Name: Fluorescenza tomografia molecolare per lImaging In Vivo di Glioblastoma xenotrapianti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Scopri la tomografia molecolare a fluorescenza per l'imaging preclinico del glioblastoma in vivo. Questo metodo non invasivo consente il monitoraggio quantitativo dei tumori cerebrali e la valutazione delle risposte terapeutiche.

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Si ringrazia il Dr. Frederick Lang, MD Anderson Cancer Center per GBM-PDX neurosfere. Questo lavoro è stato supportato dalla sconfitta GBM ricerca collaborativa, una sussidiaria della National cervello tumore Society (Frank Furnari), R01-NS080939 (Frank Furnari), James S. McDonnell Foundation (Frank Furnari); Jorge Benitez è stato sostenuto da un premio dall'American cervello tumore Association (ABTA); Ciro Zanca parzialmente è stato supportato da una borsa di ricerca post-dottorato American-Italian Cancer Foundation. Frank Furnari riceve stipendio e ulteriore supporto del Ludwig Institute for Cancer Research.

L'uso di animali di ricerca sperimentale e agenti infettivi, quali lentivirus trasduce le cellule tumorali, richiedono la previa approvazione dal programma istituzionale cura degli animali e dal Comitato istituzionale biosicurezza. Questo protocollo segue le indicazioni di cura degli animali dell'Università della California di San Diego (UCSD).
1. etichettatura delle cellule di Glioblastoma con FP635 o costrutto FP720
<ol><li>Produrre e purificare lentivirus secondo il protocollo descritto da Tiscornia et al. 12
</li>
	<li>Circa 2.0 x 106 cellule da una linea di cellule di glioma umano DMEM con 10% siero bovino fetale (FBS) in un piatto di 15 cm; o cultura 2.0 x 106 glioblastoma umano paziente-derivato (GBM-PDX) sfere con DMEM/F12 1:1 medium con B27 supplemento più umano ricombinante fattore di crescita epidermico (EGF; 20 ng/mL) e FGF (10 ng/mL) in un matraccio da T75.</li>
	<li>Mantenere tutte le celle a 37 ° C, 5% CO2e 100% di umidità relativa.</li>
	<li>Dissociare le cellule.<ol>
<li>Per le cellule di glioma: rimuovere il surnatante delle placche e l'aggiunta di 3-5 mL di tripsina 1 X per le cellule di glioma.</li>
		<li>Per il GBM sfere: raccogliere le cellule pipettando le cellule in una provetta da 15 mL.<ol>
<li>Rotazione verso il basso le sfere GBM a 200 x g per 5 min utilizzando una centrifuga da tavolo a temperatura ambiente.</li>
			<li>Rimuovere il supernatante e aggiungere 3-5 mL di soluzione di distacco delle cellule.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Incubare tutte le celle a 37 ° C per 10-15 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Attentamente dissociare le cellule pipettando su e giù per diverse volte (accertarsi che siano completate le cellule di glioma e sfere dissociato) e spin giù a 200 x g per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere le cellule con 5 mL di terreno pipettando su e giù più volte. Determinare l'attuabilità delle cellule dall'esclusione del blu di trypan.</li>
	<li>Piastra di 1.0 x 106 delle cellule bersaglio in un piatto di 10 cm con 5 mL di terreno di pipettaggio.</li>
	<li>Trasducono cellule con lentivirus che esprimono le proteine fluorescenti alle molteplicità di infezione (MOI) 5 come è descritto da Tiscornia et al. 12 e incubare a 37 ° C.</li>
	<li>Dopo 24 h, rimuovere il supporto dalle cellule trasdotte, aggiungere 5 mL di terreno nuovo e incubare per altre 48 ore a 37 ° C.</li>
	<li>Dissociare le cellule infette in sospensione unicellulare come descritto nei passaggi 1.4-1.6. Rotazione verso il basso le cellule a 200 x g per 5 min e risospendere in 500 µ l di soluzione di ordinamento (tampone fosfato salino (PBS) con 1% FBS).</li>
	<li>Dispensare la sospensione delle cellule in provetta di FACS. Co-macchia le celle con 1 µ l/mL di 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dicloridrato di escludere le cellule morte. Controlli negativi sono necessari per impostare le porte di cytometer di flusso (cellule non trasdotte e cellule non trasdotte / DAPI macchiato).</li>
