Immunostaining per modificazioni del DNA: analisi computazionale delle immagini Confocal
September 7th, 2017
Recentemente scoperto forme ossidate di 5-metilcitosina (oxi-mCs), 5-idrossimetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) e 5-carboxylcytosine (5caC) può rappresentare distinte modificazioni del DNA con ruoli funzionali unici. Qui è descritto un flusso di lavoro semi-quantitativa per visualizzazione della distribuzione spaziale di oxi-mCs', profilatura di intensità di segnale e colocalizzazione.
L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di fornire uno strumento computazionale per valutare la distribuzione spaziale e l'intensità del segnale delle modificazioni del DNA, visualizzate mediante immunocolorazione all'interno dei nuclei. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'epigenetica, consentendo l'esame della localizzazione nucleare e dei livelli relativi di modificazioni del DNA in diversi sistemi modello. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le modifiche del DNA sono misurate in base all'ampiezza del segnale del bot e quindi alla distribuzione.
Una delle implicazioni di questa tecnica è che facilita la nostra comprensione di potenziali file funzionali di modifiche del DNA in vari sistemi biologici. Questa tecnica ha anche l'applicazione dell'analisi computazionale di altri epitopi rilevabili mediante immunoistochimica. Per iniziare, aprire i file formattati LSM dell'immagine di microscopia confocale.
Selezionare l'elaborazione delle immagini, quindi scegliere l'immagine desiderata per l'analisi. Si noti che quando si confrontano i profili di intensità tra i campioni, la potenza e il guadagno del laser devono essere coerenti per effettuare confronti diretti. Successivamente, fai clic su mostra tutto, per rendere visibili tutti i controlli grafici, quindi seleziona la scheda grafica e scegli lo strumento rettangolo per selezionare una regione contenente i nuclei di interesse.
Quindi utilizzare il comando taglia regione per isolare la regione di interesse. Ora salvate l'immagine con un nuovo nome e in formato LSM o CZI e riaprite il file nel software Zen Blue. Apri la scrivania ZEN in Zen Blue, quindi usa il comando invia a ZEN in Zen Black per aprire il file in Zen Blue.
Quindi, attiva la scheda etichettata 2.5d per abilitare la visualizzazione dell'immagine in 2.5d. Fare clic su Mostra tutto per rendere visibili tutti i controlli grafici e modificare le impostazioni utilizzando le quattro barre grigie. Le barre controllano lo zoom, la rotazione, l'inclinazione dell'asse e l'espansione e la contrazione delle barre della scala.
Seleziona la modalità di rendering per visualizzare al meglio i singoli picchi, quindi modifica la grande distanza modificando la percentuale. Più bassa è la percentuale, più definito è ogni singolo picco. Ora prima di salvare l'immagine 2.5d, nascondi l'elenco dei file e gli strumenti grafici cliccando sulla freccia grigia sotto il grafico 2.5d.
Quindi salva il grafico come screenshot utilizzando il tasto stampa schermo sulla tastiera. Apri l'opzione di elaborazione delle immagini nel software e apri il file di interesse. Quindi, seleziona la scheda del profilo e seleziona la scheda Mostra tutto per accedere a tutte le opzioni di formattazione.
Dalla scheda del profilo, scegli l'opzione tabella e il pulsante freccia. Ora usa il mouse per selezionare un punto di partenza e disegna una linea su un numero continuo di celle, un grafico di intensità per le celle lungo questa linea, viene quindi generato insieme alla tabella delle misure di intensità. Si noti che la tabella fornisce anche la distanza alla quale l'intensità dei pixel è rossa per la fluorescenza rosso, verde e blu.
L'unità è di micron. Per esportare questi dati, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla tabella, selezionare Salva tabella e salvarla come file di testo. Per salvare il profilo di intensità, scegli l'opzione di esportazione, nella finestra pop-up, attiva o disattiva due opzioni, file immagine con tag, formato e contenuto della finestra immagine, riquadro singolo, dati.
Quindi segui le istruzioni per salvare il file. Ora ripeti questo processo per ogni profilo di intensità necessario. Nel software, selezionare l'elaborazione delle immagini e scegliere il file immagine di interesse.
Quindi seleziona la scheda coloc per l'analisi di co-localizzazione e seleziona Mostra tutto per accedere a tutte le opzioni di formattazione. Dalle quattro schede nella metà inferiore dello schermo, scegli la co-localizzazione e scegli le opzioni della tabella e dell'immagine. Quindi scegli la terza icona nella parte superiore della scheda, identificata dal testo pop-up, closed besier.
