Name: Ottimizzato Analisi della metilazione del DNA e lespressione genica da piccole aree anatomicamente definiti del cervello (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 11 s
Description: Scopri un protocollo ottimizzato per analizzare la metilazione del DNA e l'espressione genica in aree specifiche del cervello di topi neonati sottoposti a stress precoce. Questo metodo consente l'isolamento simultaneo di DNA e RNA da punch tessutali per studiare la programmazione epigenetica.

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Questo lavoro è stato finanziato dal Max Planck Institute of Psychiatry e l&#39;Unione europea Marie Curie Initial Training Network (NINA Contract 238665).

1. Programmazione dalle avversità Vita in anticipo Separazione materna (MS) viene eseguita per indurre fasi di vita stress (ELS) in cuccioli forniti da timed-gravidanza topi C57BL/6N giorno dopo la nascita (0 (P0) il giorno di nascita). <ol><li> Cucciolate individuali vengono messi in gabbie pulite (con pad riscaldamento) per 3 ore tutti i giorni dalle P1-10. </li><li> Di controllo (non-ELS) cuccioli rimangono indisturbati nel nido materno in tutto. </li><li> Pups sono mantenuti con le loro madri fino allo svezzamento (P21), dopo di che sono alloggiati in gruppi sesso trovati (3-5 topi per gabbia) in condizioni standard di laboratorio di ricovero per animali. </li></ol> 2. L&#39;isolamento e la dissezione del tessuto cerebrale <ol><li> I topi vengono uccisi in età desiderati dalla nota dislocazione cervicale:. Perché questo protocollo comporta un paradigma di stress, senza anestesia viene data prima dislocazione cervicale, per evitare di interferire con la normale regolazione fisiologica degli ormoni dello stress. Skulls sono aperti ecervelli sono attentamente rimossi e immediatamente snap-congelato mediante immersione in ghiaccio-iso-pentano secco, prima di essere conservati a -80 ° C. </li><li> I cervelli sono cryosectioned (10 um di spessore); sezioni sono montati su vetrini SuperFrost e mantenuta a -20 ° C. Riferimento a un mouse standard stereotassico atlante (es Paxinos 6) è utilizzato per verificare la precisione anatomica e per garantire l&#39;inclusione della regione di interesse (ad esempio per neuroni nel nucleo paraventricolare - PVN - raccogliere sezioni a partire dal livello della rostrale PVN, bregma -0,75 a -0,85). </li><li> Le sezioni sono colorate con violetto cresolo per facilitare l&#39;identificazione delle strutture cerebrali diverse. Punzoni (0,8 mm) delle regioni di interesse (ad es PVN) sono ottenuti in microdissezione loco. </li></ol> 3. Estrazione Nucleic Acid dai punzoni del cervello Un protocollo ottimizzato per assicurare al contempo l&#39;estrazione del DNA e l&#39;RNA dalla piccola neuroanatomicamente definita del cervello regioni bisolfito per analisi di espressione genica ed è descritta 7. Nota: Considerando che l&#39;RNA è meno stabile del DNA nel GTC-Buffer, si consiglia il trattamento di RNA prima. L&#39;omogenato utilizzato per la purificazione del DNA può essere conservato a temperatura ambiente (RT) durante quel tempo. <ol><li> Omogeneizzare punzoni con una pipetta e vortex in 400 pl di guanidinio tiocianato (GTC) tampone (4,5 M tiocianato di guanidinio, 2% N-lauroylsarcosine, 50 mM EDTA pH 8,25 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M beta-mercaptoetanolo, 0,2% antischiuma A) a RT, passando più volte attraverso una siringa ipodermica (29G) (Figura 2). </li><li> Dividere lisato in parti uguali, sia RNA che DNA può essere estratto contemporaneamente o separatamente, a seconda dei particolari esigenze sperimentali. </li><li> Per purificazione dell&#39;RNA aggiungere volume 1/10 di NaOAc, 1 AquaPhenol volume (Appligene) (pH 4) e volume 1/2 di cloroformio: isoamilico (24:1) di lisato. Energicamente dopo ogni passo eincubare su ghiaccio per 10 min, centrifuga (20 min a 10.000 g a 4 ° C); aggiungere un volume equivalente di 70% EtOH alla fase aequous. </li><li> Trasferire miscela a una colonna di spin RNA (ad esempio Nucleospin RNA II da Macherey-Nagel) ed eseguire on-column DNasi-digestione ed i lavaggi (seguire il protocollo di fabbricazione); eluire RNA in 25 microlitri H 2 O. </li><li> Per la purificazione del DNA di un protocollo ottimizzato del Sangue Qiagen