	<li>Ordinare le cellule fluorescenti-positivo/DAPI-negativo in ordinamento soluzione, come descritto da Basu et al. 13e raccogliere le cellule ordinate in una provetta conica da 15 mL.</li>
	<li>Rotazione verso il basso le cellule ordinate a 200 x g per 5 min, rimuovere il supernatante e risospendere in 5 mL di terreno di coltura. Seme le cellule ordinate in un piatto di 10 cm di pipettaggio. Incubare a 37 ° C per almeno 48-72 h.</li>
	<li>Espandere le cellule ordinate dissociando le cellule come segue: 1.4-1.6 e placcatura in più piatti per gli esperimenti in vivo . Nota: Per ulteriori dettagli sulla cella ordinamento preparazione e purificazione, vedere Basu et al. 13
</li>
</ol>2. iniezione intracranico delle cellule di Glioblastoma iRFP-etichetta in topi immunodeficienti
Nota: Prima di iniziare l'intervento chirurgico, assicurarsi che la sala operatoria e gli strumenti sono puliti per la procedura. Utilizzare immunodeficienti topi nudi athymic (Foxn1nu) maschi o femminili, tra 4-5 settimane vecchie e 17-19 g per iniezioni intracraniche. Gli animali devono essere alloggiati per almeno 3 giorni dopo l'arrivo e prima della chirurgia.
<ol><li>Preparazione delle cellule<ol>
<li>Raccolto e dissociare fluorescente positiva-glioma cellule in sospensione unicellulare (passaggi 1.4-1.6) e risospendere 0.5 o 1.0 x 106 cellule in 2-5 µ l di PBS per iniezione per animale. Dispensare la sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e posto sul ghiaccio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Amministrazione e preparazione di anestesia<ol>
<li>Preparare 200 µ l di soluzione fisiologica contenente ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) per 20 grammi di peso corporeo del mouse. Pesare gli animali e calcolare la dose appropriata di anestesia.</li>
		<li>Fornire un'iniezione intraperitoneale dell'anestesia e applicare unguento oftalmico agli occhi per prevenire la disidratazione. Per maggiori dettagli su questa operazione, vedere Kathleen et al. 14 Place l'animale su un pad termico acqua pre-riscaldata a 37 ° C.</li>
		<li>Controllare che gli animali sono anestetizzati dal monitoraggio della risposta di pizzico di punta (pedale reflex), di solito entro 5-10 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Intracranica iniezione<ol>
<li>Caricare un 5 µ l siringa Hamilton (ago a punta smussata) con sospensione cellulare e montare nel porta-sonda.</li>
		<li>Posizionare il mouse in una piccola cornice stereotassica animale e fissate la testa utilizzando le barre di orecchio e l'adattatore di incisivo seguendo i dettagli descritti da Cetin et al. 15
</li>
		<li>Disinfettare la testa con soluzione 70% di etanolo e betadine. Assicurarsi che è completato il sito chirurgico sterile. Eseguire un'incisione centrale con un piccolo bisturi e separare la pelle e i tessuti connettivi.</li>
		<li>Posizionare la siringa Hamilton sul punto di bregma utilizzando il micromanipolatore.</li>
		<li>Spostare la sonda titolare 1,0 mm anteroposteriore e 2.0 mm laterale dal punto di bregma. Segnare con una matita la posizione.</li>
		<li>In questa posizione, attentamente fare un buco nel cranio con un trapano portatile micromotore da esercitando una leggera pressione verso il basso fino a quando i vasi sanguigni diventano visibili. Non interrompere il parenchima aracnoide mater e cervello.</li>
		<li>Introdurre l'ago nel foro della bava e avanzare 3,0 mm sotto la superficie pial.</li>
		<li>Impostare il volume (2-5 µ l) e portata (1 µ l/min) di iniezione utilizzando un iniettore stereotassica motorizzato o eseguire manualmente l'iniezione.</li>
		<li>Dopo l'iniezione, rimuovere l'ago gradualmente salendo 1,0 mm ogni 1 min e pulire il sito di iniezione con etanolo al 70%.</li>
		<li>Nelle vicinanze la pelle ferita con graffette chirurgiche o facendo le suture chirurgiche (spesso denominate punti di sutura) e vedere Kathleen et al. 14 per maggiori dettagli.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recupero degli animali<ol>
