Name: Isolotti roditori Valutazione di replica e la funzione delle cellule beta in Adenovirally-trasdotte Isolati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Impara a valutare la replicazione delle isole pancreatiche e la funzione delle cellule beta in ratti usando vettori adenovirali. Questo metodo identifica vie di segnale chiave per la ricerca sul diabete.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione DK078732 dal NIH (per PTF).

1. Trasduzione adenovirale e la coltura di isole di ratto <ol><li> Preparare una ben 6-non-tessuto piastra rivestita coltura aggiungendo 2 ml di mezzo (RPMI 1640 contenente 8 mM di glucosio, 10% di siero fetale bovino, 50 unità / ml di penicillina, e 50 ug / ml di streptomicina) al numero richiesto di pozzi. Ad esempio, un tipico esperimento può richiedere tre pozzetti, uno per ogni mancato controllo virus, un controllo virus (ad esempio, GFP-esprimono adenovirus), e il gruppo sperimentale. </li><li> Riscaldare la piastra a 37 ° C ponendo in un incubatore di coltura tissutale per almeno 30 min. </li><li> Immediatamente dopo isolotto isolamento ratto 18,19, posto 100-200 isolotti in pozzetti individuali della ben 6-non-tessuto rivestito piastra di coltura. Sessanta isolotti sono necessarie per la secrezione di insulina e saggi di incorporazione di timidina. Gli isolotti rimanenti possono essere usati per l&#39;isolamento di RNA per studi di espressione genica o isolamento di proteine ​​per immunoblotting. </li></ol> [Nota: Da questo punto in avanti, si prega di seguire i protocolli istituzionali per la manipolazione, l&#39;uso e lo smaltimento dei materiali a rischio biologico.] <ol start="4"><li> Delicatamente il piastra per portare le isolette al centro del pozzo. </li><li> Pipettare l&#39;adenovirus direttamente sulle isole nel centro del piatto. Utilizzare 100-500 molteplicità di infezione (MOI, il rapporto di cellule bersaglio per virali unità formanti placca). </li><li> Lasciare riposare per 5 minuti isolotti. </li><li> Porre la piastra in tessuto incubatore (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Dopo 24 h, roteare delicatamente la piastra per portare le isolette ai centri dei pozzetti e trasferire gli isolotti utilizzando una micropipetta P200 in un pozzetto contenente mezzi freschi. Se le isolette si attaccano alla piastra, possono essere sloggiato delicatamente con la punta della pipetta. </li></ol> [Nota: per verificare efficienze adeguate trasduzioneCY, l&#39;uso di un virus di controllo che esprime GFP è vantaggiosa, in quanto isolotti può quindi essere rappresentata mediante microscopia confocale per verificare la penetrazione del adenovirus nel nucleo isolotto.] <ol start="9"><li> Cultura le isolette per un ulteriore 24-72 ore, a seconda della temporizzazione desiderata dell&#39;esperimento da studi pilota di ottimizzazione. Ad esempio, l&#39;induzione di una risposta proliferativa può richiedere tempi compresi fra 24-72 ore o knockdown del gene di interesse può richiedere 48 o 72 ore. Trasferire le isolette di mezzi freschi ogni giorno. </li><li> Per la finale 24 ore dell&#39;esperimento, la cultura delle isole in un mezzo contenente 1 microCi [metil-3 H] -thymidine/ml media (in genere 1 pl timidina / ml media). </li></ol> [Nota: Da questo punto in avanti, si prega di seguire i protocolli istituzionali per la manipolazione, l&#39;uso e lo smaltimento dei materiali radioattivi.] 