Preparazione del campione all'analisi bioinformatica della metilazione del DNA: strategia di associazione per l'obesità e studi sui tratti correlati

Il presente studio descrive il flusso di lavoro per gestire i dati di metilazione del DNA ottenuti dalle tecnologie microarray. Il protocollo illustra i passaggi dalla preparazione del campione all'analisi dei dati. Tutte le procedure sono descritte in dettaglio e il video mostra i passaggi significativi.

Le tecnologie omiche su larga scala vengono utilizzate sempre più negli studi incentrati sull'obesità. L'epigenetica può essere un collegamento tra l'esposizione e gli esiti di salute. Questo tipo di studio genera un'enorme quantità di dati.

Detto questo, è importante standardizzare i protocolli per rendere i dati tecnicamente comparabili. In questo studio, proporremo una pipeline per ottenere e analizzare i dati di metilazione del DNA. Lo stesso protocollo può essere applicato sia per le versioni 400K che epic.

Primo giorno: trattamento con bisolfito. Inizia denaturando il DNA genomico, quindi aggiungi i reagenti di conversione. È necessario seguire le raccomandazioni del kit.

E trattare il DNA denaturante con bisfosfato. Quindi incubare i campioni in un termociclatore. Eseguire le fasi di lavaggio utilizzando il tampone di lavaggio.

Secondo giorno: Amplificazione a seguito del saggio di metilazione, protocollo manuale. Preriscaldare il forno di ibridazione a 37 gradi Celsius e lasciare che la temperatura si equilibri. Disperdere 20 microlitri di MA1 nei pozzetti della piastra.

Trasferire quattro microlitri del DNA ai corrispondenti pozzetti sulla piastra. Disperdere quattro microlitri di soluzione di idrossido di sodio nei pozzetti della piastra. Sigillare la piastra con un sigillo di plastica.

Vortice la piastra per mescolare i reagenti con i campioni. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Disperdere 68 microlitri di RPM in ogni pozzo e quindi 75 microlitri di MSM senza rimuovere la soluzione precedente.

Utilizzare un nuovo sigillo per coprire la piastra. Vortice il piatto per un minuto. Incubare nel forno di ibridazione per 20-24 ore a 37 gradi Celsius.

Terzo giorno: Ibridazione a seguito del saggio di metilazione, protocollo manuale. Preriscaldare il blocco inserendo la piastra a 37 gradi Celsius. Rimuovere con cura la piastra dal forno di ibridazione.

Centrifuga a impulsi la piastra. Rimuovere il sigillo dalla piastra. Aggiungere 50 microlitri di FMS a ciascun contenitore di campioni.

Vortice il piatto per un minuto. Centrifugare le esigenze della piastra. Quindi posizionare la piastra sigillata sul blocco riscaldante a 37 gradi Celsius per un'ora.

Aggiungere 100 microlitri di PM1 a ciascun pozzo contenente campioni. Sigillare nuovamente la piastra. Vortice il piatto per un minuto.

Incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi pulsare nella centrifuga per un minuto, quindi aggiungere 300 microlitri di 100%2-propanolo a ciascun pozzetto con campione. Sigillare nuovamente la piastra.

Mescolare tutto il contenuto invertendo la piastra almeno 10 volte. Incubare a quattro gradi Celsius per 30 minuti, quindi centrifugare a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Rimuovere il sigillo dalla piastra.

Invertire rapidamente la piastra in un luogo appropriato, scartando il surnatante. Tocca con decisione più volte fino a quando non hai notato che tutti i pozzetti sono privi di liquidi. A temperatura ambiente, lasciare il piatto capovolto e scoperto per un'ora.

Dopo aver asciugato tutto il liquido, è necessario vedere i pallet blu sul fondo dei pozzetti. Quindi aggiungere 46 microlitri di RA1 a ciascun pozzetto. Applicare il sigillo termico sulla piastra.

Tenere stretto per eseguire la sigillatura in modo uniforme. Metti la piastra nel forno di ibridazione a 48 gradi Celsius per un'ora, quindi gira il vortice per un minuto. Pulsare nella centrifuga e riscaldare la piastra a 95 gradi Celsius per un'ora.

Preparare insieme le Camere Hyb BeadChip. In questa fase successiva, disperdere 400 microlitri di PB2 nei serbatoi nelle Hyb Chambers. Dopo aver riempito i serbatoi hyb Chamber con PB2, mettere immediatamente il coperchio.

Caricare con attenzione ogni campione dalla piastra nell'ingresso del campione del microarray. Caricare gli inserti Hyb Chamber contenenti i microarray nella Hyb Chamber. Chiudere la camera Hyb trasversalmente per evitare possibili spostamenti della camera Hyb.