<li>Trasferire l'animale a un pad termico acqua (37 ° C) e monitorare la temperatura corporea, frequenza respiratoria e frequenza cardiaca, fino al recupero completo. Amministrare l'analgesia per protocolli standard. Nota: Per ulteriori informazioni sulla procedura stereotassica, chirurgia e coordinate, vedere altri rapporti5,14,15.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. FMT Imaging
Nota: Secondo lo scopo sperimentale, il glioblastoma iRFP-etichettate le cellule possono essere monitorati in vivo prima, durante o dopo il trattamento. Per scopo di imaging, anestetizzare gli animali utilizzando una camera di induzione di isoflurano, mantenere in una cassetta di formazione immagine durante la scansione e immagine nell'alloggiamento del dispositivo di imaging FMT.
<ol><li>Rimuovere l'animale dalla gabbia e posto nella camera di induzione di isoflurane. Chiudere la camera e attivare il flusso di ossigeno e vaporizzatore per 3-5%.</li>
	<li>Monitorare l'animale fino a quando esso è completamente anestetizzato, solitamente entro 1-2 min inconscio animali non devono rispondere agli stimoli esterni.</li>
	<li>Rimuovere l'animale anestetizzato dalla camera e mettere l'animale nella cassetta imaging inserendo l'adattatore testa in primo luogo, seguita dall'immissione dell'animale rivolto verso il basso. Assicurarsi che la testa si trova nel centro della cassetta.</li>
	<li>Mettere la piastra superiore della cassetta e serrare le manopole di regolazione fino a 17 mm.</li>
	<li>Una volta che l'animale è sicuro nella cassetta di imaging, procedere all'imaging di avere inserito la cartuccia nell'alloggiamento interno del dispositivo di imaging FMT, dove l'isoflurano è pompato per tenere l'animale anestetizzato.</li>
	<li>Eseguire il software imager e analizzatore facendo doppio clic sull'icona del software.</li>
	<li>Nella finestra "Scheda sperimentale", selezionare il "Database" e "Gruppo di studio".</li>
	<li>Passare alla finestra "Scheda scansione" e selezionare l'oggetto immagine facendo clic su "Seleziona il soggetto". Inoltre, è possibile selezionare il canale di laser nel pannello "Canale Laser". Per le cellule FP635-etichetta, selezionare "laser canale 635 nm" e per le cellule FP720-labeled, selezionare "canale 680 nm del laser".</li>
	<li>Acquisire un'immagine facendo clic sull'opzione "Cattura" nella finestra "Scheda di scansione". Quindi, regolare il campo di scansione facendo clic e trascinando il campo di scansione dell'immagine acquisita a un determinato numero di posizioni di origine, solitamente entro 20-25 fonti per il lato ipsilateral.</li>
	<li>Selezionare l'opzione "Aggiungi alla coda di ricostruzione" e colpire "Scan" nella finestra "Scheda di scansione".</li>
	<li>Attendere fino a quando la scansione è completata e quindi rimuovere la cassetta imaging dalla docking station.</li>
	<li>Rimuovere la piastra superiore della cassetta e posto sul retro degli animali in gabbia.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 3.1-3.12 per il resto degli animali.</li>
</ol>4. image Analysis
<ol><li>Dal software imager e analizzatore, selezionare la finestra "Scheda di analisi".</li>
	<li>Caricare il dataset e il soggetto per analizzare facendo clic sul pulsante "+" nel pannello "Dataset selezione" della finestra "Scheda di analisi".</li>
	<li>Una volta che l'immagine è stata caricata nella finestra "Scheda di analisi", è possibile eseguire la regione di analisi di interesse (ROI) selezionando l'icona dell'elissoide, situato nell'angolo superiore sinistro della finestra "Scheda di analisi".</li>
	<li>Regolare la soglia a zero nel pannello "dati statistici" facendo clic con il pulsante destro del mouse su colonna "soglia" nella finestra "Scheda di analisi".</li>
	<li>Il valore totale nel pannello "Dati statistici" rappresenta il segnale dalle cellule fluorescenti-etichetta glioblastoma impiantate nel cervello del topo.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 4.2-4.4 per il resto degli animali. Caricare o rimuovere un nuovo soggetto cliccando il "+" o "−" pulsante, rispettivamente, nel pannello "Dataset selezione" della finestra "Scheda di analisi". Nota: Per ulteriori informazioni sul FMT imaging e il funzionamento del software, vedere20.
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interessi.