2. Secrezione insulinica test <ol><li> Preparare ilsecrezione tampone di saggio (SAB) soluzione madre 10X (1,14 M NaCl, 47 mM KCl, 12 mM KH 2 PO 4, 11,6 mM MgSO 4) e la soluzione di CaCl 2 magazzino 100X (0,25 M CaCl 2). Queste soluzioni fotografici possono essere preparate in anticipo e conservato a temperatura ambiente. </li><li> Appena preparare 50 ml della BRS di lavoro (5 mL di 10X SAB, 1 ml di 1 M HEPES, 0,5 ml di 100X CaCl 2, 0,28 ml di 35% BSA, 0,11 g NaHCO 3, e acqua sterile per 50 ml) in un 50 ml tubo e calda a 37 ° C introducendo in un 37 ° C a bagno-maria. </li><li> Pipettare 10 ml del SAB lavorazione in un 15-ml provetta conica e aggiungere 66,8 pl di 2,5 M D-glucosio per preparare il glucosio (16,7 mM) SAB. </li><li> Aggiungere 44,8 pl di 2,5 M D-glucosio per il restante 40 ml di lavoro SAB per preparare il glucosio bassa (2,8 mM) SAB. </li><li> Label tre 1,7 ml microprovette per ciascun pozzetto della piastra da 6 pozzetti e aggiungere 1 ml di tampone fosfato salino (PBS). </li></ol&gt; [Nota: Poiché le isole sono radioattivi, si prega di seguire i protocolli istituzionali per la manipolazione, l&#39;uso e lo smaltimento dei materiali radioattivi.] <ol start="6"><li> Mettere 20 isolotti in ogni provetta. Fate ogni tentativo di aggiungere isolette di dimensioni relativamente a ciascuna provetta. Ad esempio, ciascun tubo 5 può contenere piccole, medie 10, e 5 grandi dimensioni isolette (vedi Figura 1). </li></ol> [Nota: Le isole possono essere visualizzate utilizzando uno stereoscopio dissezione o un microscopio standard.] <ol start="7"><li> Dopo che le isolette hanno scelto di fondo della provetta per gravità (~ 2 min), aspirare il PBS con una micropipetta e scartare. </li></ol> [Nota: In alternativa alla sedimentazione per gravità, i tubi possono essere centrifugate a 300 xg per 1 min.] <ol start="8"><li> Per la pre-incubazione, aggiungere 400 microlitri della bassa gluglucosio SAB, posizionare i tubi (con i tappi aperto) nel tessuto incubatore (37 ° C, 5% CO 2), e pre-incubare per 60 min. Aspirare il pre-incubazione di glucosio basso SAB ed eliminarla. </li><li> Per la secrezione di insulina basale, aggiungere 400 microlitri del glucosio SAB basso, posizionare i tubi (con i tappi aperto) nel tessuto incubatore (37 ° C, 5% CO 2), e incubare per 60 min. Raccogliere il basso di glucosio SAB e risparmiare per il dosaggio radioimmunologico dell&#39;insulina. </li><li> Per la secrezione di insulina stimolata, aggiungere 400 microlitri del glucosio SAB alto, posizionare i tubi (con i tappi aperto) nel tessuto incubatore (37 ° C, 5% CO 2), e incubare per 60 min. Raccogliere l&#39;alto glucosio SAB e risparmiare per il dosaggio radioimmunologico dell&#39;insulina. </li></ol> 3. Timidina Assay <ol><li> Aggiungere 1 ml di PBS, dopo le isolette hanno scelto di fondo della provetta per gravità, aspirare il PBS con una micropipetta, scartare, e ripetere questapasso una volta. </li><li> Aggiungere 500 pl acido ghiacciata tricloroacetico (TCA, 10% w / v) e incubare su ghiaccio per 30 min. </li><li> Centrifugare le provette a 16 000 xg per 3 min a 4 ° C. </li><li> Aspirare il TCA, aggiungere 80 ul di