DNeasy e Kit viene utilizzato il tessuto. Equilibrare lisato con volumi uguali di Buffer AL e EtOH al 100%, il carico su una centrifuga Spin Column (1 min a 10.000 g a temperatura ambiente) ed eliminare flow-through. </li><li> Aggiungere 500 pl tampone AW1 cui 5 pl RNAsi (1 mg / ml) a colonna e incubare 10 minuti a RT. Spin (1 min a 10.000 g, RT) ed eliminare flow-through. </li><li> Lavare la colonna con 500 microlitri AW2 Buffer, scartare flow-through e lo spin-dry colonna vuota (1 min a 15000 g). </li><li> Aggiungi preriscaldato (70 ° C) Buffer AE e le colonne incubare per 10 min a 70 ° C. Eluire mediante centrifugazione (1 min, 10.000 g), si applicano re-flow-through e ripetere fase di centrifugazione. </li></ol> Utilizzare uno spettrofotometro per determinare concentrazioni di DNA e RNA. Un tipico PVN punzone rese ~ 600 ng del DNA e RNA ~ 400 ng. Per l&#39;analisi dell&#39;espressione genica mediante PCR quantitativa (qPCR), si utilizzano in genere ~ 100 ng di RNA nella reazione di trascrizione inversa. 4. Bisolfito di conversione Bisolfito di sodio è usato per convertire i non-metilati cytosines a uracils. Al contrario, citosine metilate sono protetti dalla conversione. Di conseguenza, tutte cytosines che vengono rilevati nella sequenza finale del bisolfito PCR-amplicone rappresentano cytosines metilati. Conversione bisolfito provoca sostanziale degradazione del DNA che può essere un fattore limitante nella analisi PCR. Condizioni di reazione di conversione ottimizzati che massimizzano la citosina, ridurre la frammentazione del DNA e mantenere DNA a singolo filamento, anche a basse temperature può essere raggiunto utilizzandoBisolfito Qiagen Kit EpiTect. Nelle nostre mani ~ 200 ng di DNA purificato da micropunches fornire una quantità sufficiente di materiale di partenza per la reazione bisolfito. Per evitare differenze di efficienza della reazione di conversione, la quantità di DNA stampo deve essere mantenuta costante tra tutti i campioni esaminati durante un esperimento. Inoltre, la sequenza si legge dovrebbe essere esaminata per l&#39;efficienza di conversione esaminando il tasso di non-convertiti non-CpG. Tale tasso dovrebbe superare il 98%. I valori più bassi indicano la conversione bisolfito incompleta o inefficace e le sequenze sottostanti dovrebbero essere esclusi dall&#39;analisi. 5. Bisolfito PCR <ol><li> Bisolfito design sequenza primer specifici per DNA bisolfito convertito (vedi la discussione); Methyl Primer Express software ( <a href="https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&amp;catID=602121" target="_blank">https://products.appliedbiosystems.com/ab</a>/ En / US / adirect / ab? Cmd = catNavigate2 &amp; catid = 602121) sarà di aiuto questo e contribuiscono a determinare ottimali temperature di ricottura in esperimenti pilota. </li><li> Preparare-PCR Master-Mix (per una reazione) come segue: 2,5 microlitri tampone PCR 10x 0,5 pl 10 mM dNTPs 1 pl 10 pM innesco in avanti 1 pl 10 pM primer reverse 0,125 ul Qiagen Hotstart Taq Plus. riempire fino a 23 microlitri con H 2 O </li><li> Aggiungere 2 microlitri bisolfito trattato con DNA a reazione. </li><li> Amplificare utilizzando le seguenti condizioni: 1 ciclo 6 min 95 ° C 45-50 cicli di 1 minuto a 95 ° C, 1 minuto a temperatura di ricottura ottimale, 1 min a 72 ° C 1 ciclo 5 min 72 ° C </li></ol> Analizzare 7 microlitri di prodotto di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio per verificare dimensione dell&#39;amplicone e purificare rimanente reazione di PCR per la legatura successiva utilizzando un commercialmente disponibile PCR clean-up kit (ad esempio Macherey-NaNucleospin gel estratto). In caso ulteriori prodotti indesiderati PCR sono ottenuti, purificazione gel è raccomandato. 6. Bisolfito Sequencing Ad alta risoluzione profili di metilazione del DNA dedotte dalle letture singolo clone in grado di rilevare piccole variazioni di metilazione del DNA e identificare le regioni normative che sono sensibili al trattamento (programmazione ambientale). Il processo di sequenziazione bisolfito comprende tre fasi successive di lavoro. In primo luogo, i prodotti PCR ottenuti da bisolfito prima PCR sono ligati in un vettore e trasformati in batteri. In secondo luogo, colonia PCR da cloni singoli viene impiegata per determinare la dimensione corretta dell&#39;inserto. In terzo luogo, PCR delle colonie positive sono ripuliti e sottoposti a Big-Dye reazione di sequenziamento. Dopo un clean-up passo, i prodotti sono ad elettroforesi su un sequenziatore capillare. 