Utilizzare questo strumento per circondare un singolo nucleo. I valori appariranno quindi nella tabella e verrà prodotto un grafico a dispersione per la fluorescenza rossa rispetto a quella verde. L'asse di questo grafico è mobile e questo controlla il gating di rilevamento.
Tutte le intensità dei pixel all'interno del nucleo dovrebbero essere considerate segnali positivi. Poiché i livelli di modificazioni del DNA variano attraverso il nucleo, per tenere conto dei segnali deboli, non cancelliamo i dati. Dovremmo sottolineare qui che è discutibile se i valori di fondo debbano essere inclusi nell'analisi.
È importante sottolineare che il coefficiente di sovrapposizione è indipendente dalle differenze di intensità del segnale tra i due canali. Mentre il coefficiente di correlazione della persona assume una relazione lineare tra i segnali. Ora ripeti questo processo di circondimento dei nuclei per completare il set di dati.
Quindi, per esportare i dati, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla tabella e seguire le opzioni per salvare i dati. Per salvare un'immagine di co-localizzazione, utilizzare il comando di esportazione con le due opzioni, file immagine con tag, formato e contenuto del riquadro singolo della finestra immagine, dati, quindi seguire le opzioni per salvare il file. La distribuzione spaziale di due derirativi ossidati di cinque metilcitosina è stata esaminata in progenitori afadici differenzianti, utilizzando il protocollo descritto.
I segnali rosso e verde rappresentano le due distinte modificazioni del DNA. I segnali sono ben definiti con sovrapposizioni limitate. Coerentemente con le aspettative, i profili delle due intensità del segnale e della cella corrispondente, non coincidono fortemente tra loro.
Il modello distinto suggerisce che l'ossidazione tap dipendente di cinque metil citosina può generare diversi derivati ossidati in specifiche regioni della cromatina. Un confronto simile delle due modificazioni del DNA è stato effettuato nelle cellule di medulloblastoma di Daoy e nelle cellule di ependimoma BXD. Entrambe le linee cellulari provengono da tumori cerebrali pediatrici.
La quantificazione rivela che le cellule BXD mostrano livelli significativamente più bassi di entrambi i segnali rispetto alle cellule Daoy. Successivamente, la co-localizzazione dei derivati ossidati di 5MC è stata esaminata in hiPSC indifferenziate. Nelle 24 ore successive all'induzione della differenziazione dell'endoderma epatico e delle hiPSC.
In questa analisi, la co-localizzazione del segnale è cambiata significativamente con l'induzione del differenziamento, che può essere attribuibile a una ridotta magnitudine di cinque CAC nelle cellule indifferenziate. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare grafici e profili di intensità 2.5d e di come produrre dati di co-localizzazione. Gli strumenti di analisi e visualizzazione delle immagini qui descritti contribuiscono alla ricerca epigenetica, fornendo un modo relativamente rapido per confrontare i segnali delle diverse modificazioni del DNA in diversi gruppi sperimentali.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa un'ora se eseguita correttamente. È importante evitare la sovraesposizione e utilizzare le stesse impostazioni per diversi gruppi sperimentali durante la microscopia. Le bolle d'aria nella montatura e un'immersione insufficiente possono causare una perdita locale di fluorescenza, pertanto è fondamentale un'ispezione visiva dell'area di scansione.
La procedura può essere ulteriormente automatizzata segmentando i nuclei e creando regioni di interesse utilizzando Zen Blue. Queste regioni possono essere importate in Zen Black, per eseguire analisi di co-localizzazione su più nuclei.
Panoramica
Questo articolo presenta un flusso di lavoro semi-quantitativo per visualizzare le forme ossidate di 5-metilcitosina (oxi-mC) appena scoperte e la loro distribuzione spaziale all'interno dei nuclei. Il metodo consente la valutazione dell'intensità del segnale delle modificazioni del DNA e la colocalizzazione, contribuendo alla comprensione dei loro ruoli funzionali in epigenetica.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Epigenetica
- Modificazioni del DNA
- Tecniche di immunocolorazione
Sfondo
- La 5-metilcitosina e i suoi derivati ossidate svolgono ruoli cruciali nella regolazione genica.
- Comprendere la loro distribuzione spaziale può fornire informazioni sulle loro implicazioni funzionali.