Gli xenotrapianti del tumore sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca sul cancro ed è stato sviluppato un numero di consolidate tecniche di imaging: BLI; risonanza magnetica (MRI); tomografia a emissione di positroni (PET), computata tomografia (CT); FMT. Ciascuno di questi approcci è dotato di Pro e contro, ma in definitiva completano a vicenda con il tipo di informazioni fornite. Uno del più comunemente usato in vivo tecnologia di imaging è BLI5,6</sup...

Il cancro è una delle principali cause di decessi per malattia in esseri umani nel mondo industrializzato. Con un altissimo numero di morti, nuovi trattamenti sono urgentemente necessari. Multiforme di glioblastoma (GBM) è un tipo estremamente letale di cancro al cervello, composto da popolazioni eterogenee delle cellule stromal ed immuni del tumore, di cervello. Secondo la registrazione del tumore di cervello centrale degli Stati Uniti, l'incidenza dei tumori cerebrali primari maligne e benigne è circa 22 casi per 100.000. Circa 11.000 nuovi casi dovrebbero essere diagnosticati negli USA nel 20171.
Gli studi preclinici indagare la probabilità di una droga, procedura o trattamento per essere efficace prima della prova in esseri umani. Uno dei primi passi di laboratorio negli studi preclinici è identificazione di potenziali bersagli molecolari per il trattamento farmacologico tramite cellule tumorali impiantate in un organismo ospite, definito come modelli di xenotrapianto umano. In questo contesto, i modelli di xenotrapianto del tumore cerebrale intracranica utilizzando xenotrapianti paziente-derivati (PDXs) sono stati ampiamente usati per studiare la biologia del tumore di cervello, la progressione, evoluzione e risposta terapeutica e più recentemente per lo sviluppo di biomarcatori, droga screening e personalizzata medicina2,3,4.
Uno dei più accessibili e non invasiva in vivo imaging metodi per monitorare gli xenotrapianti intracranici è bioluminescenza imaging (BLI)5,6,7,8. Tuttavia, alcune limitazioni di BLI includono amministrazione di substrato e disponibilità, stabilità enzimatica e luce tempra e dispersione durante imaging acquisizione9. Qui segnaliamo l'infrarosso FMT in alternativa metodo per monitorare i modelli preclinici di glioblastoma di imaging. In questo metodo, l'acquisizione del segnale e la quantificazione di PDXs intracranially impiantati, che esprime una proteina fluorescente vicino infrarosso iRFP72010,11 (d'ora in poi definito come FP720) o turboFP635 (d'ora in poi definito come FP635), viene eseguita con un sistema di imaging di FMT. Utilizzando la tecnologia FMT, orthotopic i tumori possono essere monitorati in vivo prima, durante o dopo il trattamento, in modo non invasivo, privo di substrato e quantitativo per osservazioni precliniche.