6,1 Ligation e trasformazione Nota: di routine utilizzare il pGEM-T vector cloning kit (Promega). Nella nostra esperienza, l&#39;efficienza di clonazione dipende criticamente l&#39;inserto di essere legato. Differenti vettori devono essere testati in caso basso numero di cloni ricombinanti sono ripetutamente ottenuti. <ol><li> Impostare reazione di ligazione: Buffer 5 pl Ligation 2x 1 pl pGEM-T Vector 1 pl-T4 ligasi 3 pl ripulito PCR prodotto </li><li> Mescolare reazione pipettando e incubare durante la notte a 4 ° C. Nota: legatura può anche essere eseguita per 1 ora a RT pure. Per aumentare il numero di cloni ricombinanti, oltre ligazione notte a 4 ° C è preferito. </li><li> Pulire-up di prodotti legatura di precipitazione con etanolo: <ol class="lalpha"><li> Aggiungere 1 glicogeno pl, 1 pl 3M NaAc ed EtOH 25% a 100 pl la reazione di ligazione e precipitato per 1 min in azoto liquido. </li><li> Centrifugare (15,0000 g per 30 min a 4 ° C) e scartare surnatante. </li><li> Lavare con 300 ml70% EtOH e centrifugare (15.000 g per 20 minuti a 4 ° C), il surnatante e secco pellet a RT (10 min). </li><li> Risospendere il pellet in 10 microlitri H 2 O. </li></ol></li></ol> 6,2 Trasformazione dei prodotti di ligazione in batteri elettrocompetenti <ol><li> Preraffreddare cuvette di elettroporazione (1 mm di larghezza) su ghiaccio e aliquota del disgelo elettrocompetenti batteri DH5alfa su ghiaccio. </li><li> Aggiungi 45 pl batteri DH5alfa a 10 microlitri ripulito legatura del prodotto (vedi sopra) e trasferimento in cuvetta. </li><li> Trasforma i batteri a 1,5 kV, 200 Ω, 15 uF e aggiungere 1 ml di terreno SOB preriscaldato direttamente dopo la consegna del polso. </li><li> Recupero batteri per 1 ora a 37 ° C, diffusione 100 pl di sospensione su piastre LB / ampicillina rivestite con IPTG / X-Gal. </li><li> Incubare le piastre per una notte a 37 ° C. </li></ol> 6,3 Colony PCR Nota: Colony PCR da singoli cloni vengono effettuati per garantire che gli inserti sonodi dimensione prevista. Lo sviluppo del colore ritardata dallo screening blu / bianco, eventi di ricombinazione indesiderati durante la legatura, l&#39;incorporazione di coppie di primer oligomeriche o troncato prodotti di PCR potrebbero altrimenti portare a risultati di sequenziamento difettosi. Noi abitualmente uso T7 e SP6 primers per amplificare inserti clonati, questo approccio si traduce in sequenze vettoriali supplementari di circa 150 bp. Primer T7 viene utilizzato nella reazione di sequenziamento in un passaggio successivo. <ol><li> Impostare colonia di reazione PCR in piastra a 96 pozzetti. Per usare una reazione: 3 pl 2,5 mM MgCl 2 2,5 microlitri di buffer Taq 10x 1,5 microlitri 10 mM dNTP 2 microlitri 2,5 mM T7 innesco 2 microlitri 2,5 mM SP6 innesco 1 pl Fermentas Taq Polymerase riempire fino a 25 pl con H 2 O </li><li> Pipettare 25 pl / pozzetto di master mix in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. </li><li> Scegli positivo (bianco) clone dalla piastra con la punta della pipetta e tuffo in una reazione PCR. </li><li> Amplificare utilizzando Folle condizioni seguenti: 1 ciclo 4 min a 95 ° C 10 cicli di 30 sa 94 ° C, 30 s a 56 ° C e 30 s a 72 ° C 30 cicli di 30 sa 94 ° C, 30 s a 48 ° C e 30 s a 72 ° C 1 ciclo 5 min a 72 ° C </li><li> Caricare 5 microlitri di colonia PCR su un gel di agarosio e determinare reazioni che contengono la giusta dimensione dell&#39;inserto. </li><li> PCR Colony contenenti gli ampliconi desiderati vengono eliminati utilizzando un kit disponibile in commercio (Machery Nagel Nucleofast). </li></ol> 6,4 Big-Dye terminator reazione e sequenziamento <ol><li> Preparare mix master per Big-Dye reazione. Per usare una reazione: 1 ml H 2 O 0,5 microlitri Big-Dye reagente 1,5 microlitri di buffer Sequencing </li><li> Erogare 3 pl / pozzetto in ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, aggiungere a ciascun pozzetto 2 microlitri del prodotto colonia ripulito PCR ed eseguire la reazione in un termociclatore con i seguenti parametri: 35 cicli di 10 s a 96 ° C, 