NaOH 0,3 N, e incubare per 30 min a temperatura ambiente. Durante questo tempo, vigorosamente vortici i campioni per 5-10 s ogni 10 min. </li><li> Aggiungere 4 ml di Econo-safe cocktail contare fino a 7 tubi ml di liquido di scintillazione di conteggio. </li><li> Aggiungere 50 pl di campione al tubo scintillazione, chiudere il tubo, agitare, e conteggio in un contatore a scintillazione liquida. </li><li> Misurare la concentrazione di proteina usando l&#39;acido bicinconinico (BCA) saggio e 10 pl di campione secondo il protocollo del produttore. </li></ol> 4. Analisi dei dati <ol><li> Eseguire il dosaggio radioimmunologico dell&#39;insulina seguendo il protocollo del produttore. </li><li> Normalizza la secrezione di insulina e di dati timidina con il Concentration. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Un esempio di un esperimento per valutare la replicazione delle isole e la funzione delle cellule beta in isole di ratto è illustrato nella figura 2. Questo esempio mostra che l&#39;iperespressione adenovirale di ipotetici &quot;Gene # 6&quot; stimola robusta replica isolotto senza alterare la funzione delle cellule beta. Nel pannello superiore, i risultati del saggio di incorporazione di timidina dimostrare che aumentando l&#39;espressione di &quot;Gene # 6&quot; aumenta la sintesi del DNA, come misurato mediante incorporazione di timidina. Poiché la maggior parte delle cellule del isolotto ratto sono cellule beta, è probabile che questo aumento timidina indica un incremento della replicazione delle cellule beta. Tuttavia, gli esperimenti di conferma devono essere eseguite per stabilire con fermezza questo. Nel pannello inferiore, i risultati del saggio secrezione insulinica dimostrano che la sovraespressione di &quot;Gene # 6&quot; non altera una delle funzioni primarie di cellule beta, cioè, insulin secrezione di glucosio a bassa e alta. La qualità dell&#39;isolamento isolotto e la salute degli isolotti in seguito al trattamento con adenovirus è indicato dalla volte maggiore della secrezione di insulina a basse concentrazioni di glucosio e alta. Se aumentando l&#39;espressione di &quot;Gene # 6&quot; compromissione della funzione delle cellule beta, questo sarebbe probabilmente riflette come una diminuzione dell&#39;insulina secreta a concentrazioni elevate stimolatorie, glucosio (16,7 mM). Una curva dose-risposta per diverse concentrazioni di glucosio potrebbe anche essere eseguita. <img src="/files/ftp_upload/4080/4080fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Panoramica del protocollo per valutare la replica delle isole e la funzione delle cellule beta nelle isole di ratto isolate in seguito adenovirale-mediate alterazioni nell&#39;espressione genica. Isole di ratto isolate di fresco sono esposti a adenovirus per 24 ore e poi coltivate fino a 96 h. Timidina viene valutata in finale 24 ore, seguita dalla misura della secrezione di insulinaglicemia bassa e alta. <img src="/files/ftp_upload/4080/4080fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Risultati di un esperimento utilizzando un adenovirus di controllo e un adenovirus sovraesprimendo un gene ipotetico etichettato come &quot;Gene # 6&quot;. Il pannello superiore illustra il timidina e il pannello inferiore della secrezione di insulina.

