Correlare DNA Modifiche metilazione gene-specifica con espressione e trascrizionale attività di astrociti

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare lo stato di metilazione del DNA di KCNJ10 in una popolazione arricchita di astrociti e correlare le variazioni della metilazione del promotore con l'attività trascrizionale opzionale. Questo viene realizzato isolando innanzitutto una popolazione arricchita di astrociti corticali dall'intero cervello di roditore mediante sorting FACS; successivamente, il DNA viene isolato dalla popolazione arricchita di astrociti. Quindi, lo stato di metilazione del DNA di KCNJ10 viene valutato mediante analisi di fusione ad alta risoluzione sensibile alla metilazione, o MS-HRMA.

Infine, il promotore KCNJ10 è ipermetilato e il saggio con luciferasi viene utilizzato per correlare le variazioni nella metilazione del DNA del promotore con l'attività trascrizionale. In definitiva, MS.HRMA e il saggio con luciferasi sono impiegati per misurare lo stato di metilazione del DNA di KCNJ10 e per correlare le variazioni nella metilazione del promotore con l'attività trascrizionale del gene. La procedura verrà dimostrata da un ricercatore postdottorato del mio laboratorio. Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con le linee guida dei National Institutes of Health, e l'utilizzo degli animali è stato approvato dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università dell'Alabama a Birmingham.

Tutti i tamponi e i reagenti sono stati preparati secondo il protocollo indicato nel testo. Dopo aver dissezionato le cortecce dalla testa di un animale eutanasizzato, secondo il protocollo descritto nel testo, praticare un foro nella parte superiore di un tubo conico da 50 millilitri utilizzando un taglierino o una fresa, in modo da far passare un tubicino all'interno del tubo. Quindi aggiungere la soluzione papaina nel tubo.

Posizionare le cortecce dissezionate in una piastra da coltura da 10 millimetri contenente mezzo di dissociazione equilibrato a 95% O2 e 5% CO2 e utilizzare una lametta pulita per tritare il tessuto in pezzi di dimensioni pari a 1 millimetro per 1 millimetro. Con una pipetta da 10 millilitri, trasferire il tessuto nel tubo da 50 millilitri contenente la soluzione di pepaina. Attendere che il tessuto si depositi sul fondo della pipetta prima di effettuare il trasferimento.

Per minimizzare la quantità di mezzo di dissociazione trasferito senza provocare la formazione di bolle nella soluzione di pepano, applicare un flusso costante di 95% O2 e 5% CO2 mediante scambio gassoso superficiale durante l'incubazione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Al termine dell'incubazione, utilizzare una pipetta di trasferimento da 10 millilitri per aspirare e rilasciare lentamente il tessuto 10 volte, quindi centrifugare la sospensione cellulare torbida a 300 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Equilibrare la soluzione inibitrice dell'albumina del DNA mediante scambio gassoso superficiale e risospendere le cellule in pellet in tre millilitri di tale soluzione.

Quindi preparare un gradiente di densità discontinuo commerciale seguendo le istruzioni del produttore. Centrifugare il gradiente di densità discontinuo a 70 G per sei minuti. Successivamente, isolare le cellule dissociate dalla parte inferiore del tubo utilizzando una pipetta per aspirare il mezzo.

Utilizzare da due a tre millilitri di DPBS con albumina sierica bovina allo 0,02% e un milligrammo per millilitro di DNA o il mezzo preferito. Per riutilizzare, sospendere le cellule dissociate. Far passare le cellule attraverso un filtro da 40 microgrammi prima di eseguire il sorting cellulare e l'estrazione di DNA o RNA secondo il protocollo indicato nel testo.

Dopo aver progettato primer specifici per una sequenza di DNA convertito con bisolfito e aver amplificato il DNA seguendo il protocollo descritto, convertire con bisolfito da 500 a 1000 nanogrammi di DNA per ogni campione e standard di DNA metilato con percentuali dallo zero al 100% provenienti dalla stessa specie animale, utilizzando una DNA polimerasi preferenziale e primer a cinque micromoli. Impostare reazioni da 20 microlitri per l'amplificazione Ms HRM. In base a questa tabella, eseguire tutti i campioni, inclusi DNA di controllo, DNA e standard metilati, in triplicato; in base al software di analisi utilizzato, impostare i parametri iniziali e finali pre e post intorno alle transizioni della curva di fusione.

Impostare i parametri di premelt iniziale e premelt finale in modo che la differenza tra i due sia compresa tra 0,2 e 0,5 gradi Celsius. Impostare in modo analogo i parametri di postmelt iniziale e finale ed estrarre i dati relativi alla differenza di temperatura di picco per ogni campione utilizzando gli standard di metilazione percentuale e le corrispondenti differenze di temperatura di picco.