5 s a 50 ° C e 4 minuti a 60 ° C </li><li> Il Big-Dye reazione viene pulito usando un kit commerciale (Millipore Montage 96 Sequencing Clean-Up Kit) ed elaborati in un sequencer capillare (ad esempio, ABI 3100 DNA). </li><li> Le sequenze vengono analizzati utilizzando l&#39;analizzatore Biq ( <a href="http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/" target="_blank">http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/</a> ) o lo strumento online Bisma ( <a href="http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/" target="_blank">http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/</a> ) derivare la configurazione di metilazione della regione del DNA studiato (Figura 4). </li></ol> 7. Risultati rappresentativi Al fine di conoscere l&#39;influenza delle ELS sull&#39;espressione Avp e lo stato di metilazione, i topi C57BL/6N sono stati elaborati in base al flusso di lavoro sopra descritto. Brevemente, un gruppo di topi C57BL/6N era subjected al ELS, mentre il gruppo di controllo è stato lasciato indisturbato. Il PVN e il nucleo supraoptic (SON) sono stati pugni e DNA e RNA sono stati isolati contemporaneamente da i colpi singoli. RNA è stato inversamente trascritto ed i livelli di trascritti avp sono state misurate mediante analisi qPCR e normalizzato per l&#39;espressione di geni housekeeping HPRT e GAPDH. DNA è stato trattato bisolfito, amplificata con primer specifici per l&#39;enhancer Avp (Figura 4a) ed i prodotti di PCR sono stati clonati e sequenziati. Almeno 20 cloni ricombinanti da ciascun topo / PCR sono stati analizzati per determinare le frequenze di metilazione per i CpG contenute nel PCR (Figura 4b). Rispetto ai controlli, ELS ha indotto un significativo ipometilazione CpG10, CpG12, CpG13 e Cpg14 del enhancer Avp (p &lt;0.05, n = 6-8 animali) suggerisce la marcatura epigenetica di questa regione regolatrice fino ai primi di esperienze di vita. In contrasto con la metilazione PVN, dil&#39;enhancer Avp è stata influenzata dalla ELS nella specificità SON illustrare tessuto di marcatura epigenetica (Fig. 4c). Analisi dello stato di metilazione del DNA in CpG10 e Avp espressione genica in animali di controllo (n = 6) hanno evidenziato una correlazione negativa che punta ad un ruolo della metilazione del DNA nel fine-tuning di espressione del gene AVP (Figura 4d). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig1.jpg" /> Micropunches Figura 1. Sono ottenute da cervelli sezionati dal controllo e topi stressati precoce della vita. A seguito di DNA e RNA isolamento, l&#39;espressione genica è determinato dal qRT-PCR mentre il DNA bisolfito trattata viene amplificato e prodotti purificati vengono clonati in un vettore adatto di identificazione che permette di cloni ricombinanti da blu / bianco selezione. Dimensioni degli inserti corretti sono stati verificati dacolonia PCR prima di eseguire Big Dye-reazione e l&#39;elaborazione in sequencer capillare. Modello di metilazione sono visualizzati da strumenti software adeguati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3938/3938fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig2.jpg" /> Figura 2. Timeline dal DNA / RNA di estrazione sequenziamento bisolfito. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig3.jpg" /> Figura 3. Workflow per l&#39;estrazione simultanea di DNA e RNA. Il punzone del nucleo ipotalamico paraventricularis, un gene che esprime Avp piccola regione del cervello, viene posto in 400 microlitri tampone di GTA, vorticare fino interrotto e ulteriormente omogeneizzato passando attraverso una siringa (29G). L&#39;omogeneizzato è poi diviso per la purificazione di RNA e DNA. La divisione può essere 1:1 o di proporzioni diverse a secondasulla questione particolare sperimentale. Omogenati devono essere processati entro poche ore. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig4.jpg" /> Figura 4. Metilazione CpG a livello del locus di controllo Avp in 6 settimane e animali ELS. (A) Schema di coda Avp e geni ossitocina orientato a coda e separati dalla regione intergenica (IGR). Gli esoni sono rappresentati da open (numerati) scatole. La distribuzione dei residui CpG è indicato e dimensione e la posizione dell&#39;amplicone rispettivo PCR contenente CpG 10 a CpG14 è caratterizzato da una linea in grassetto. (B) metilazione del enhancer Avp nel PVN in animali di controllo e ELS (n = 6-8). (C) Metilazione del enhancer Avp nel Figlio di controllo e di animali ELS (n = 8-10). (D) l&#39;espressione genica Avp è stata correlatacon la metilazione a CpG10 (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3938/3938fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

