Fluorescenza tomografia molecolare per l'Imaging In Vivo di Glioblastoma xenotrapianti

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è quello di stabilire un modello preclinico di imaging del tumore cerebrale utilizzando la tomografia molecolare a fluorescenza o FMT. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi della biologia dei tumori cerebrali, della ricerca sul cancro e della scoperta di farmaci sull'aggressività del tumore, l'eterogeneità e la reattività al trattamento. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i tumori possono essere monitorati in vivo prima, durante o dopo il trattamento in modo non invasivo, senza suture e quantitativo.

Un altro vantaggio di questa tecnica è la possibilità di applicarla ad altri tipi di modelli di xenotrapianto impiantati in diversi organi dell'animale. Inizia seminando una volta da 10 a sesta cellule di glioblastoma in cinque millilitri di terreno in un piatto di 10 centimetri per un'incubazione di 24 ore in un incubatore di colture cellulari. La mattina successiva, trasdurre le cellule con lentivirus, esprimendo un'appropriata proteina fluorescente di interesse a una molteplicità di infezione di cinque e riportare le cellule nell'incubatore.

Dopo 24 ore, sostituire il surnatante con cinque millilitri di terreno fresco e incubare la coltura per altre 48 ore. Al termine dell'incubazione, sostituire il terreno con tre-cinque millilitri di tripson per 10-15 minuti a 37 gradi Celsius, seguito da un attento pipettaggio per dissociare completamente le cellule staccate. Raccogliere le celle per centrifugazione e risospendere il pellet in 500 microlitri di soluzione di selezione.

Dividere le celle in un numero appropriato di tubi fax e colorare le celle con DAPI per l'esclusione delle celle morte. Quindi caricare le provette sul citometro a flusso e selezionare le cellule vive in base alla loro espressione di costrutto fluorescente in una provetta conica da 15 millilitri contenente una soluzione di selezione fresca. Dopo la centrifugazione, sospendere nuovamente le cellule positive al costrutto e DAPI negative in cinque millilitri di terreno di coltura e seminarle su un nuovo piatto da 10 centimetri per la loro coltura a 37 gradi Celsius per 48-72 ore.

Al termine dell'incubazione, dividere le cellule per la semina in più piastre per i successivi esperimenti in vivo. Il giorno dell'iniezione, dissociare le gliocellule fluorescenti positive in una singola sospensione cellulare e risospenderle a 0,5 o una volta 10 per le seste cellule per due o cinque microlitri di PBS per iniezione per concentrazione animale in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri su ghiaccio. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita, applicare l'unguento sugli occhi del topo ricevente Athymic Nude immunodeficiente e caricare una siringa Hamilton da cinque microlitri dotata di un ago con punta smussata con le cellule per l'iniezione.

Montare la siringa in un supporto per sonda e posizionare il mouse in una piccola cornice sterotattica animale. Fissare la testa utilizzando le barre auricolari e l'adattatore per incisivi e disinfettare la testa con una soluzione di etanolo al 70% e batadina. Usando un piccolo bisturi, fai un'incisione centrale e separa la pelle e i tessuti connettivi.

Utilizzando il micromanipolatore, posizionare la siringa di Hamilton sul punto di bregma e spostare il supporto della sonda di un millimetro anteroposteriore e di due millimetri lateralmente dal punto di bregma. Dopo aver segnato la posizione con una matita, utilizzare un trapano portatile a micromotore per praticare con cura un foro nel cranio, applicando una leggera pressione verso il basso fino a quando i vasi sanguigni diventano visibili. Introdurre l'ago nel foro della fresa tre millimetri sotto la superficie del pial e iniettare le cellule a un flusso di un microlitro al minuto a destra.

Quando l'intero volume della cellula sperimentale è stato iniettato, rimuovere gradualmente l'ago a una velocità di ascensione di un millimetro al minuto e pulire il sito di iniezione con etanolo al 70%. Quindi chiudere la ferita cutanea secondo i protocolli standard e monitorare l'animale su un cuscinetto riscaldante fino a quando non si è completamente ripreso. Per visualizzare le cellule iniettate, posizionare l'animale ricevente anestetizzato nella cassetta di imaging di un imager per tomografia molecolare a fluorescenza, l'adattatore della testa prima in posizione prona, con la testa al centro della cassetta.

Con la cassetta chiusa, serrare le manopole di regolazione a 17 millimetri. Quando l'animale è al sicuro, inserire la cassetta nella docking station interna e aprire il software dell'imager e dell'analizzatore. Nella finestra della scheda sperimentale, selezionare il database e il gruppo di studio appropriati e aprire la finestra della scheda di scansione.

Fare clic su Seleziona soggetto per selezionare il soggetto da acquisire e selezionare il canale laser nel pannello del canale laser. Fare clic su Acquisisci per acquisire un'immagine e fare clic e trascinare il campo di scansione nell'immagine acquisita per identificare le posizioni di origine. Seleziona l'opzione aggiungi alla que di ricostruzione e fai clic su Scansione nella finestra della scheda Scansione.

Al termine della scansione, rimuovere la cassetta di imaging dalla docking station e riportare l'animale nella sua gabbia con monitoraggio fino al completo recupero. Per analizzare le immagini, nel software dell'imager e dell'analizzatore aprire la finestra della scheda di analisi e fare clic sul pulsante con il segno più nel pannello di selezione del set di dati per caricare il set di dati e l'oggetto per l'analisi. Quindi utilizzare l'icona dell'ellissoide per selezionare la regione di interesse e fare clic con il pulsante destro del mouse sulla colonna della soglia per regolare la soglia a zero nel pannello dei dati statistici.

Le cellule di glioblastoma marcate con proteine fluorescenti nel vicino infrarosso, come appena dimostrato, mostrano profili fluorescenti distinti che possono essere distinti dalla tomografia molecolare a fluorescenza, anche fino a cinque giorni dopo l'iniezione. Inoltre, la mancanza di segnale di fondo tra i costrutti facilita l'imaging duale in vivo delle popolazioni di cellule tumorali di interesse. In questo esperimento, sfere di glioblastoma marcate con costrutto fluorescente co-trasdotte con lentivirus che codificano SHRNA mirando alla proteina associata al dominio di morte sono state iniettate in topi nudi atimici immunodeficienti riceventi, come appena dimostrato.

La reazione a catena preliminari quantitativi a trascrizione inversa ha confermato l'efficacia del targeting SHRNA in entrambe le linee cellulari tumorali e la tomografia molecolare a fluorescenza ha rivelato una diminuzione del segnale di fluorescenza nei topi trapiantati con sfere di glioblastoma SHRNA rispetto agli animali impiantati con cellule trasdotte di controllo SH. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare dati preclinici per la ricerca sul cancro al cervello utilizzando un sistema di tomografia molecolare a fluorescenza.