Immunostaining per modificazioni del DNA: analisi computazionale delle immagini Confocal

Recentemente scoperto forme ossidate di 5-metilcitosina (oxi-mCs), 5-idrossimetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) e 5-carboxylcytosine (5caC) può rappresentare distinte modificazioni del DNA con ruoli funzionali unici. Qui è descritto un flusso di lavoro semi-quantitativa per visualizzazione della distribuzione spaziale di oxi-mCs', profilatura di intensità di segnale e colocalizzazione.

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di fornire uno strumento computazionale per valutare la distribuzione spaziale e l'intensità del segnale delle modificazioni del DNA, visualizzate mediante immunocolorazione all'interno dei nuclei. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'epigenetica, consentendo l'esame della localizzazione nucleare e dei livelli relativi di modificazioni del DNA in diversi sistemi modello. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le modifiche del DNA sono misurate in base all'ampiezza del segnale del bot e quindi alla distribuzione.

Una delle implicazioni di questa tecnica è che facilita la nostra comprensione di potenziali file funzionali di modifiche del DNA in vari sistemi biologici. Questa tecnica ha anche l'applicazione dell'analisi computazionale di altri epitopi rilevabili mediante immunoistochimica. Per iniziare, aprire i file formattati LSM dell'immagine di microscopia confocale.

Selezionare l'elaborazione delle immagini, quindi scegliere l'immagine desiderata per l'analisi. Si noti che quando si confrontano i profili di intensità tra i campioni, la potenza e il guadagno del laser devono essere coerenti per effettuare confronti diretti. Successivamente, fai clic su mostra tutto, per rendere visibili tutti i controlli grafici, quindi seleziona la scheda grafica e scegli lo strumento rettangolo per selezionare una regione contenente i nuclei di interesse.

Quindi utilizzare il comando taglia regione per isolare la regione di interesse. Ora salvate l'immagine con un nuovo nome e in formato LSM o CZI e riaprite il file nel software Zen Blue. Apri la scrivania ZEN in Zen Blue, quindi usa il comando invia a ZEN in Zen Black per aprire il file in Zen Blue.

Quindi, attiva la scheda etichettata 2.5d per abilitare la visualizzazione dell'immagine in 2.5d. Fare clic su Mostra tutto per rendere visibili tutti i controlli grafici e modificare le impostazioni utilizzando le quattro barre grigie. Le barre controllano lo zoom, la rotazione, l'inclinazione dell'asse e l'espansione e la contrazione delle barre della scala.

Seleziona la modalità di rendering per visualizzare al meglio i singoli picchi, quindi modifica la grande distanza modificando la percentuale. Più bassa è la percentuale, più definito è ogni singolo picco. Ora prima di salvare l'immagine 2.5d, nascondi l'elenco dei file e gli strumenti grafici cliccando sulla freccia grigia sotto il grafico 2.5d.

Quindi salva il grafico come screenshot utilizzando il tasto stampa schermo sulla tastiera. Apri l'opzione di elaborazione delle immagini nel software e apri il file di interesse. Quindi, seleziona la scheda del profilo e seleziona la scheda Mostra tutto per accedere a tutte le opzioni di formattazione.

Dalla scheda del profilo, scegli l'opzione tabella e il pulsante freccia. Ora usa il mouse per selezionare un punto di partenza e disegna una linea su un numero continuo di celle, un grafico di intensità per le celle lungo questa linea, viene quindi generato insieme alla tabella delle misure di intensità. Si noti che la tabella fornisce anche la distanza alla quale l'intensità dei pixel è rossa per la fluorescenza rosso, verde e blu.

L'unità è di micron. Per esportare questi dati, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla tabella, selezionare Salva tabella e salvarla come file di testo. Per salvare il profilo di intensità, scegli l'opzione di esportazione, nella finestra pop-up, attiva o disattiva due opzioni, file immagine con tag, formato e contenuto della finestra immagine, riquadro singolo, dati.