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</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Programmazione epigenetica è sempre più riconosciuta come un importante meccanismo alla base della salute e della malattia. Qui vi presentiamo un metodo raffinato per l&#39;isolamento simultaneo di DNA e RNA da micropunches e le successive fasi per ottenere profili di metilazione del DNA attraverso il sequenziamento bisolfito. Il flusso di lavoro ottimizzato permette l&#39;analisi strategica della programmazione epigenetica nel cervello in risposta a stimoli ambientali. Inoltre, questo approccio facilita l&#39;indagine del rapporto funzionale tra metilazione del DNA e l&#39;espressione genica in quanto entrambi sono analizzati dallo stesso campione. Infine, il numero degli animali necessari per l&#39;esperimento può essere significativamente ridotta. Alcune precauzioni e le linee guida dovrebbero essere seguite durante l&#39;esecuzione del flusso di lavoro presentato. Considerando la straordinaria complessità ed eterogeneità del cervello e dal modello di metilazione e di espressione possono variare in una cellula e tessuto modo specifico è di estremaimportanza che micropunching viene eseguita in maniera standard. Come un esempio, programmazione epigenetica di AVP viene rilevato nella paravaventriuclar, ma non nel nucleo supraoptic (Figura 4b-d), due Avp esprimendo regioni dell&#39;ipotalamo 4. A tale riguardo, la disponibilità di DNA e RNA dal punzone stesso tessuto è vantaggioso come espressione di RNA di alcuni geni marcatori specifici del tessuto può essere utilizzato in alcuni casi per certificare che l&#39;area corretta è stato punzonato. Anche se micropunching in grado di ridurre l&#39;eterogeneità cellulare, va ricordato che questo approccio non comporta l&#39;isolamento di tipi di cellule singole o popolazioni. Ulteriori fasi di depurazione potrebbe essere considerato per affrontare questo argomento. Per bisolfito sequenziamento design ottimale per il trattamento primer di amplificazione PCR seguente bisolfito è essenziale. I prodotti di PCR superiori a 400 bp di lunghezza può essere problematico a causa della degradazione del DNA da parte bisulfite trattamento. Va inoltre rilevato che nested PCR può dare risultati distorti se solo alcuni modelli intatte contribuire al processo di amplificazione. Paia di primer specifici per l&#39;amplicone modificata può essere progettata; loro sequenze non dovrebbe contenere dinucleotidi CpG per evitare metilazione-polarizzato amplificazione. Inoltre, primer dovrebbe contenere non-CpG citosine per impedire l&#39;amplificazione del DNA non modificato o non completamente convertito. Amplificazione di alcuni modelli possono beneficiare di condurre Hot-start PCR. In ogni caso, l&#39;idoneità di coppie di primer devono essere verificate in esperimenti pilota in modo da impedire il deterioramento del valore campioni sperimentali. Bisolfito di sequenziamento rappresenta un metodo standard per sito-specifica analisi metilazione quanto è in grado di rilevare in modo affidabile e preciso la metilazione di residui singoli CpG in un allele-specifico maniera 8. Sequenziamento diretto del prodotto PCR non è consigliabile come metilazione o mistafa i residui CpG apparirà come un C / T doppio picco nel elettroferogramma, che può impedire la quantificazione di metilazione nel sito in questione. Per questo motivo una fase intermedia clonazione è condotta e sono diversi cloni sequenziati (~ 20-30) per determinare il grado di metilazione. Pyrosequencing rappresenta un metodo alternativo per quantificare metilazione del DNA. Si utilizza anche la conversione bisolfito e bisolfito di PCR, ma invece di clonazione e il sequenziamento del amplicone viene sottoposto ad una reazione di pirosequenziamento diretta in cui viene letto lo stato di metilazione di un residuo CpG come C / T polimorfismo di