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<li>Csete, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+to+pancreatic+islets+mediated+by+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer to pancreatic islets mediated by adenoviral vectors.</a> Transplantation. 59, 263-268 (1995).</li>
<li>Meng, Z. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+liver+X+receptors+inhibits+pancreatic+islet+beta+cell+proliferation+through+cell+cycle+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Activation of liver X receptors inhibits pancreatic islet beta cell proliferation through cell cycle arrest.</a> Diabetologia. 52, 125-135 (2009).</li>
<li>Ronnebaum, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyruvate+cycling+pathway+involving+cytosolic+NADP-dependent+isocitrate+dehydrogenase+regulates+glucose-stimulated+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A pyruvate cycling pathway involving cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase regulates glucose-stimulated insulin secretion.</a> J. Biol. Chem. , (2006).</li>
<li>Milburn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+beta-cells+in+obesity.+Evidence+for+induction+of+functional%2C+morphologic%2C+and+metabolic+abnormalities+by+increased+long+chain+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pancreatic beta-cells in obesity. Evidence for induction of functional, morphologic, and metabolic abnormalities by increased long chain fatty acids.</a> J. Biol. Chem. 270, 1295-1299 (1995).</li>
<li>Szot, G., Koudria, P., Bluestone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Pancreatic+Islet+Isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine Pancreatic Islet Isolation.</a> J. Vis. Exp. (7), e255(2007).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Stabilire percorsi che possono essere modulate per stimolare la replicazione e migliorare la funzione delle cellule beta sono importanti per entrambe le forme principali di diabete. Poiché funzionale massa di cellule beta dipende dalla esistenza e la funzione di cellule che secernono insulina, valutando questi determinanti simultaneamente ha i suoi vantaggi. Questo protocollo descrive un protocollo semplificato per identificare se la sovraespressione o la soppressione di una proteina porta a variazioni di massa funziona...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> RPMI 1640 mezzi </td><td> Gibco </td><td> 11879 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> 6-pozzetti </td><td> BD-Falcon </td><td> 35-1146 </td><td> Non-TC trattati </td></tr><tr><td> [Metil-3 H]-timidina </td><td> Perkin Elmer </td><td> NET027Z001MC </td><td> 1 mCi / ml </td></tr><tr><td> Micro-provette da centrifuga; </td><td> Denville </td><td> C2170 </td><td> 1,7 ml </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> 59888 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Acros </td><td> 42409 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 &lt;/ Sub&gt; PO 4 </td><td> Acros </td><td> 20592 </td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Acros </td><td> 41348 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Acros </td><td> 34961 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H0887 </td><td> Soluzione 1 M </td></tr><tr><td> 35% BSA </td><td> Sigma </td><td> A7979 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Acros </td><td> 42427 </td><td></td></tr><tr><td> d-glucosio </td><td> Sigma </td><td> G8769 </td><td></td></tr><tr><td> TCA </td><td> Fisher Scientific </td><td> SA9410-1 </td><td> 10% w / v </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Acros </td><td> 12426 </td><td></td></tr><tr><td> Scintillazione tubo </td><td> Sarstedt </td><td> 58,536 </td><td> 7 ml, PP </td&gt; </tr><tr><td> Scintillazione tappo del tubo di conteggio </td><td> Sarstedt </td><td> 65,816 </td><td></td></tr><tr><td> Econo-Safe cocktail di conteggio </td><td> RPI </td><td> 111175 </td><td></td></tr><tr><td> Insulina RIA </td><td> Siemens </td><td> TKIN2 </td><td></td></tr><tr><td> BCA Assay Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23250 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Centrifuga </td><td> Eppendorf </td><td> 5415R </td><td></td></tr><tr><td> Scintillazione portaprovette </td><td> Sarstedt </td><td> 93.1431.001 </td><td></td></tr><tr><td> Contatore a scintillazione liquida </td><td> Perkin Elmer </td><td> Tri-Carb 2910TR </td><td></td></tr></tbody></table>