<table><tbody><tr><td>DMEM/Alto glucosio&nbsp;</td><td>HyClone/GE</td><td>SH30022.1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 1:1&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11320-082</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone/GE</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Tecnologie cellulari innovative</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>HyClone/GE</td><td>SH30236.01</td><td></td></tr><tr><td>B27 integratore</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>EGF umano ricombinante&nbsp;</td><td>Stemcell Technologies</td><td>2633</td><td></td></tr><tr><td>FGF ricombinante umano</td><td>Stemcell Technologies</td><td>2634</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Corning</td><td>21-031-00</td><td></td></tr><tr><td>Provette FACS</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1113903</td><td></td></tr><tr><td>p24 ELISA&nbsp;</td><td>Clontech</td><td>632200</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Zoetis</td><td>NADA 043-403</td><td>Sostanza controllata</td></tr><tr><td>Unguento</td><td>Dechron</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Sutura assorbibile</td><td>CpMedical</td><td>VQ392</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 5 ul</td><td>Hamilton</td><td>26200-U</td><td>Numero di catalogo come venduto da Selezionatore di cellule Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td></td><td>Sony</td><td>SH8007</td><td></td></tr><tr><td>Telaio stereotassico del mouse&nbsp;</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>Iniettore stereotassico motorizzato</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>Trapano portatile con micromotore</td><td>Foredom</td><td>K1070</td><td></td></tr><tr><td>Tappetino riscaldante per mouse</td><td>Ken Scientific Corporation</td><td>TP-22G</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di tomografia a fluorescenza&nbsp;</td><td>Software di imaging TrueQuant PerkinElmer</td><td>FMT 2500 XL</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7005319 Ultracentrifuga Optima L-80 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>392049</td><td></td></tr><tr><td>Colture tissutali Piastre da 100 mm</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>Piastre da 150 mm</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-203</td><td></td></tr><tr><td>Fiasche per colture tissutali T75</td><td>Corning</td><td>430720U</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 50 mL</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 15 mL</td><td>Olympus Plastics</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga Avanti J-20</td><td>Beckman Coulter</td><td>J320XP-IM-5</td><td></td></tr><tr><td>Provetta, Polipropilene, Thinwall, 5,0 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>326819</td><td></td></tr><tr><td>Tube, Thinwall, Polipropilene, 38,5 mL, 25 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Topi nudi atimici</td><td>Charles River Laboratories</td><td>Codice ceppo&nbsp; 490 (Omozigote)</td><td>È richiesta l'approvazione preventiva da parte del Programma Istituzionale di Cura degli Animali e del Comitato Istituzionale per la Biosicurezza. &nbsp; &nbsp;</td></tr></tbody></table>

fluorescenza tomografia molecolare per l'imaging in vivo di glioblastoma xenotrapianti

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Carcinogenicità è la capacità delle cellule tumorali di formare un tumore massa. Un approccio ampiamente utilizzato per determinare se le cellule sono cancerogene è iniettare per via sottocutanea topi immunodeficienti con le cellule tumorali e misurando la massa tumorale dopo diventa visibile e palpabile. Orthotopic iniezioni di cellule tumorali mirano a introdurre xenotrapianto nel microambiente che assomiglia maggiormente il tessuto di origine del tumore in fase di studio. Ricerca sul cancro cervello richiede intracranica iniezione delle cellule tumorali per consentire la formazione del tumore e l'analisi nel microambiente unico del cervello. L'imaging in vivo degli xenotrapianti intracranici controlla istantaneamente la massa di tumore dei topi orthotopically innestate. Qui segnaliamo l'uso di fluorescenza molecolare tomografia (FMT) di xenotrapianti del tumore di cervello. Le cellule tumorali sono in primo luogo trasdotte con vicino infrarosse proteine fluorescenti e poi iniettate nel cervello di topi immunocompromessi. Gli animali vengono poi analizzati per ottenere informazioni quantitative circa la massa di tumore per un periodo prolungato di tempo. Cellula pre-etichettatura consente la quantificazione costo effettiva, riproducibile e affidabile del carico del tumore all'interno di ogni mouse. Abbiamo eliminato la necessità di iniettare imaging substrati e riducendo lo stress sugli animali. Una limitazione di questo approccio è rappresentata dall'incapacità di rilevare le masse molto piccole; Tuttavia, esso ha una migliore risoluzione per più grandi masse rispetto ad altre tecniche. Può essere applicato per valutare l'efficacia di un trattamento farmacologico o alterazioni genetiche di linee cellulari di glioma e campioni paziente.

U87EGFRvIII di cellule di glioblastoma (cellule U87 che sovraesprimono la variante del recettore di EGF III) sono state coltivate secondo il punto 1.2. Lentivirus è stato prodotto e purificato secondo punto 1.1. La concentrazione virale è stata determinata da p24 analisi di ELISA. Le cellule sono state trasdotte con lentivirus portando a infrarossi proteine fluorescenti secondo punto 1.8. Il plasmide codifica FP72010,11 è stato ge...

