Analisi completa della metilazione del DNA usando un metodo basato sulla cattura di dominio di metile-CpG in pazienti con leucemia linfocitica cronica

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare il profilo di metilazione globale e identificare le regioni ricche di CpG differenzialmente metilate nei pazienti con leucemia linfatica cronica utilizzando il sequenziamento di nuova generazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'epigenetica, come l'identificazione dei potenziali geni di firma specifici per la LLC, la patogenesi della malattia e la prognosi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una copertura completa dell'intero genoma della metilazione CpG in modo imparziale e indipendente dalla PCR.

Per iniziare, utilizzare un kit di estrazione del DNA disponibile in commercio per isolare il DNA genomico dal paziente e campioni di cellule mononucleate del sangue periferico normale secondo il protocollo del produttore. Dopo aver quantificato il DNA genomico come descritto nel protocollo di testo, diluire 5 microgrammi di DNA genomico da ciascun campione, per un totale di 200 microlitri utilizzando il tampone TE, ottenendo una concentrazione finale di 25 nanogrammi per microlitro. Successivamente, eseguire la sonicazione in tubi appositamente progettati, utilizzando un sonicatore, per un totale di 30 cicli di 30 secondi di accensione e 30 secondi di spegnimento.

Dopo ogni cinque cicli, far girare brevemente le provette per raccogliere i campioni sul fondo. Controllare l'intervallo di sonicazione per tutti i campioni utilizzando l'elettroforesi del DNA come descritto nel protocollo di testo. Per preparare le perle di streptavidina magnetica, prima risospenderle dal tubo di base fornito dal kit.

Pipettare delicatamente le perle su e giù per ottenere una sospensione omogenea. Per ogni cinque microgrammi di campione di DNA frammentato, mettere 50 microlitri di perle in provette da 1,5 millilitri separate, pulite ed etichettate. Aggiungere 50 microlitri di tampone per il lavaggio delle perle 1X per raggiungere un volume finale di 100 microlitri.

Posizionare i tubi su un supporto magnetico per un minuto in modo che tutte le perle magnetiche si concentrino sulla parete interna del tubo rivolta verso il magnete. Rimuovere il liquido senza toccare le perline, utilizzando una pipetta da 200 microlitri. Quindi, rimuovere i tubi dal supporto magnetico, aggiungere 250 microlitri di tampone per il lavaggio delle perle 1X e mescolare delicatamente le perle con una pipetta.

Dopo aver ripetuto questi passaggi almeno quattro volte per tutti i campioni, infine risospendere i campioni in 250 microlitri di tampone di lavaggio delle perle 1X. Mantieni i campioni sul ghiaccio. Per legare la proteina MBD-biotina alle perle lavate, aggiungere prima 35 microlitri di proteina per separare i tubi e portare il volume totale fino a 250 microlitri utilizzando il tampone di lavaggio delle perle 1X.

Aggiungere 250 microlitri di proteina MBD diluita ai 250 microlitri di perle lavate e lasciarle in rotazione end-to-end a temperatura ambiente. Dopo aver mescolato le perle di proteine per un'ora, lavare le perle di streptavidina magnetica legate alle proteine posizionando i tubi sul supporto magnetico per un minuto. Rimuovere il liquido senza toccare le perle utilizzando una pipetta.

Quindi, aggiungere 250 microlitri di tampone per il lavaggio delle perline 1X e posizionare le provette su un miscelatore a rotazione per cinque minuti a temperatura ambiente. Ripetere la fase di lavaggio altre due volte prima di risospendere le perle di biotina MBD lavate in 200 microlitri di tampone di lavaggio delle perle 1X, rendendo le perle pronte per la cattura del DNA metilato. In una provetta pulita da 1,5 millilitri priva di DNasi, aggiungere 100 microlitri di tampone per il lavaggio delle perle da millilitri e 180 microlitri di DNA genomico frammentato.

Portare il volume finale a 500 microlitri utilizzando acqua priva di DNasi. Aggiungere 380 microlitri di acqua priva di DNasi ai restanti 20 litri di DNA genomico frammentato. Congelare i campioni per elaborarli ulteriormente e utilizzarli come controlli del DNA in ingresso.

Posizionare i tubi contenenti le perle di biotina MBD lavate su un supporto magnetico per un minuto e rimuovere il liquido senza disturbare le perline. Quindi, aggiungere 500 microlitri di DNA genomico frammentato diluito in tampone per il lavaggio delle perle. Sigillare ermeticamente tutte le provette con pellicola di paraffina e lasciarle per una notte a 4 gradi Celsius su un supporto di rotazione end-to-end a 8-10 rotazioni al minuto.

