Analisi completa della metilazione del DNA usando un metodo basato sulla cattura di dominio di metile-CpG in pazienti con leucemia linfocitica cronica

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare il profilo di metilazione globale e identificare regioni ricche di CpG differenzialmente metilate in pazienti affetti da leucemia linfocitica cronica mediante sequenziamento di nuova generazione. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'epigenetica, come l'identificazione di geni con firma potenzialmente specifica per la CLL, la patogenesi della malattia e la prognosi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce una copertura completa a livello del genoma della metilazione dei CpG in modo imparziale e indipendente dalla PCR.

Per iniziare, utilizzare un kit commerciale per l'estrazione di DNA per isolare il DNA genomico dai campioni di pazienti e di cellule mononucleate del sangue periferico normali, seguendo il protocollo del produttore. Dopo aver quantificato il DNA genomico come descritto nel protocollo testuale, diluire 5 microgrammi di DNA genomico da ciascun campione fino a un volume totale di 200 microlitri utilizzando buffer TE, ottenendo una concentrazione finale di 25 nanogrammi per microlitro. Successivamente, eseguire la sonificazione in provette appositamente progettate, utilizzando un sonicatore, per un totale di 30 cicli di 30 secondi accesi e 30 secondi spenti.

Dopo ogni cinque cicli, centrifugare brevemente i tubi per raccogliere i campioni sul fondo. Verificare l'entità della sonica per tutti i campioni mediante elettroforesi del DNA come descritto nel protocollo testuale. Per preparare le perle magnetiche di streptavidina, sospenderle innanzitutto dal tubo di partenza fornito nel kit.

Pipettare delicatamente i campioni su e giù per ottenere una sospensione omogenea. Per ogni cinque microgrammi di campione di DNA frammentato, aggiungere 50 microlitri di perline in provette separate, pulite ed etichettate da 1,5 millilitri. Aggiungere 50 microlitri di buffer di lavaggio per perline 1X per raggiungere un volume finale di 100 microlitri.

Posizionare le provette su un supporto magnetico per un minuto, in modo che tutte le microsferette magnetiche si concentrino sulla parete interna della provetta rivolta verso il magnete. Rimuovere il liquido senza toccare le microsferette, utilizzando una pipetta da 200 microlitri. Successivamente, rimuovere le provette dal supporto magnetico, aggiungere 250 microlitri di tampone di lavaggio per microsferette 1X e miscelare delicatamente le microsferette con una pipetta.

Dopo aver ripetuto questi passaggi almeno quattro volte per tutti i campioni, risospendere infine i campioni in 250 microlitri di tampone di lavaggio per perle 1X. Mantenere i campioni sul ghiaccio. Per legare la proteina MBD-biotina alle perle lavate, aggiungere prima 35 microlitri di proteina a provette separate e portare il volume totale a 250 microlitri utilizzando il tampone di lavaggio per perle 1X.

Aggiungere 250 microlitri di proteina MBD diluita ai 250 microlitri di perle lavate e lasciare in rotazione endo-endos su un agitatore rotante a temperatura ambiente. Dopo aver mescolato le perle con la proteina per un'ora, lavare le perle magnetiche di streptavidina legate alla proteina posizionando i tubi sul supporto magnetico per un minuto. Rimuovere il liquido senza toccare le perle utilizzando una pipetta.

Quindi, aggiungere 250 microlitri di buffer di lavaggio per perline 1X e posizionare i tubi su un agitatore rotante per cinque minuti a temperatura ambiente. Ripetere il passaggio di lavaggio altre due volte prima di risospendere le perline MBD-biotina lavate in 200 microlitri di buffer di lavaggio per perline 1X, rendendo le perline pronte per la cattura del DNA metilato. In un tubo pulito da 1,5 millilitri privo di DNasi, aggiungere 100 microlitri di buffer di lavaggio per perline al millilitro e 180 microlitri di DNA genomico frammentato.

Portare il volume finale a 500 microlitri utilizzando acqua priva di DNasi. Aggiungere 380 microlitri di acqua priva di DNasi ai restanti 20 litri di DNA genomico frammentato. Congelare i campioni per successivi trattamenti e utilizzarli come controlli di DNA in ingresso.

Posizionare le provette contenenti le perle MBD-biotin lavate su un supporto magnetico per un minuto ed eliminare il liquido senza disturbare le perle. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di DNA genomico frammentato diluito nel buffer di lavaggio delle perle. Chiudere ermeticamente tutte le provette con pellicola di paraffina e lasciarle in agitazione rotatoria end-to-end durante la notte a 4 gradi Celsius, a 8-10 rotazioni al minuto.