isolotti roditori valutazione di replica e la funzione delle cellule beta in adenovirally-trasdotte isolati

Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets

Omeostasi del glucosio è principalmente controllata dal sistema endocrino gli ormoni insulina e glucagone, secreto dal pancreas beta e le cellule alfa, rispettivamente. Functional massa di cellule beta è determinata dalla massa anatomica cellule beta così come la capacità delle cellule beta per rispondere a un carico di nutrienti. Una perdita di massa funzionale delle cellule beta è fondamentale per entrambe le forme principali di diabete 1-3. Considerando che i risultati in declino funzionale massa di cellule beta da un attacco autoimmune nel diabete tipo 1, diabete di tipo 2, questo decremento si sviluppa sia da una incapacità delle cellule beta di secernere insulina in modo appropriato e la distruzione delle cellule beta da una squadra di meccanismi. Pertanto, gli sforzi per ristabilire la massa funzionale delle cellule beta sono di primaria importanza al trattamento migliore e potenziali cure per il diabete. Gli sforzi sono in corso per identificare i meccanismi molecolari che possono essere sfruttate per stimolare la replicazione e migliorare la funzione delle cellule beta.Idealmente, gli obiettivi terapeutici potrebbe migliorare sia la crescita e la funzione delle cellule beta. Forse ancora più importante però è quello di identificare se una strategia che stimola la crescita delle cellule beta arriva al costo di compromettere la funzione delle cellule beta (come nel caso di alcuni oncogeni) e viceversa. Sistematicamente la soppressione o sovraespressione l&#39;espressione di geni bersaglio in isole isolate di ratto, si possono identificare potenziali bersagli terapeutici per aumentare la massa funzionale delle cellule beta 4-6. I vettori adenovirali possono essere impiegati per proteine ​​efficiente esprimono molti o smontabile in isole di ratto isolati 4,7-15. Qui, presentiamo un metodo per modificare l&#39;espressione genica utilizzando trasduzione adenovirale e valutare la replicazione e la funzione delle cellule insulari beta in isole di ratto isolati (Figura 1). Questo metodo è stato utilizzato in precedenza per identificare nuovi bersagli che modulano la replicazione delle cellule beta o una funzione 5,6,8,9,16,17.

Questo protocollo permette di identificare fattori che modulano funzionale massa delle cellule beta per trovare potenziali bersagli terapeutici per il trattamento del diabete. Il protocollo consiste in un metodo semplificato per valutare la replicazione delle isole e la funzione delle cellule beta in isole di ratto isolati dopo manipolazione genica con adenovirus.

Isolotti roditori Valutazione di replica e la funzione delle cellule beta in Adenovirally-trasdotte Isolati

L'omeostasi del glucosio è controllata principalmente dagli ormoni endocrini insulina e glucagone, secreti rispettivamente dalle cellule beta e alfa pancreatiche, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare i percorsi di segnalazione che regolano i cambiamenti nella massa funzionale delle cellule beta. Questo viene ottenuto in isolotti pancreatici di ratto sovraesprimendo o sopprimendo l'espressione di un gene mediante vettori adenovirali. Dopo questa manipolazione, la funzione delle cellule beta viene valutata tramite il rilascio di insulina e la replicazione degli isolotti misurata mediante incorporazione di timidina triziata.Infine, questi saggi possono mostrare se un gene di interesse regola la proliferazione e/o la funzione delle cellule beta in vitro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia delle cellule beta, come ad esempio se un particolare componente di un pathway di segnalazione influisce sulla crescita e sulla funzione delle cellule beta. Preparare una piastra da sei pozzetti non rivestita per colture cellulari aggiungendo due millilitri di mezzo modificato al numero richiesto di pozzetti.Ad esempio, un esperimento tipico può richiedere tre pozzetti, uno ciascuno per un controllo senza virus, un controllo con virus e il gruppo sperimentale; riscaldare la piastra a 37 grad

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Descriviamo epatica neo-isolotto formazione STZ (streptozotocina)-indotta topi diabetici mediante trasferimento genico di Neurogenin3 (Ngn3) e Betacellulin (Btc) utilizzando helper-dipendente vettore adenovirale (HDAd) e l'inversione di iperglicemia. Il nostro metodo sfrutta le vettori adenovirali dipendenti da helper con la loro alta efficienza nella trasduzione vivo e l'espressione genica lunga durata.

Neo-Islet formazione nel fegato di topi diabetici da Helper-dipendente adenovirale Vector-Mediated Gene Transfer

Saggio funzione in vitro β-cellulare utilizzando isolate del mouse isole di Langerhans è una componente importante nello studio della fisiopatologia del diabete e terapeutica. Mentre molte applicazioni a valle sono disponibili, questo protocollo descrive specificamente la misurazione di intracellulare adenosina monofosfato ciclico (cAMP) come parametro essenziale determinare la funzione β-cellulare.