Quindi segui le istruzioni per salvare il file. Ora ripeti questo processo per ogni profilo di intensità necessario. Nel software, selezionare l'elaborazione delle immagini e scegliere il file immagine di interesse.

Quindi seleziona la scheda coloc per l'analisi di co-localizzazione e seleziona Mostra tutto per accedere a tutte le opzioni di formattazione. Dalle quattro schede nella metà inferiore dello schermo, scegli la co-localizzazione e scegli le opzioni della tabella e dell'immagine. Quindi scegli la terza icona nella parte superiore della scheda, identificata dal testo pop-up, closed besier.

Utilizzare questo strumento per circondare un singolo nucleo. I valori appariranno quindi nella tabella e verrà prodotto un grafico a dispersione per la fluorescenza rossa rispetto a quella verde. L'asse di questo grafico è mobile e questo controlla il gating di rilevamento.

Tutte le intensità dei pixel all'interno del nucleo dovrebbero essere considerate segnali positivi. Poiché i livelli di modificazioni del DNA variano attraverso il nucleo, per tenere conto dei segnali deboli, non cancelliamo i dati. Dovremmo sottolineare qui che è discutibile se i valori di fondo debbano essere inclusi nell'analisi.

È importante sottolineare che il coefficiente di sovrapposizione è indipendente dalle differenze di intensità del segnale tra i due canali. Mentre il coefficiente di correlazione della persona assume una relazione lineare tra i segnali. Ora ripeti questo processo di circondimento dei nuclei per completare il set di dati.

Quindi, per esportare i dati, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla tabella e seguire le opzioni per salvare i dati. Per salvare un'immagine di co-localizzazione, utilizzare il comando di esportazione con le due opzioni, file immagine con tag, formato e contenuto del riquadro singolo della finestra immagine, dati, quindi seguire le opzioni per salvare il file. La distribuzione spaziale di due derirativi ossidati di cinque metilcitosina è stata esaminata in progenitori afadici differenzianti, utilizzando il protocollo descritto.

I segnali rosso e verde rappresentano le due distinte modificazioni del DNA. I segnali sono ben definiti con sovrapposizioni limitate. Coerentemente con le aspettative, i profili delle due intensità del segnale e della cella corrispondente, non coincidono fortemente tra loro.

Il modello distinto suggerisce che l'ossidazione tap dipendente di cinque metil citosina può generare diversi derivati ossidati in specifiche regioni della cromatina. Un confronto simile delle due modificazioni del DNA è stato effettuato nelle cellule di medulloblastoma di Daoy e nelle cellule di ependimoma BXD. Entrambe le linee cellulari provengono da tumori cerebrali pediatrici.

La quantificazione rivela che le cellule BXD mostrano livelli significativamente più bassi di entrambi i segnali rispetto alle cellule Daoy. Successivamente, la co-localizzazione dei derivati ossidati di 5MC è stata esaminata in hiPSC indifferenziate. Nelle 24 ore successive all'induzione della differenziazione dell'endoderma epatico e delle hiPSC.

In questa analisi, la co-localizzazione del segnale è cambiata significativamente con l'induzione del differenziamento, che può essere attribuibile a una ridotta magnitudine di cinque CAC nelle cellule indifferenziate. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare grafici e profili di intensità 2.5d e di come produrre dati di co-localizzazione. Gli strumenti di analisi e visualizzazione delle immagini qui descritti contribuiscono alla ricerca epigenetica, fornendo un modo relativamente rapido per confrontare i segnali delle diverse modificazioni del DNA in diversi gruppi sperimentali.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa un'ora se eseguita correttamente. È importante evitare la sovraesposizione e utilizzare le stesse impostazioni per diversi gruppi sperimentali durante la microscopia. Le bolle d'aria nella montatura e un'immersione insufficiente possono causare una perdita locale di fluorescenza, pertanto è fondamentale un'ispezione visiva dell'area di scansione.

La procedura può essere ulteriormente automatizzata segmentando i nuclei e creando regioni di interesse utilizzando Zen Blue. Queste regioni possono essere importate in Zen Black, per eseguire analisi di co-localizzazione su più nuclei.