Dopo la reazione di legame tra il DNA e le perle MBD, posizionare le provette sul supporto magnetico per un minuto in modo da concentrare tutte le perle sulla parete interna del tubo. Rimuovere il liquido sovranatante con una pipetta senza toccare le perle e conservare questa frazione campionaria di DNA non legato sul ghiaccio. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di buffer di lavaggio per perle 1X alle perle e posizionare le provette sul supporto rotante per tre minuti a temperatura ambiente.

Dopo aver rimosso il liquido utilizzando il supporto magnetico, ripetere il lavaggio altre due volte per eliminare il DNA non legato residuo. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 200 microlitri di tampone di eluizione ad alto contenuto salino fornito nel kit per eluire il DNA. Successivamente, posizionare le provette sul supporto rotante per 15 minuti a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione, posizionarli sul supporto magnetico per un minuto ed utilizzare una pipetta per trasferire con attenzione il soprannatante in un nuovo tubo da 1,5 millilitri, pulito. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di tampone di eluizione ad alto contenuto salino alle perle e ripetere l'eluizione ruotando i tubi a temperatura ambiente per ulteriori 15 minuti. Aggiungere il secondo eluato allo stesso tubo contenente i 200 microlitri del primo eluato.

Per precipitare il DNA, aggiungere un microlitro di glicogeno, 40 microlitri di acetato di sodio tre molar, pH 5,2, e 800 microlitri di etanolo assoluto ghiacciato a 400 microlitri di DNA eluito. Aggiungere anche i reagenti ai campioni di controllo di DNA in ingresso precedentemente congelati da 400 microlitri. Mescolare bene i tubi mediante vortex prima di incubarli a meno 80 gradi Celsius per tutta la notte.

Il giorno successivo, centrifugare i tubi a 12.000 ×g e a 4 gradi Celsius per 30 minuti. Rimuovere con attenzione il soprannatante senza disturbare il pellet. Quindi, aggiungere 500 microlitri di etanolo al 70% e vortexare i tubi.

Dopo aver centrifugato nuovamente i tubi nelle stesse condizioni, ma per 15 minuti, rimuovere il soprannatante utilizzando con attenzione una pipetta. Successivamente, centrifugare i tubi alla velocità massima per un minuto a temperatura ambiente e rimuovere completamente l'etanolo residuo utilizzando la punta di una pipetta. Lasciare asciugare il pellet all'aria per cinque minuti a temperatura ambiente.

Infine, aggiungere 10 microlitri di acqua priva di DNasi al pellet di DNA prima di procedere alla quantificazione del DNA metilato, al sequenziamento MBD e all'analisi come descritto nel protocollo testuale. L'analisi ha identificato diverse regioni iper- e ipometilate in modo differenziale, arricchite nei campioni di CLL rispetto ai controlli normali. Queste regioni metilate in modo differenziale sono state mappate su diverse classi di geni codificanti e non codificanti per proteine.

Infine, l'analisi dei dati ha mostrato un notevole sovrapposizione tra le regioni differenzialmente metilate associate alla LLC ottenute da due diversi confronti con controlli normali. In questo caso, tutti i siti CpG localizzati nelle regioni bersaglio di due geni differenzialmente metilati sono stati convalidati in un elevato numero di campioni di LLC mediante pirosequenziamento. Qui viene illustrato il range ottimale di sonificazione richiesto per questo metodo.

Questo intervallo di DNA frammentato è ideale e più adatto per scopi di sequenziamento di nuova generazione. Una volta appresa, questa tecnica può essere eseguita in due giorni se effettuata correttamente. Nell'esecuzione di questa procedura, i fattori cruciali che influenzano il recupero finale del DNA sono la qualità e la quantità del DNA in ingresso utilizzato e l'intervallo del DNA frammentato dopo la sonificazione.

Abbiamo deciso di utilizzare questo metodo perché si tratta dello studio globale sulla metilazione nel CLL basato sull'immunoprecipitazione per l'arricchimento del DNA metilato, che copre tutte le regioni metilate attraverso il genoma. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla prognosi o alla terapia, poiché i geni con firme di metilazione differenziale identificati potrebbero fungere da biomarcatori normali globali e da bersagli epigenetici per la terapia. Dopo questa procedura, il DNA metilato arricchito può essere utilizzato per altre applicazioni a valle, come ibridazioni o microarray, per confrontare facilmente i metallocomi tra due campioni o entità patologiche utilizzando un insieme fisso di siti CpG presenti sugli array.

Infine, questa è una tecnica economicamente vantaggiosa per analizzare un elevato numero di campioni di pazienti alla ricerca di sequenze metilate lungo il genoma, inclusi sequenze annotate che comprendono geni codificanti per proteine, così come sequenze non annotate che comprendono elementi ripetitivi e RNA lunghi non codificanti.