Correlare DNA Modifiche metilazione gene-specifica con espressione e trascrizionale attività di astrociti KCNJ10 (Kir4.1)

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare lo stato di metilazione del DNA di KCNJ 10 in una popolazione arricchita di astrociti e correlare i cambiamenti di metilazione del DNA del promotore con l'attività trascrizionale opzionale. Ciò si ottiene isolando prima una popolazione arricchita di astrociti corticali dall'intero cervello del roditore attraverso l'ordinamento dei fatti Il DNA successivo viene isolato dalla popolazione arricchita di astrociti. Quindi lo stato di metilazione del DNA di KC J 10 viene valutato utilizzando l'analisi del fuso ad alta risoluzione sensibile alla metilazione o MS. HRMA.

Infine, il promotore KC J 10 è ipermetilato e il saggio dei luciferi viene utilizzato per correlare i cambiamenti nella metilazione del DNA del promotore con l'attività trascrizionale. In definitiva, MS. L'HRMA e il test della luciferasi vengono utilizzati per misurare lo stato di metilazione del DNA di KCNJ 10 e correlare i cambiamenti nella metilazione del promotore e nell'attività trascrizionale del gene Si vedrà la dimostrazione della procedura. Tutti gli animali sono stati gestiti in conformità con le linee guida del National Institutes of Health, il Comitato per la cura e l'uso degli animali presso l'Università dell'Alabama a Birmingham ha approvato l'uso degli animali.

Tutti i tamponi e i reagenti sono stati preparati secondo il protocollo di testo. Dopo aver sezionato le cortecce dalla testa di un animale soppresso, secondo il protocollo di testo, praticare un foro nella parte superiore di un tubo conico da 50 millilitri per consentire l'alimentazione del tubo nel tubo. Quindi aggiungere la soluzione di papin al tubo.

Posizionare le cortecce sezionate in un piatto di coltura da 10 millimetri contenente un terreno di dissociazione bilanciato al 95% di O2 al 5% di CO2 e utilizzare una lama di rasoio pulita per tritare il tessuto in pezzi di un millimetro quadrato uno per uno. Con una pipetta da 10 millilitri, gli uomini trasferiscono il tessuto nella provetta da 50 millilitri contenente la soluzione di pepane. Lasciare che il tessuto si depositi sul fondo della pipetta di trasferimento prima di scaricarlo.

Per ridurre al minimo la quantità di mezzo di dissociazione trasportato senza far gorgogliare la soluzione di pepano, applicare un flusso costante dal 95% di O2 al 5% di CO2 attraverso lo scambio di gas superficiale durante l'incubazione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Dopo l'incubazione, utilizzare una pipetta di trasferimento da 10 millilitri per tappare lentamente il tessuto 10 volte, centrifugare la sospensione cellulare torbida a 300 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Equilibrare la soluzione di inibitore dell'albumina del DNA tramite scambio gassoso superficiale e risospendere le cellule pellettate in tre millilitri di soluzione.

Quindi preparare un gradiente di densità discontinuo commerciale seguendo le istruzioni del produttore. Centrifugare il gradiente di densità discontinuo a 70 G per sei minuti. Quindi isolare le cellule dissociate dal fondo della provetta utilizzando una pipetta per aspirare il terreno.

Utilizzare da due a tre millilitri di DPBS con lo 0,02% di albumina sierica bovina e un milligrammo per millilitro di DNA o terreno preferito. Per reus, sospendere le cellule dissociate. Passare le cellule attraverso un filtro da 40 microgrammi prima di eseguire la selezione dei fatti e l'estrazione del DNA o dell'RNA secondo il protocollo di testo.

Dopo aver progettato primer contro una sequenza di DNA convertito con bi solfito e amplificato il DNA secondo il protocollo di testo mediante solfito, convertire da 500 a 1000 nanogrammi di DNA di ciascun campione e standard di DNA metilato che vanno da zero a 100% dalla stessa specie animale utilizzando una DNA polimerasi preferita e cinque primer micromolari. Impostare reazioni da 20 microlitri per l'amplificazione Ms HRM. Secondo questa tabella, eseguire tutti i campioni, inclusi fax, DNA e standard metilati in triplicato a seconda del software di analisi impostato, dei parametri pre e post inizio e arresto intorno alle transizioni della curva di fusione.

Impostare i parametri prem melt, start e prem melt stop. Quindi la differenza tra i due è compresa tra 0,2 e 0,5 gradi Celsius. Impostare il post-fusione, l'avvio e l'arresto in modo simile ed estrarre i dati sulla differenza di temperatura di picco per ciascun campione utilizzando gli standard di percentuale metilata e le corrispondenti differenze di temperatura di picco.