Quarto giorno: colorazione dopo il saggio di metilazione, protocollo manuale. Dopo l'incubazione notturna, rimuovere tutti i microarray dagli inserti. E lavare i microarray lentamente e leggermente, per un totale di 10 volte, su e giù.

Spostare i microarray nel contenitore PB1 numero due e ripetere 10 volte, su e giù. Posizionare i fotogrammi della camera di flusso nella posizione corretta, quindi ogni microarray. Usa un distanziatore trasparente nella parte superiore di ciascuno.

La barra di allineamento deve essere posizionata sull'accessorio di allineamento. Una piastra posteriore in vetro deve essere posizionata sopra il distanziatore. Quindi collegare morsetti metallici alle camere di flusso.

Utilizzare le forbici per tagliare le estremità dei distanziali flow chamber. Posizionare la camera di flusso con il microarray nel rack della camera. Pipetta 150 microlitri di RA1.

Incubare per 30 minuti e ripetere cinque volte. Pipettare 450 microlitri di XC1 e incubare per 10 minuti. Pipettare 450 microlitri di XC2 e incubare per 10 minuti.

Pipetta 200 microlitri di TEM. Incubare per 15 minuti. Pipetta 450 microlitri di 95% formammide.

Incubare per un minuto, ripetendo due volte. Incubare per cinque minuti. Pipetta 450 microlitri di XC3.

Incubare per un minuto e ripetere. In questa fase verranno erogati i seguenti reagenti, 250 microlitri di STM, 450 microlitri di XC3 e 250 microlitri di ATM. Esegui il seguente schema di ripetizione.

Dopo tutte le ripetizioni e le incubazioni, posizionare i microarray su una griglia in piedi e immergerli nel contenitore di lavaggio. Muoversi lentamente e leggermente con movimenti su e giù, 10 volte. Asciugare i microarray utilizzando l'essiccatore sottovuoto per 50-55 minuti.

Una volta asciugati i microarray, procedere all'immagine del microarray con la scansione. In questa immagine, possiamo vedere tutti i protocolli utilizzati, dalla scelta dei partecipanti all'elaborazione dei file IDAT ottenuti l'ultimo giorno dell'esperimento di metilazione. I file sono stati trasferiti al computer dove sono state eseguite le analisi bioinformatiche.

Le analisi sono state elaborate utilizzando R Studio e il pacchetto Bioconductor ChAMP. Assicurati di avere almeno otto gigabyte di RAM sul tuo computer. Altre analisi bioinformatiche, come l'arricchimento genico, sono state eseguite per presentare meglio i dati al lettore.

In questa tabella, possiamo osservare i due gruppi utilizzati in questo studio, obesi e non obesi. C'era una differenza tra i gruppi per variabili, indice di massa corporea, circonferenza addominale, massa grassa in chilogrammi e massa grassa in percentuale. Osservando lo schema presentato in questa figura, siamo stati in grado di capire che il protocollo proposto era adeguato ai nostri dati.

E dopo l'analisi bioinformatica, un totale di 409.887 sonde sono state presentate dopo l'esecuzione del filtro. Il grafico della densità ha rivelato che tutti i campioni avevano densità simili di distribuzione beta. Nessun campione è stato escluso sulla base di queste analisi.

L'analisi di decomposizione del valore singolare dei dati normalizzati ha rivelato che BMI, doppio C e FM hanno influenzato significativamente la variabilità dei dati di metilazione del DNA. La stima del tipo di cellula ha rivelato che entrambe le cellule natural killer, le cellule NK e B erano più alte nelle donne obese. I livelli di metilazione del DNA tra donne obese e non obese erano diversi prima e dopo la correzione del tipo di cellula.

Prima della correzione, sono state osservate 43.463 diverse posizioni di metilazione. E dopo di ciò, 3.329 CPG sono rimasti in modo significativo. Un totale di 162 CPG erano ipometilati e 576 erano ipermetilati negli obesi rispetto ai non obesi.

I dati sono disponibili nel database GEO con codice di registrazione GSE166611. Presentiamo i siti CPG che sono stati associati alle caratteristiche specifiche dei partecipanti che sono stati osservati in SVD. Per la massa grassa, sono stati trovati 13.222 siti CPG.

C'erano 6.159 CPG correlati alla massa grassa nella regione del promotore. 470 ipometilati e 94 ipermetilati. I rispettivi geni dei siti associati sono stati arricchiti e sono ora mostrati.

Abbiamo osservato che il protocollo proposto è in grado di identificare all'interno dei tuoi modelli di metilazione, ed è giusto relazionarsi all'interno delle tue metilazioni. Il nostro risultato conferma che uno stile di vita obesogenico può promuovere cambiamenti epigenetici nel DNA umano.