Orthotopic iniezione intracranico delle cellule del tumore è stato utilizzato nella ricerca sul cancro per studiare la biologia del tumore di cervello, la progressione, evoluzione e risposta terapeutica. Qui presentiamo la tomografia molecolare fluorescenza degli xenotrapianti del tumore, che fornisce in tempo reale videomicroscopia imaging e quantificazione di un tumore di massa in modelli preclinici di glioblastoma.

Fluorescenza tomografia molecolare per l'Imaging In Vivo di Glioblastoma xenotrapianti

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è quello di stabilire un modello preclinico di imaging del tumore cerebrale utilizzando la tomografia molecolare a fluorescenza o FMT. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi della biologia dei tumori cerebrali, della ricerca sul cancro e della scoperta di farmaci sull'aggressività del tumore, l'eterogeneità e la reattività al trattamento. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i tumori possono essere monitorati in vivo prima, durante o dopo il trattamento in modo non invasivo, senza suture e quantitativo.Un altro vantaggio di questa tecnica è la possibilità di applicarla ad altri tipi di modelli di xenotrapianto impiantati in diversi organi dell'animale. Inizia seminando una volta da 10 a sesta cellule di glioblastoma in cinque millilitri di terreno in un piatto di 10 centimetri per un'incubazione di 24 ore in un incubatore di colture cellulari. La mattina successiva, trasdurre le cellule con lentivirus, esprimendo un'appropriata proteina fluorescente di interesse a una molteplicità di infezione di cinque e riportare le cellule nell'incubatore.Dopo 24 ore, sostituire il surnatante con cinque millilitri di terreno fresco e incubare la coltura per altre 48 ore. Al termine dell'incubazione, sostituire il terreno con tre-cinque millilitri di tripson per 10-15 minuti a 37 gradi Celsius, seguito da un attento pipettaggio per dissociare completamente le cellule staccate. Raccogliere le celle per centrifugazione e risospendere il pellet in 500 microlitri di soluzione di selezione.Dividere le celle in un numero appropriato di tubi fax e colorare le celle con DAPI per l'esclusione delle celle morte. Quindi caricare le provette sul citometro a flusso e selezionare le cellule vive in base alla loro espressione di costrutto fluorescente in una provetta conica da 15 millilitri contenente una soluzione di selezione fresca. Dopo la centrifugazione, sospendere nuovamente le cellule positive al costrutto e DAPI negative in cinque millilitri di terreno di coltura e seminarle su un nuovo piatto da 10 centimetri per la loro coltura a 37 gradi Celsius per 48-72 ore.Al termine dell'incubazione, dividere le cellule per la semina in più piastre per i successivi esperimenti in vivo. Il giorno dell'iniezione, dissociare le gliocellule fluorescenti positive in una singola sospensione cellulare e risospenderle a 0,5 o una volta 10 per le seste cellule per due o cinque microlitri di PBS per iniezione per concentrazione animale in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri su ghiaccio. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita, applicare l'unguento sugli occhi del topo ricevente Athymic Nude immunodeficiente e caricare una siringa Hamilton da cinque microlitri dotata di un ago con punta smussata con le cellule per l'iniezione.Montare la siringa in un supporto per sonda e posizionare il mouse in una piccola cornice sterotattica animale. Fissare la testa utilizzando le barre auricolari e l'adattatore per incisivi e disinfettare la testa con una soluzione di etanolo al 70% e batadina. Usando un piccolo bisturi, fai un'incisione centrale e separa la pelle e i tessuti connettivi.Utilizzando il micromanipolatore, posizionare la siringa di Hamilton sul