Genera un'equazione di regressione lineare. Utilizzare questa equazione di regressione lineare per stimare lo stato di metilazione di campioni sconosciuti dopo aver identificato le isole CPG di interesse e aver amplificato e clonato il plasmide Luke Two dell'isola CPG secondo il protocollo di testo. Utilizzare il software di taglio preferito per verificare i siti di restrizione, digerire per evitare doppi tagli e linearizzare 30 microgrammi di plasmide una volta che il campione è stato digerito con gli enzimi appropriati.

Il calore inattiva gli enzimi alla temperatura e alla durata appropriate in reazioni da 50 microlitri. Utilizzare cinque unità di metilato CPG per metilato. 700 microgrammi di plasmidi linearizzati a 30 gradi Celsius per 13-19 ore.

Dopo aver pulito il DNA come indicato nel protocollo di testo, eseguire un digest HPA a due restrizioni su campioni di un microgrammo di DNA metilato incubando a 37 gradi Celsius per un'ora. Dopo aver pulito il DNA, eseguire i campioni su un gel di DNA all'1% a 100 volt per 45 minuti per la visualizzazione. Successivamente, plasmidi metilati e non metilati a doppia digestione con enzimi di restrizione appropriati durante la notte per rilasciare i frammenti di due vettori e isole CPG di Luke a tutta lunghezza.

Il calore inattiva gli enzimi dopo la digestione. Eseguire i campioni a doppia digestione su un gel agros all'1% di DNA a 100 volt per un'ora per separare il vettore e inserirlo mentre si indossa una protezione contro i raggi UV, posizionare il gel su una luce nera e con lame chirurgiche pulite, asportare gli inserti metilati e non metilati dopo l'estrazione del DNA da parte del gel secondo il protocollo di testo, utilizzare T quattro DNA ligasi e un rapporto da uno a quattro del vettore da inserire per relegare gli inserti metilati e non metilati in un vettore non metilato. Incubare a 20 gradi Celsius negativi o su ghiaccio durante la notte dopo la legatura.

Pulire il DNA e verificare la legatura analizzando i campioni su un gel aros all'1% di DNA e valutare la concentrazione di cellule plasmidi CD 54 legate su una piastra a 12 pozzetti a 140.000 cellule per pozzetto, 24 ore dopo. Utilizzare un reagente di trasfezione commerciale per trasfettare cellule con concentrazioni uguali di plasmide non metilato CPG loop due più RAN vanilla o altro vettore feroce di controllo o clone metilato c pg Luke due plasmidi più ELLA o altro vettore di luciferi di controllo Lasciare che le cellule trasfettino per 24 ore prima di eseguire un saggio dei luciferi.

Secondo le istruzioni del produttore, utilizzare il luminometro per leggere ogni pozzetto in triplice copia. Calcola il rapporto tra l'attività dei luciferi della lucciola e la vaniglia o altri controlli. Attività di Lucifero.

Normalizzare l'attività della luciferasi di controllo della lucciola metilata all'attività della luciferasi di controllo della lucciola non metilata dividendo l'attività metilata per l'attività luc metilata. Come dimostrato qui, una popolazione arricchita di astrociti è stata acquisita tramite smistamento via fax di animali transgenici E-G-F-P-S 100 beta. È stata individuata una popolazione gated in base alla dispersione diretta e laterale e una popolazione di cellule vive è stata determinata utilizzando un indicatore di cellule morte al bromuro e il gating mostrati qui sono immagini rappresentative di astrociti positivi per EGFP dopo la dissociazione, ma prima dello smistamento e dopo lo smistamento, questa figura mostra una popolazione cellulare isolata positiva per EGFP che ha dimostrato un aumento di 40 volte dell'mRNA per il marcatore specifico degli astrociti.

A LDH uno L uno. Inoltre, nonostante l'espressione condivisa di S 100 beta e NG due OPC e astrociti positivi, è stata osservata una riduzione di quattro volte dell'mRNA di NG due, un marcatore per le cellule precursori degli oligodendrociti, che indica l'isolamento di una popolazione di cellule astrocitiche arricchita. Questa tabella elenca l'RNA e il DNA totali, isolati da età e numero variabili di animali, ed è elencata come riferimento per la resa attesa delle molecole molecolari in base ai fatti.

Infine, è stato utilizzato un doppio saggio di luciferi per valutare l'attività trascrizionale delle regioni ipermetilate del gene di interesse dopo aver spostato l'inserto metilato in un vettore non metilato. L'HPA due, che digerisce solo il DNA non metilato, è stato utilizzato per verificare lo stato di metilazione del plasmide. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare una popolazione arricchita di astrociti utilizzando i fatti, nonché di come misurare la metilazione del DNA di un gene e correlare i cambiamenti nella metilazione del DNA del promotore con l'attività trascrizionale utilizzando rispettivamente l'analisi del fuso ad alta risoluzione sensibile alla metilazione e il saggio della luciferasi.