- I metodi esistenti potrebbero non visualizzare adeguatamente queste modificazioni.
- Questo studio introduce uno strumento computazionale per migliorare la visualizzazione e l'analisi.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per valutare la distribuzione spaziale delle modificazioni del DNA.
- Analizzare l'intensità del segnale e la colocalizzazione di diversi derivati ossidate.
- Facilitare la comprensione dei ruoli funzionali di queste modificazioni nei sistemi biologici.
Metodi utilizzati
- Immunocolorazione delle modificazioni del DNA nei nuclei.
- Microscopia confocale per l'acquisizione delle immagini.
- Elaborazione delle immagini utilizzando il software Zen Blue per la visualizzazione.
- Analisi di colocalizzazione delle intensità del segnale.
Risultati principali
- Sono stati osservati distinti modelli spaziali dei derivati ossidate in vari tipi di cellule.
- L'analisi di colocalizzazione ha rivelato cambiamenti significativi durante la differenziazione.
- La quantificazione ha mostrato differenze nei livelli di segnale tra le linee cellulari.
- Il metodo ha dimostrato il potenziale per applicazioni più ampie nella ricerca epigenetica.
Conclusioni
- Il flusso di lavoro sviluppato migliora la visualizzazione delle modificazioni del DNA.
- I risultati suggeriscono ruoli funzionali distinti per diversi derivati ossidate.
- Questa tecnica può essere applicata a vari contesti biologici per approfondimenti più profondi.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D teams to quantitatively assess the spatial distribution and signal intensity of DNA modifications in nuclear contexts, supporting mechanistic de-risking in epigenetic target validation. By providing computational analysis of immunostained confocal images, it enhances predictive confidence in early discovery stages where understanding the localization of novel epigenetic marks informs therapeutic hypothesis interrogation. The workflow supports cross-functional collaboration through standardized, reproducible quantitative outputs that can be applied across diverse model systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing tissue- and developmental stage-specific occurrence of DNA modifications in vertebrates.
- Operational Value: Supports biological de-risking through quantitative measurement of signal intensity and distribution patterns in nuclei.
- Predictive Value: Contributes to portfolio triage by providing data on the localization of oxidized derivatives of 5-methylcytosine that may play specific roles in cellular processes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating 2.5D signal intensity plots and intensity profiles for multiple cells.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through consistent laser power and gain settings during microscopy, enabling direct comparisons between samples.
- Screening Readiness: Highlights scalability and platform reuse by demonstrating applicability to other epitopes detectable by immunohistochemistry.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance through examination of signal colocalization changes during differentiation in hiPSCs and pediatric brain tumor cell lines.
- Risk-Adjusted Advancement: Describes how quantification of signal levels in Daoy medulloblastoma and BXD ependymoma cells supports decision-making in preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by showing how distinct spatial patterns of oxidized derivatives may reflect tap-dependent oxidation in specific chromatin regions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification by providing quantitative imaging data that supports hypothesis testing and pathway clarification in epigenetics research.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing through spatial distribution analysis of DNA modifications visualized by immunostaining.
- Screening: Describes assay readiness via signal intensity profiles and table exports that enable quantitative comparison of staining intensity across cells.
- Analytics: Highlights colocalization coefficients and scatter plots that help teams compare conditions and assess relationships between different DNA modifications.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity through analysis of signal changes during differentiation in stem cell and tumor models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability by noting its added application to computational analysis of other epitopes detectable by immunohistochemistry.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through assessment of nuclear localization and relative levels of DNA modifications.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via consistent imaging settings and exportable data tables for cross-group comparison.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by enabling evaluation of DNA modification levels in different experimental groups, such as undifferentiated vs. differentiated hiPSCs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through quantification of signal differences between cell lines, such as lower signals in BXD vs. Daoy cells.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in confocal microscopy and immunostaining for DNA modifications.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include Zen Blue software for 2.5D visualization, profile analysis, and colocalization tools.
- Cross-team standardization requirements involve maintaining consistent laser power and gain when comparing intensity profiles between samples.
- Adaptation considerations across model systems are supported by the method’s application in differentiating haphadic progenitors, Daoy medulloblastoma, BXD ependymoma, and hiPSCs.
- Practical limitations include the need to avoid overexposure and inspect scanning areas for air bubbles or insufficient immersion that can cause local fluorescence loss.
