Isolotti roditori Valutazione di replica e la funzione delle cellule beta in Adenovirally-trasdotte Isolati

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare le vie di segnalazione che regolano i cambiamenti nella massa funzionale delle cellule beta. Ciò si ottiene negli occhielli isolati di ratto sovraesprimendo o sopprimendo l'espressione di un gene utilizzando vettori adenovirali. Dopo questa manipolazione, la funzione delle cellule beta viene valutata mediante la secrezione di insulina e la replicazione dell'occhiello misurata mediante l'incorporazione della timidina triziata.

In definitiva, questi saggi possono mostrare se un gene di interesse regola la proliferazione delle cellule beta e/o la funzione in vitro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia delle palpebre, ad esempio un particolare componente di una via di segnalazione influenza la crescita e la funzione delle cellule beta? Preparare una piastra rivestita di coltura non tissutale a sei pozzetti aggiungendo due millilitri di terreno modificato al numero richiesto di pozzetti.

Ad esempio, un esperimento tipico può richiedere tre pozzetti, uno ciascuno per un controllo senza virus, uno per il controllo del virus, e il gruppo sperimentale riscalda la piastra a 37 gradi Celsius in un incubatore di coltura tissutale per almeno 30 minuti. Immediatamente dopo l'isolamento degli occhielli di ratto, posizionare da uno a 200 occhielli in ciascun pozzetto della piastra preparata. 60 occhielli saranno utilizzati per saggi biochimici e gli occhielli rimanenti possono essere utilizzati per studi di espressione genica o immuno blotting gonfiando delicatamente la piastra per portare gli occhielli al centro di ciascuno.

Bene, quindi pipettare immediatamente l'adenovirus direttamente sugli occhielli. Al centro del piatto. Utilizzare da una a 500 molteplicità di infezioni a seconda dell'efficacia dell'adenovirus nell'esprimere o abbattere la proteina di interesse.

Un'efficiente penetrazione adenovirale al centro della palpebra aumenta la coerenza dei risultati. Trasduzione delle palpebre immediatamente dopo la palpebra. L'isolamento è essenziale.

Non disturbare la piastra per cinque minuti, quindi spostarla nell'incubatrice per 24 ore. Il giorno successivo, rimuovere la piastra dall'incubatrice e gonfiare delicatamente gli occhielli al centro dei pozzetti. Trasferire gli occhielli in un nuovo pozzetto contenente terreno fresco utilizzando una micropipetta da 200 microlitri.

Se gli occhielli si attaccano alla piastra, possono essere rimossi delicatamente con la punta della pipetta. È utile utilizzare un virus di controllo che esprime GFP per verificare un'adeguata efficienza di trasduzione utilizzando la microscopia confocale per visualizzare la penetrazione dell'adenovirus nella coltura del nucleo dell'isola. Gli isolotti per uno o tre giorni in più, cambiando i media ogni giorno.

Il tempo di coltura deve essere ottimizzato da studi pilota e varia in base agli obiettivi sperimentali. Per le ultime 24 ore, incorporare la timidina triziata nel terreno a una concentrazione di una micro curie per millimetro di terreno. Per prima cosa preparare appena 50 millilitri di SAB di lavoro in un tubo conico da 50 millilitri e scaldarlo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.

Pipettare 10 millilitri di SAB di lavoro in una provetta conica da 15 millilitri e aggiungere 66,8 microlitri di glucosio D molare da 2,5 molari. Per preparare il SAB ad alto contenuto di glucosio, aggiungere 44,8 microlitri di glucosio 2,5 monolo D ai restanti 40 millilitri del SAB di lavoro. Per preparare il SAB a basso contenuto di glucosio, etichettare tre provette per microcentrifuga da 1,7 millilitri.

Per ogni pozzetto dei sei pozzetti, piastrate e aggiungete un millilitro di PBS a ciascuna provetta. Non dimenticare di seguire i protocolli istituzionali per la manipolazione e lo smaltimento degli occhielli radioattivi. Utilizzando uno stereoscopio o un microscopio standard, selezionare e trasferire 20 occhielli di dimensioni comparabili in ciascuna provetta per microcentrifuga.

