isoamile AML. Mescolare energicamente dopo ogni aggiunta e incubare l'intruglio finale su ghiaccio per 10 minuti. Quindi centrifugare il composto.

Raccogli la fase acquosa e aggiungi un volume uguale di etanolo al 70%. Utilizzando un kit di colonne di spin dell'RNA. Eseguire una digestione del DNA su colonna e lavare l'RNA in 25 microlitri di acqua.

Ora purificare il DNA utilizzando un protocollo di kit modificato per includere l'aggiunta di una digestione di RN a e per riscaldare il tampone eluciano e la colonna eluciana a 70 gradi Celsius prima del loro utilizzo. 10 minuti a 70 gradi Celsius sono sufficienti per le colonne. Infine, utilizzare uno spettrofotometro per determinare le concentrazioni di DNA e RNA.

Un tipico punch PVN produce circa 600 nanogrammi di DNA e circa 400 nanogrammi di RA messi da parte, circa 100 nanogrammi di RNA per l'analisi dell'espressione genica mediante PCR quantitativa prima dell'amplificazione da solfito. Trattare 200 nanogrammi di DNA isolato con un kit disponibile in commercio per amplificare il DNA dalle regioni metilate. Ordina primer progettati specificamente per il DNA convertito con bisolfito La progettazione ottimale del primer nella bi PCR è essenziale poiché la qualità e la specificità dell'amplicone PCR determinano il successo delle fasi successive.

Quando arrivano gli inneschi, determina la loro temperatura ottimale e in ginocchio con esperimenti pilota. Utilizzare due microlitri di DNA trattato con bis solfito come modello per ogni 25 microlitri. Miscela PCR.

Amplificare la miscela iniziando con una denaturazione di sei minuti a 95 gradi Celsius, seguita da 45-50 cicli di amplificazione prima di un allungamento finale di cinque minuti a 72 gradi Celsius. Analizzare sette microlitri del prodotto PCR mediante elettroforesi su gel Agros per verificare le dimensioni dell'amplicona. Purificare il prodotto PCR rimanente per la successiva legatura utilizzando un kit di pulizia PCR disponibile in commercio.

Se si ottengono prodotti PCR indesiderati, utilizzare la purificazione in gel per isolare il prodotto di interesse per questo protocollo. Viene utilizzato un kit di clonazione commerciale. L'efficienza della clonazione dipende in modo critico dall'inserto.

Quindi, se si ottiene ripetutamente un numero basso di cloni ricombinanti, provare un vettore di clonazione diverso. Impostare una reazione di legatura da 10 microlitri con un microlitro di vettore e tre microlitri di prodotto PCR purificato. Mescolare la reazione mediante pipettaggio e incubarla per una notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo.

Eliminare la reazione di legatura mediante la classica precipitazione con etanolo e trasformare i batteri con il prodotto. Aggiungere un millilitro di terreno SOB di preriscaldamento subito dopo l'erogazione dell'impulso e trasferire i batteri trasformati in una provetta di reazione. Dopo aver recuperato i batteri per un'ora a 37 gradi Celsius, stendere 100 microlitri di ciascuna sospensione su una piastra di ampicillina LB rivestita con IPTG.

Xal incuba le piastre durante la notte, una volta che le colonie possono essere raccolte. Impostare le reazioni di PCR di colonie da 25 microlitri in una piastra a 96 pozzetti utilizzando tre microlitri di cloruro di magnesio da 2,5 millimolari in ciascuna reazione. Prelevare i cloni bianchi positivi con la punta di una pipetta e trasferirli in una miscela PCR con una semplice immersione.

Iniziare la PCR con un ciclo di fusione di quattro minuti. A seguire 10 cicli di amplificazione con una temperatura di 56 gradi Celsius. Ogni fase di questi cicli dura 30 secondi.

Quindi diminuire la temperatura di ealing a 48 gradi Celsius per altri 30 cicli di amplificazione. Termina con un ciclo di allungamento di cinque minuti. Ora carica cinque microlitri di ogni prodotto su un gel aros e identifica le reazioni che contengono l'inserto della giusta dimensione.

Utilizzare un kit disponibile in commercio per ripulire i prodotti PCR di interesse in modo che possano essere sequenziati utilizzando il sequenziamento ciclico del terminatore di grande colorante. In una piastra da 96 pozzetti, caricare i pozzetti con tre microlitri di grande miscela master di reazione DI, seguiti da due microlitri di prodotto PCR di colonia ripulita. Esegui la reazione su un termociclatore iniziando con un minuto a 96 gradi Celsius, seguito da 35 cicli di 10 secondi a 96 gradi Celsius, cinque secondi a 50 gradi Celsius e quattro minuti a 60 gradi Celsius.

Al termine della reazione del dado grande, pulire la reazione utilizzando una piastra di purificazione del dado grande. Dopo aver ottenuto le sequenze, analizzarle utilizzando il big analyzer online o lo strumento B-I-S-M-A per derivare il modello di metilazione della regione del DNA indagata per ottenere informazioni sull'influenza dello stress precoce o dell'ELS sull'espressione di un VP e sullo stato di metilazione. I bastoncini neri e i topi C 57 sono stati processati secondo il protocollo descritto, il nucleo paraventricolare e il nucleo sopraottico sono stati perforati per isolare il DNA e R-N-A-D-N-A è stato trattato con bi solfito, amplificato con primer specifici per l'enhancer a VP e i prodotti PCR sono stati clonati e sequenziati almeno 20 cloni ricombinanti da ciascun topo.

PCR è stata analizzata per determinare le frequenze di metilazione per i CPG contenuti nell'amplicone della PCR nel tessuto del P-V-N-E-L-S ha indotto una significativa ipometilazione in quattro posizioni sull'enhancer A VP, suggerendo la marcatura epigenetica di questa regione regolatoria attraverso esperienze di vita precoce. A differenza della metilazione PVN dell'enhancer A VP non è stata influenzata da ELS nel SON, illustrando la specificità tissutale dell'effetto epigenetico negli animali di controllo, lo stato di metilazione del DNA a CPG 10 era correlato negativamente con un'espressione genica VP che indicava un ruolo della metilazione del DNA nella regolazione fine dell'espressione di un gene VP. Seguendo questa procedura, altri metodi come l'UPCR possono essere facilmente eseguiti sull'RNA isolato per rispondere a ulteriori domande come i cambiamenti di espressione genica nel tessuto analizzato.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come studiare i cambiamenti di metilazione del DNA in risposta a stimoli ambientali o dipendenti vissuti.