Dopo la reazione di legame del DNA e delle microsfere MBD, posizionare le provette sulla rastrelliera magnetica per un minuto per concentrare tutte le perle sulla parete interna della provetta. Rimuovere il liquido surnatante con una pipetta senza toccare le perle e conservare questa frazione del campione di DNA non legato sul ghiaccio. Quindi aggiungere 200 microlitri di tampone per il lavaggio delle perline 1X alle perline e posizionare i tubi sul supporto rotante per tre minuti a temperatura ambiente.

Dopo aver rimosso il liquido utilizzando il supporto magnetico, ripetere il lavaggio altre due volte per rimuovere il DNA residuo non legato. Dopo il lavaggio finale, aggiungere 200 microlitri di tampone di eluizione ad alto contenuto di sale fornito nel kit per eluire il DNA. Quindi, posizionare i tubi sul supporto rotante per 15 minuti a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione, posizionarli sul supporto magnetico per un minuto e utilizzare una pipetta per trasferire con cura il surnatante in una nuova provetta pulita da 1,5 millilitri. Quindi, aggiungere 200 microlitri di tampone di eluizione ad alto contenuto di sale alle perle e ripetere l'eluizione ruotando le provette a temperatura ambiente per altri 15 minuti. Aggiungere il secondo eluito nello stesso tubo contenente i 200 microlitri del primo eluito.

Per precipitare il DNA, aggiungere un microlitro di glicogeno, 40 microlitri di acetato di sodio a tre molari, pH 5,2 e 800 microlitri di etanolo assoluto ghiacciato a 400 microlitri di DNA eluito. Aggiungere i reagenti anche ai 400 microlitri precedentemente congelati dei campioni di controllo del DNA in ingresso. Mescolare bene i tubi vorticando prima di incubarli a meno 80 gradi Celsius durante la notte.

Il giorno successivo, centrifugare le provette a 12.000 volte g e 4 gradi Celsius per 30 minuti. Scartare il surnatante con cura senza disturbare il pellet. Quindi, aggiungere 500 microlitri di etanolo al 70% e agitare i tubi.

Dopo aver centrifugato nuovamente le provette nelle stesse condizioni ma per 15 minuti, rimuovere il surnatante utilizzando con cautela una pipetta. Quindi, centrifugare le provette alla massima velocità per un minuto a temperatura ambiente e rimuovere completamente l'etanolo residuo utilizzando un puntale per pipetta. Asciugare il pellet all'aria per cinque minuti a temperatura ambiente.

Infine, aggiungere 10 microlitri di acqua priva di DNasi al pellet di DNA prima di procedere alla quantificazione del DNA metilato, al sequenziamento MBD e all'analisi come descritto nel protocollo di testo. L'analisi ha identificato diverse regioni differenzialmente iper- e ipometilate arricchite nei campioni di LLC rispetto ai controlli normali. Queste regioni differenzialmente metilate sono state mappate su diverse classi di geni codificanti e non codificanti per proteine.

Infine, l'analisi dei dati ha mostrato una significativa sovrapposizione tra le regioni differenzialmente metilate associate alla LLC ottenute da due diversi confronti di controllo normale. Qui, tutti i siti CpG situati nelle regioni bersaglio di due geni differenzialmente metilati sono stati validati in un gran numero di campioni di LLC utilizzando il pirosequenziamento. L'intervallo ottimale di sonicazione richiesto per questo metodo è illustrato qui.

Questa gamma di DNA frammentato è ideale e più adatta per scopi di sequenziamento di nuova generazione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, i fattori cruciali che influenzano il recupero finale del DNA sono la qualità e la quantità di DNA in ingresso utilizzato e l'intervallo del DNA frammentato dopo la sonicazione.

Abbiamo deciso di utilizzare questo metodo perché è il primo studio di metilazione globale della LLC basato sull'immunoprecipitazione per l'arricchimento del DNA metilato che copre tutte le regioni metilate del genoma. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla prognosi o alla terapia perché i geni di firma differenzialmente metilati identificati potrebbero fungere da biomarcatori normali globali e bersagli epigenetici per la terapia. Seguendo questa procedura, il DNA metilato arricchito può essere utilizzato per altre applicazioni a valle come l'ibridazione o l'esecuzione di microarray per confrontare facilmente i metalomi tra due campioni o entità patologiche utilizzando un insieme fisso di siti CpG presenti sugli array.

Infine, questa è una tecnica conveniente per analizzare un gran numero di campioni di pazienti alla ricerca di sequenze metilate in tutto il genoma, comprese le sequenze annotate che abbracciano geni codificanti proteine e sequenze non annotate che abbracciano elementi ripetitivi e lunghi RNA non codificanti.