singolo nucleotide, che può essere facilmente quantificato. Entrambi i metodi di rilevare livelli simili di metilazione 9 ma poiché la clonazione-passo può essere omesso pirosequenziamento tempo è più efficiente. Tuttavia, a seconda del modello solo 40-100 nucleotidi possono essere sequenziati in volta in modo che vari cicli di pirosequenziamento con primer sequenziamento differenti sono necessarie. Questa è una limitazione critica, data that quantità superiori di DNA (circa 1 mg per reazione) sono obbligatori, che prevedibile superare gli importi disponibili da punzoni piccoli tessuto cerebrale. Così la scansione iniziale delle regioni della gamma di chilobasi diverse da pirosequenziamento appare meno adatto come lettura singolo clone. Tuttavia, a seguito identificazione di una piccola regione di interesse pirosequenziamento dovrebbe essere considerato. Collettivamente, il protocollo sopra descritto prevede un approccio preciso, efficiente e semplificato per l&#39;analisi rapida e conveniente di micropunches cerebrali per le modifiche epigenetiche. Campioni multipli possono essere trattati in un unico passaggio e le modalità sono adatti quando si esegue campioni di dimensione intermedia esperimenti.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Sangue DNeasy e kit di tessuti </td><td> Qiagen </td><td> 69506 </td></tr><tr><td> Nucleospin RNA II </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740.955,50 </td></tr><tr><td> Epitect Kit bisolfito </td><td> Qiagen </td><td> 59104 </td></tr><tr><td> Estratto Nucleospin </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740.609,50 </td></tr><tr><td> pGEM-T vettore di clonazione Kit </td><td> Promega </td><td> A3600 </td></tr><tr><td> Nucleofast 96 </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 743.100,50 </td></tr><tr><td> Montage 96 Sequencing Clean-Up </td><td> Millipore </td><td> LSK09624 </td></tr><tr><td> Hotstar Taq polimerasi </td><td> Qiagen </td><td> 203203 </td></tr><tr><td> Taq polimerasi </td><td> Fermentas </td><td> EP0401 </td></tr></tbody></table>

ottimizzato analisi della metilazione del dna e l&#39;espressione genica da piccole aree anatomicamente definiti del cervello

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

L&#39;esposizione a dieta, i farmaci e le avversità primi anni di vita durante le finestre sensibili di 1,2 vita può portare a cambiamenti duraturi nell&#39;espressione genica che contribuiscono alla visualizzazione dei fenotipi fisiologici e comportamentali. Tale programmazione ambientale è destinato ad aumentare la suscettibilità alle malattie metaboliche, cardiovascolari e mentali 3,4. Metilazione del DNA e modificazioni degli istoni sono considerati i processi chiave nella mediazione del gene-ambiente di dialogo e sembrano anche alla base di programmazione ambientale 5. Nei mammiferi, la metilazione del DNA comprende tipicamente l&#39;aggiunta covalente di un gruppo metile nella posizione-5 della citosina nel contesto di dinucleotidi CpG. CpG metilazione avviene in modo altamente tessuti e cellule specifiche rende una sfida per studiare discreti, piccole regioni del cervello dove eterogeneità cellulare è alto e la quantità limitata del tessuto. Inoltre, because espressione genica di metilazione e sono strettamente legate eventi, il valore aumentato può essere ottenuto confrontando entrambi i parametri nello stesso campione. Qui, uno step-by-step protocollo (Figura 1) per l&#39;indagine della programmazione epigenetica nel cervello è presentato utilizzando il paradigma del &#39;separazione materna&#39; di avversità primi anni di vita per scopi illustrativi. Il protocollo descrive la preparazione di micropunches da cervelli dei topi differenzialmente età dai quali DNA e RNA può essere isolato simultaneamente, consentendo così la metilazione del DNA e l&#39;analisi di espressione genica nel campione stesso.

Un flusso di lavoro semplificato per studiare la metilazione del DNA e le variazioni di espressione genica su prime fasi di vita di stress viene mostrato. Partendo dalla separazione materna di topi neonati ed isolamento di tessuti cerebrali discreti, si rappresenta un protocollo per isolare simultaneamente DNA e RNA dai punzoni tessuto cerebrale per sequenziamento bisolfito successivo e RT-PCR.