punto di bregma e spostare il supporto della sonda di un millimetro anteroposteriore e di due millimetri lateralmente dal punto di bregma. Dopo aver segnato la posizione con una matita, utilizzare un trapano portatile a micromotore per praticare con cura un foro nel cranio, applicando una leggera pressione verso il basso fino a quando i vasi sanguigni diventano visibili. Introdurre l'ago nel foro della fresa tre millimetri sotto la superficie del pial e iniettare le cellule a un flusso di un microlitro al minuto a destra.Quando l'intero volume della cellula sperimentale è stato iniettato, rimuovere gradualmente l'ago a una velocità di ascensione di un millimetro al minuto e pulire il sito di iniezione con etanolo al 70%. Quindi chiudere la ferita cutanea secondo i protocolli standard e monitorare l'animale su un cuscinetto riscaldante fino a quando non si è completamente ripreso. Per visualizzare le cellule iniettate, posizionare l'animale ricevente anestetizzato nella cassetta di imaging di un imager per tomografia molecolare a fluorescenza, l'adattatore della testa prima in posizione prona, con la testa al centro della cassetta.Con la cassetta chiusa, serrare le manopole di regolazione a 17 millimetri. Quando l'animale è al sicuro, inserire la cassetta nella docking station interna e aprire il software dell'imager e dell'analizzatore. Nella finestra della scheda sperimentale, selezionare il database e il gruppo di studio appropriati e aprire la finestra della scheda di scansione.Fare clic su Seleziona soggetto per selezionare il soggetto da acquisire e selezionare il canale laser nel pannello del canale laser. Fare clic su Acquisisci per acquisire un'immagine e fare clic e trascinare il campo di scansione nell'immagine acquisita per identificare le posizioni di origine. Seleziona l'opzione aggiungi alla que di ricostruzione e fai clic su Scansione nella finestra della scheda Scansione.Al termine della scansione, rimuovere la cassetta di imaging dalla docking station e riportare l'animale nella sua gabbia con monitoraggio fino al completo recupero. Per analizzare le immagini, nel software dell'imager e dell'analizzatore aprire la finestra della scheda di analisi e fare clic sul pulsante con il segno più nel pannello di selezione del set di dati per caricare il set di dati e l'oggetto per l'analisi. Quindi utilizzare l'icona dell'ellissoide per selezionare la regione di interesse e fare clic con il pulsante destro del mouse sulla colonna della soglia per regolare la soglia a zero nel pannello dei dati statistici.Le cellule di glioblastoma marcate con proteine fluorescenti nel vicino infrarosso, come appena dimostrato, mostrano profili fluorescenti distinti che possono essere distinti dalla tomografia molecolare a fluorescenza, anche fino a cinque giorni dopo l'iniezione. Inoltre, la mancanza di segnale di fondo tra i costrutti facilita l'imaging duale in vivo delle popolazioni di cellule tumorali di interesse. In questo esperimento, sfere di glioblastoma marcate con costrutto fluorescente co-trasdotte con lentivirus che codificano SHRNA mirando alla proteina associata al dominio di morte sono state iniettate in topi nudi atimici immunodeficienti riceventi, come appena dimostrato.La reazione a catena preliminari quantitativi a trascrizione inversa ha confermato l'efficacia del targeting SHRNA in entrambe le linee cellulari tumorali e la tomografia molecolare a fluorescenza ha rivelato una diminuzione del segnale di fluorescenza nei topi trapiantati con sfere di glioblastoma SHRNA rispetto agli animali impiantati con cellule trasdotte di controllo SH. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare dati preclinici per la ricerca sul cancro al cervello utilizzando un sistema di tomografia molecolare a fluorescenza.