Ad esempio, ogni tubo può contenere cinque occhielli di dimensioni piccole, 10 medie e cinque grandi. Sebbene i risultati siano normalizzati al contenuto proteico totale alla fine dell'esperimento, è fondamentale far corrispondere le dimensioni degli occhielli tra i gruppi. Dopo aver lasciato depositare gli occhielli sul fondo della provetta per gravità o per centrifugazione, aspirare, pesare il PBS con una micropipetta e poi procedere con la preparazione degli occhielli per i saggi biochimici.

Per preparare gli occhielli per il test della secrezione di insulina, devono essere prima pre-incubati con SAB a basso contenuto di glucosio. Per fare ciò, aggiungere 400 microlitri di SAB a basso contenuto di glucosio alle provette e posizionarle con i tappi nell'incubatore di coltura tissutale Per 60 minuti dopo un'ora, aspirare il SAB a basso contenuto di glucosio pre-incubazione per misurare la secrezione basale di insulina. Ripetere la procedura di pre-incubazione.

Tuttavia, per misurare la secrezione di insulina stimolata, utilizzare 400 microlitri di SAB ad alto contenuto di glucosio invece di SAB a basso contenuto di glucosio e, come in precedenza, incubare gli occhielli per 60 minuti dopo l'incubazione in aspirato SAB ad alto o basso glucosio e il SAB per il dosaggio immunoimmunologico radio dell'insulina, che verrà eseguito secondo il protocollo del produttore. Procedere quindi con il saggio di incorporazione della timidina utilizzando la stessa raccolta di occhielli. Iniziare con gli occhielli appena utilizzati per il test della secrezione di insulina.

Aggiungere un millilitro di PBS e lasciare che gli occhielli si depositino per gravità. Quindi aspirare il PBS con una micropipetta. Scartare e ripetere questo passaggio ancora una volta.

Successivamente, aggiungere 500 microlitri di acido tricloroacetico ghiacciato agli occhielli e incubarli su ghiaccio per 30 minuti. Centrifugare le provette a quattro gradi Celsius. Quindi aspirazione, scartare il TCA.

Successivamente, aggiungere 80 microlitri di idrossido di sodio normale 0,3 e incubare gli occhielli per 30 minuti a temperatura ambiente. Durante questa incubazione, agitare vigorosamente i campioni per 5-10 secondi ogni 10 minuti. Parallelamente, aggiungere quattro millilitri di un cocktail di conteggio sicuro conno a provette di conteggio a scintillazione liquida da sette millilitri.

Al termine dell'incubazione degli occhielli, aggiungere 50 microlitri di occhielli in un tubo a scintillazione. Agitare brevemente la provetta tappata e misurare la radioattività dei campioni in un contatore a scintillazione liquida. Inoltre, per misurare la concentrazione proteica, trasferire 10 microlitri di vilas a un test di acido bionico commerciale e seguire il protocollo del produttore.

Successivamente, durante l'analisi dei dati, normalizzare i risultati alla concentrazione proteica utilizzando i protocolli descritti. Replicazione dell'occhiello e funzione delle cellule beta. Negli occhielli di ratto è stata valutata una sovraespressione adenovirale di un ipotetico gene sei che ha stimolato la replicazione degli occhielli in modo robusto senza alterare la funzione delle cellule beta.

Aumento dell'espressione del gene sei, aumento della sintesi del DNA misurata dall'incorporazione della timidina perché la maggior parte delle cellule nell'occhiello di ratto sono cellule beta. Ulteriori esperimenti potrebbero dimostrare che questo aumento dell'incorporazione della timidina è dovuto ad un aumento della replicazione delle cellule beta. Il test della secrezione di insulina ha dimostrato che la sovraespressione del gene sei non ha alterato una delle funzioni primarie delle cellule beta: la secrezione di insulina a basso e alto glucosio.

L'aumento della secrezione di insulina a basse e alte concentrazioni di glucosio riflette la salute degli occhielli dopo il trattamento con adenovirus. Se l'aumento dell'espressione del gene sei compromette la funzione delle cellule beta, ciò si rifletterebbe probabilmente in una diminuzione dell'insulina secreta ad alte concentrazioni di glucosio per stimolare re. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare la replicazione delle cellule beta e la secrezione di insulina per determinare se un particolare gene influenza la crescita o la funzione delle cellule beta.