Ottimizzato Analisi della metilazione del DNA e l&#39;espressione genica da piccole aree anatomicamente definiti del cervello

L'esposizione a dieta, farmaci e avversità precoci durante le finestre sensibili della vita 1,2 può portare a cambiamenti duraturi nell'espressione genica che contribuiscono a...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare la metilazione del DNA e le variazioni dell'espressione genica in seguito a stress nella prima fase della vita. Questo viene ottenuto sottoponendo innanzitutto dei topolini neonati a separazione materna per indurre uno stress precoce; successivamente, aree cerebrali di interesse, in questo caso il nucleo paraventricolare (PVN), vengono isolate mediante microdissezione in loco, e il DNA e l'RNA vengono estratti simultaneamente da un singolo campione di tessuto.Successivamente, il DNA ottenuto viene trattato con solfito e la regione di interesse viene amplificata mediante PCR con solfito. Questo prodotto viene quindi ligato in un vettore e trasformato in batteri. Le trasformazioni riuscite sono identificate mediante l'espressione del marcatore e la dimensione del frammento di PCR.Infine, il sequenziamento del solfuro di bismuto viene utilizzato per valutare lo stato di metilazione. Il principale vantaggio di questo flusso di lavoro è che consente un'analisi agevole della programmazione epigenetica in risposta a stimoli ambientali. Questo metodo può fornire informazioni sulla programmazione epigenetica indotta da avversità vissute nei primi stadi della vita.Si può applicare anche ad altri sistemi. Ogni volta che si analizzano metilazione ed espressione genica in ambienti altamente specifici per tessuto e ogni volta che la disponibilità del tessuto è limitata per indurre stress precoce nella vita. La separazione materna viene effettuata su cuccioli nati da femmine C 57 black six N gravide controllate nel tempo al fine di indurre separazione materna.Trasferire ogni nidiata in una gabbia pulita riscaldata per tre ore al giorno dal primo al decimo giorno postnatale, lasciando i cuccioli di controllo non stressati indisturbati. A parte la separazione di tre ore, tutte le nidiate rimangono con le loro madri fino allo svezzamento al giorno postnatale 21. Successivamente, i cuccioli vengono allevati in gruppi omogenei per sesso, da tre a cinque topi per gabbia, in condizioni standard di allevamento. Per avviare il prelievo del tessuto cerebrale, i cervelli dei topi vengono rimossi dai crani e immediatamente congelati nell'isopentano raffreddato con anidride carbonica solida e conservati a meno 80 gradi Celsius.Quando si è pronti a raccogliere i campioni di tessuto, rimuovere i cervelli dal congelatore a meno 80 gradi e posizionarli su ghiaccio secco. Iniziare sezionando criogenicamente i cervelli in sezioni coronali di 10 micron da rostrale a caudale. Montare le sezioni su vetrini in vetro super frosts e lasciarle asciugare per la colorazione con violetto di cresta.È possibile preparare ulteriori vetrini e conservarli a meno 20 gradi per analisi successive, come l'ibridazione in situ. Quando si è pronti per effettuare i prelievi, colorare i vetrini con violetto di cresta per identificare le strutture cerebrali di interesse. Quindi, utilizzando un ago per biopsia, prelevare campioni di 0,8 millimetri delle regioni di interesse mediante microdissezione in loco.I campioni devono essere conservati a meno 80 gradi Celsius. È di fondamentale importanza che il microforaggio venga eseguito in maniera standardizzata, poiché l'espressione genica e la metilazione sono altamente specifiche del tessuto. Omogeneizzare i campioni in 400 microlitri di buffer tiocianato di guanidina utilizzando una pipetta, quindi vortexare a temperatura ambiente.Successivamente, far passare il lisato risultante attraverso una siringa da 29 gauge. Dopo diverse passate, il punch non dovrebbe più essere visibile. Dividere il lisato in parti uguali.Uno per processare l'RNA, che deve essere eseguito per primo, e un altro per processare il DNA, che può essere conservato a temperatura ambiente finché l'RNA non viene processato per la purificazione dell'RNA mediante un decimo di volume di acetato di sodio, un volume di fenolo acquoso e metà volume di cloroformio 24:1 con isoamil alcol. Agitare vigorosamente la miscela dopo ogni aggiunta e incubare la soluzione finale sul ghiaccio per 10 minuti. Successivamente, centrifugare la miscela.Prelevare la fase acquosa e aggiungere un volume uguale di etanolo al 70%. Utilizzando un kit di colonne di centrifugazione per RNA, eseguire la digestione del DNA in colonna, quindi lavare ed eluire l'RNA in 25 microlitri di acqua.Ora purificare il DNA utilizzando un protocollo di kit modificato per includere l'aggiunta di una digestione con RNasi e per riscaldare il buffer di eluizione e la colonna di eluizione a 70 gradi Celsius prima del loro utilizzo. Sono sufficienti 10 minuti a 70 gradi Celsius per le colonne. Infine, utilizzare uno spettrofotometro per determinare le concentrazioni di DNA e RNA.Un prelievo tipico dell'PVN fornisce circa 600 nanogrammi di DNA e circa 400 nanogrammi di RA messi da parte, di cui circa 100 nanogrammi di RNA per l'analisi dell'espressione genica mediante PCR quantitativa prima dell'amplificazione mediante solfito. Trattare 200 nanogrammi del DNA isolato con un kit disponibile in commercio per amplificare il DNA proveniente dalle regioni metilate. Ordinare primer progettati