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Luciferasi modificati xenotrapianti di tumori al cervello umano può essere stabilita intracranially in topi atimici, con successivo monitoraggio della crescita tumorale e la risposta alla terapia con l'imaging bioluminescenza. In combinazione con l'analisi di sopravvivenza, il monitoraggio bioluminescenza è uno strumento di ricerca indispensabile per test pre-clinici di terapie che sono considerati per il trattamento dei tumori cerebrali.

Stabilire intracranica xenotrapianti Brain Tumor Con successiva analisi della crescita tumorale e risposta alla terapia con Imaging bioluminescenza

Impianto intracranico di GL261 cellule in C57BL / 6 topi produce gliomi maligni che ricapitolano molte delle caratteristiche del glioblastoma multiforme umano. Abbiamo usato GL261 cellule che esprimono stabilmente luciferasi per permetterci di...

Impianto intracranica con 3D successivi In Vivo Bioluminescent Imaging dei gliomi Murine

Diffuse la tomografia di fluorescenza offre un approccio relativamente a basso costo e potenzialmente ad alta dappertutto per...

Tomografia Computerizzata guidata nel dominio del tempo Tomography Diffuse fluorescenza in animali di piccola taglia per la localizzazione dei biomarcatori tumorali

Descriviamo un metodo integrato per la precisione, l'impianto stereotassico di cellule umane di glioblastoma multiforme nel cervello di topi nudi e seriali...

Stereotassica impianto intracranico e<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging Bioluminescent di xenotrapianti di tumori in un sistema modello del mouse di Glioblastoma Multiforme

In questo video, descriviamo un protocollo per l'ingegneria genetica delle cellule di glioma per esprimere la proteina fluorescente a infrarossi o iRFP. Queste cellule di glioma marcate con fluorescenza sono utili nell'imaging dei tessuti profondi per comprendere lo sviluppo dei tumori cerebrali.

Marcatura fluorescente delle cellule di glioma: un metodo di trasfezione basato su vettori lentivirali per ottenere cellule di glioma che esprimono una proteina fluorescente per l'imaging dei tessuti profondi

In questo video, descriviamo la tomografia molecolare a fluorescenza o FMT per l'imaging in vivo di xenotrapianti di glioblastoma marcati con proteine fluorescenti in modelli murini. La tecnica è utile per chiarire gli effetti delle terapie antitumorali a livello molecolare.

Tomografia molecolare a fluorescenza: una tecnica di imaging per l'imaging in vivo di xenotrapianti di glioblastoma con marcatura proteica fluorescente in un modello murino

Fonte: Clark, A.J., et al. Imaging a bioluminescenza di un modello animale immunocompetente per il glioblastoma. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra l'imaging a bioluminescenza per monitorare la progressione del glioblastoma in un modello murino immunocompetente, utilizzando cellule tumorali che esprimono luciferasi e luciferina per quantificare la crescita tumorale in modo non invasivo.

Imaging a bioluminescenza di un modello murino immunocompetente per il glioblastoma

Abbiamo stabilito un modello glioblastoma ortotopico corticale nei topi per intravital microscopia a due fotoni che ricapitola i vincoli biofisici normalmente in gioco durante la crescita del tumore. Una finestra di vetro cronica sostituzione del cranio sopra il tumore consente il seguito della progressione tumorale nel tempo mediante microscopia a due fotoni.

Un ortotopico Glioblastoma modello di mouse mantenimento di vincoli Cervello parenchimale fisiche e adatto per intravitale due fotoni Microscopia

GL261 le cellule di glioma forniscono un utile modello animale immunocompetente di glioblastoma. Gli obiettivi di questo protocollo sono dimostrare tecniche adeguate per il monitoraggio della crescita tumorale intracranica utilizzando l'imaging in bioluminescenza in vivo e verificare l'utilità delle cellule GL261 modificate con luciferasi per lo studio dell'immunologia tumorale e degli approcci immunoterapeutici per il trattamento del glioblastoma.

Bioluminescenza Imaging di un Modello immunocompetenti Animal Glioblastoma

Qui usiamo bioluminescenti, raggi x ed emissione di positroni tomografia/computato tomografia imaging per studiare l'attività come inibitore di mTOR urta i tumori del midollo osseo-engrafted mieloma in un modello dello xenotrapianto. Questo permette analisi fisiologicamente pertinenti, non invasivo e multimodale dell'effetto anti-mieloma di terapie designando i tumori del midollo osseo-engrafted mieloma in vivo.

Formazione immagine di tomografia multimodale bioluminescenti ed emissione positronica tomografia/computazionale di mieloma multiplo del midollo osseo xenotrapianti in topi NOG

Presentiamo un nuovo approccio per la microscopia a due fotoni della somministrazione tumorale di nanoparticelle di ossido di ferro marcate con fluorescenza al glioblastoma in un modello murino.

Microscopia intravitale a due fotoni del glioblastoma in un modello murino

Scopri la tomografia molecolare a fluorescenza per l'imaging preclinico del glioblastoma in vivo. Questo metodo non invasivo consente il monitoraggio quantitativo dei tumori cerebrali e la valutazione delle risposte terapeutiche.

Fluorescenza tomografia molecolare per l'Imaging In Vivo di Glioblastoma xenotrapianti

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