Generare un'equazione di regressione lineare. Utilizzare questa equazione di regressione lineare per stimare lo stato di metilazione di campioni sconosciuti dopo aver identificato le isole CPG di interesse e aver amplificato e clonato l'isola CPG Luke due plasmidico secondo il protocollo descritto nel testo. Utilizzare il software cutter preferito per verificare i siti di digestione con enzimi di restrizione al fine di evitare tagli doppi e linearizzare 30 microgrammi di plasmide una volta che il campione è stato digerito con gli enzimi appropriati.

Inattivare gli enzimi al calore alla temperatura e durata appropriate in reazioni da 50 microlitri. Utilizzare cinque unità di metilasi CPG per metilare 700 microgrammi di plasmidi lineari a 30 gradi Celsius per 13-19 ore.

Dopo aver purificato il DNA come descritto nel protocollo, eseguire un doppio digestione con HPA su campioni di un microgrammo di DNA metilato, incubando a 37 gradi Celsius per un'ora. Dopo la purificazione, caricare i campioni di DNA su un gel di agarosio al 1% a 100 volt per 45 minuti per la visualizzazione. Successivamente, sottoporre i plasmidi metilati e non metilati a digestione doppia con enzimi di restrizione appropriati per tutta la notte, al fine di rilasciare il vettore Luke due completo e i frammenti dell'isola CPG.

Inattivare termicamente gli enzimi dopo la digestione. Eseguire i campioni digeriti due volte su un gel di agarosio 1% a 100 volt per un'ora per separare il vettore dall'inserto; quindi, indossando protezioni contro la luce UV, posizionare il gel sotto luce nera e, utilizzando lame chirurgiche pulite, escindere gli inserti metilati e non metilati. Dopo l'estrazione del DNA dal gel secondo il protocollo descritto, utilizzare la DNA Ligasi T4 in un rapporto uno a quattro tra vettore e inserto per clonare gli inserti metilati e non metilati in un vettore non metilato. Incubare a meno 20 gradi Celsius o sul ghiaccio per tutta la notte dopo la ligazione.

Pulire il DNA e verificare la religatura eseguendo i campioni su un gel di agarosio al 1% e valutare la concentrazione del plasmide religato. Seminare cellule CD54 in una piastra a 12 pozzetti a 140.000 cellule per pozzetto. Dopo 24 ore, utilizzare un reagente di trasfezione commerciale per trasfettare le cellule con concentrazioni uguali di plasmide CPG non metilato con loop due più RAN vanilla oppure un altro vettore di controllo ferroso, oppure plasmide cpg metilato con Luke due più ELLA oppure un altro vettore di controllo lucifero. Lasciare che le cellule vengano trasfettate per 24 ore prima di eseguire un saggio lucifero.

Secondo le istruzioni del produttore, utilizzare un luminometro per leggere ogni pozzetto in triplice replicato. Calcolare il rapporto tra l'attività della luciferasi di lucerna e quella della ran vanilla o di un altro controllo. Attività della luciferasi.

Normalizzare l'attività della luciferasi di controllo firefly metilata rispetto all'attività della luciferasi di controllo firefly non metilata, dividendo l'attività metilata per l'attività della luciferasi metilata. Come dimostrato qui, una popolazione arricchita di astrociti è stata ottenuta mediante sorting FACS di animali transgenici E-G-F-P-S 100 beta. Una popolazione selezionata è stata indirizzata in base allo scattering anteriore e laterale, e una popolazione di cellule vive è stata determinata utilizzando un indicatore per cellule morte a base di bromuro; le immagini mostrate qui sono rappresentative di astrociti positivi per EGFP dopo la dissociazione, ma prima del sorting e anche dopo il sorting. Questa figura mostra una popolazione cellulare isolata positiva per EGFP che ha dimostrato un aumento di 40 volte dell'mRNA per il marcatore specifico degli astrociti.

Un LDH su L uno. Inoltre, nonostante l'espressione condivisa di S100β e NG2 negli OPC e negli astrociti, è stata osservata una riduzione quattro volte maggiore dell'mRNA di NG2, un marcatore per le cellule precursori degli oligodendrociti, indicando l'isolamento di una popolazione cellulare astrocitaria arricchita. Questa tabella elenca l'RNA e il DNA totali isolati da animali di età e numero variabili, ed è riportata come riferimento per il rendimento atteso di molecole molecolari in seguito ai fatti.

Infine, è stato utilizzato un saggio con luciferasi duale per valutare l'attività trascrizionale delle regioni ipermetilate del gene di interesse dopo aver trasferito l'inserto metilato in un vettore non metilato. È stata utilizzata HPAII, che digerisce soltanto il DNA non metilato, per verificare lo stato di metilazione del plasmide. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare una popolazione arricchita di astrociti utilizzando la FACS, nonché di come misurare la metilazione del DNA di un gene e correlare le variazioni nella metilazione del DNA del promotore con l'attività trascrizionale, utilizzando rispettivamente l'analisi di fusione ad alta risoluzione sensibile alla metilazione e il saggio con luciferasi.