specificamente per il DNA convertito con bisolfito. Una progettazione ottimale dei primer nella PCR con bisolfito è essenziale, poiché la qualità e la specificità dell'amplicone PCR determinano il successo dei passaggi successivi.Quando i primer arrivano, determinarne la temperatura ottimale e di annealing mediante esperimenti pilota. Utilizzare due microlitri di DNA trattato con bisolfito come stampo per ciascuna miscela di PCR da 25 microlitri.Amplificare la miscela iniziando con una denaturazione di sei minuti a 95 gradi Celsius, seguita da 45-50 cicli di amplificazione prima di un'elongazione finale di cinque minuti a 72 gradi Celsius. Analizzare sette microlitri del prodotto PCR mediante elettroforesi su gel Agros per verificare le dimensioni dell'amplicone. Purificare il prodotto PCR rimanente per la successiva ligazione utilizzando un kit commerciale per la pulizia del PCR.Se si ottengono prodotti PCR non desiderati, utilizzare la purificazione su gel per isolare il prodotto di interesse per questo protocollo. Viene impiegato un kit commerciale per il clonaggio. L'efficienza di clonaggio dipende in modo critico dall'inserzione.Pertanto, se si ottengono ripetutamente bassi numeri di cloni ricombinanti, provare un vettore di clonaggio diverso. Impostare una reazione di ligazione da 10 microlitri con un microlitro di vettore e tre microlitri di prodotto PCR purificato. Mescolare la reazione mediante pipettaggio e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo.Purificare la reazione di ligazione mediante precipitazione alcolica classica e trasformare i batteri con il prodotto. Aggiungere un millilitro di mezzo SOB preriscaldato immediatamente dopo il trasferimento dell'impulso e trasferire i batteri trasformati in una provetta da reazione. Dopo aver incubato i batteri per un'ora a 37 gradi Celsius, distribuire 100 microlitri di ciascuna sospensione su una piastra di LB con ampicillina rivestita con IPTG.Incubare le piastre durante la notte in modo che le colonie possano essere prelevate. Impostare reazioni PCR da 25 microlitri in una piastra a 96 pozzetti utilizzando tre microlitri di cloruro di magnesio 2,5 millimolare per ogni reazione. Selezionare le colonie bianche positive con la punta di una pipetta e trasferirle in una miscela PCR con una semplice immersione.Iniziare la PCR con un ciclo di denaturazione della durata di quattro minuti. Successivamente, eseguire 10 cicli di amplificazione con una temperatura di appaiamento di 56 gradi Celsius. Ogni fase di questi cicli dura 30 secondi.Quindi ridurre la temperatura del coperchio termico a 48 gradi Celsius per ulteriori 30 cicli di amplificazione. Concludere con un ciclo di allungamento di cinque minuti. Caricare ora cinque microlitri di ciascun prodotto su un gel ad aros e identificare le reazioni che contengono l'inserto di dimensioni corrette.Utilizzare un kit disponibile in commercio per purificare i prodotti PCR di interesse in modo che possano essere sequenziati mediante sequenziamento ciclico con terminatore big dye. In una piastra a 96 pozzetti, caricare i pozzetti con tre microlitri di mix master per la reazione big DI, seguiti da due microlitri di prodotto PCR coloniale purificato. Eseguire la reazione su un termociclatore partendo da un minuto a 96 gradi Celsius, seguito da 35 cicli di 10 secondi a 96 gradi Celsius, cinque secondi a 50 gradi Celsius e quattro minuti a 60 gradi Celsius.Al termine della reazione con big die, purificare la reazione utilizzando una piastra di purificazione per big die. Dopo aver ottenuto le sequenze, analizzarle mediante il big analyzer online o lo strumento B-I-S-M-A per determinare il profilo di metilazione della regione di DNA analizzata, al fine di comprendere l'influenza dello stress precoce della vita o ELS sull'espressione e sullo stato di metilazione del gene VP. I topi C 57 black sticks sono stati processati seguendo il protocollo descritto; i nuclei paraventricolare e sopraottico sono stati prelevati per isolare il DNA e l'R-N-A-D-N-A è stato trattato con bisolfito, amplificato con primer specifici per l'enhancer del gene VP e i prodotti di PCR sono stati clonati e sequenziati, analizzando almeno 20 cloni ricombinanti per ogni topo.Le PCR sono state analizzate per determinare le frequenze di metilazione dei CPG contenuti nell'amplicone PCR in tessuti provenienti da P-V-N-E-L-S, che ha indotto una significativa ipometilazione in quattro posizioni sull'enhancer di A VP, suggerendo una marcatura epigenetica di questa regione regolatoria attraverso esperienze precoci di vita. In contrasto con il PVN, la metilazione dell'enhancer di A VP non è risultata influenzata dall'ELS nel SON, illustrando la specificità tissutale dell'effetto epigenetico. Negli animali di controllo, lo stato di metilazione del DNA al CPG 10 ha mostrato una correlazione negativa con l'espressione genica di a VP, indicando un ruolo della metilazione del DNA nella modulazione fine dell'espressione genica di a VP. Seguendo questa procedura, altri metodi come la UPCR possono essere facilmente eseguiti sull'RNA isolato per rispondere ad ulteriori domande, come ad esempio i cambiamenti nell'espressione genica nel tessuto analizzato.Dopo aver guardato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come studiare le variazioni della metilazione del DNA in risposta a stimoli ambientali o legati all'esperienza.

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