Un metodo per l&#39;isolamento del mouse isole pancreatiche e intracellulare cAMP Determinazione

Presentiamo qui un protocollo per l'isolamento delle isole dal modello murino di diabete di tipo 2, Leprdb e i dettagli di un test su cellule vive per la misurazione della secrezione di insulina da isole intatte che utilizza la microscopia a 2 fotoni.

LEPR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modello di diabete di tipo 2: pancreas isolamento Islet e live-cella 2-Photon Imaging di isolotti Intact

Nei saggi di colonie in vitro per rilevare auto-rinnovamento e la differenziazione delle cellule progenitrici isolate dal pancreas di topo adulti sono messo a punto. In questi saggi, progenitori pancreatici danno origine a colonie di cellule nello spazio 3-dimensionale in terreno semisolido contenente metilcellulosa. I protocolli per la gestione di singole cellule e caratterizzazione delle singole colonie sono descritti.

In Vitro Colony saggi per Caratterizzazione Tri-potenti cellule progenitrici isolato dal adulti murini Pancreas

sfide critiche per il campo di ricerca sul diabete sono di comprendere i meccanismi molecolari che regolano la replicazione isolotto β-cellule e di sviluppare metodi per stimolando la rigenerazione delle cellule β-. Qui un metodo ad alto contenuto di screening per identificare e valutare l'attività di replica di promozione β-cellule di piccole molecole è presentato.

A High-contenuti<em&gt; In Vitro</em&gt; La replica della piattaforma Discovery isole pancreatiche β-cellule

Qui, presentiamo la metodologia per generare e somministrare composti di microsfere di acido poli(lattico-co-glicolico) caricate con interessi (PLGA) a isole di topo intatte in coltura con successiva analisi di immunofluorescenza della proliferazione delle cellule β. Questo metodo è adatto per determinare l'efficacia dei mitogeni a cellule β candidate.

Amministrazione sostenuta di Mitogeni β-cellule per Intact isole di topo<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Uso biodegradabile poli (acido lattico-co-glicolico) Microsfere

Viene presentato un protocollo per creare pseudoislets umani modificati in gene da cellule di isole umane disperse che vengono tradusse da lentivirus che trasportano RNA a forcina corta (shRNA). Questo protocollo utilizza vasi enzimatici e di coltura prontamente disponibili, può essere eseguito facilmente e produce pseudoislets umani geneticamente modificati adatti per studi funzionali e morfologici.

Lentiviral mediato gene silenziamento in pseudoislet umano preparato in piastre a basso attaccamento

L'obiettivo di questo protocollo è quello di monitorare continuamente le dinamiche del processo di innesto dell'isolotto pancreatico umano e delle cellule che contribuiscono tra l'ospite e il donatore. Ciò si ottiene trapiantando isolotti umani nella camera anteriore dell'occhio (ACE) di un NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-destinatario del mouse seguito da ripetute immagini a 2 fotoni.

Longitudinale in Vivo Imaging e quantificazione dell'isolotto pancreatico umano Innesto e contribuendo cellule ospitanti nella camera occhio anteriore

Questo protocollo descrive un metodo per l'acquisizione sincrona e la co-registrazione di eventi di segnalazione intracellulare e la secrezione di insulina e glucagone da parte di pseudoisole umane primarie utilizzando la somministrazione adenovirale di un biosensore ciclico di adenosina monofosfato (cAMP), un rivelatore di differenza di cAMP in situ (cADDis) e un sistema di microperifusione.

Sistema di pseudoisole umane per la valutazione sincrona della dinamica dei biosensori fluorescenti e dei profili secretori ormonali

Questo protocollo descrive un metodo standardizzato per il prelievo chirurgico, la digestione enzimatica e la purificazione con gradiente di densità degli isolotti pancreatici del ratto Lewis, consentendo preparazioni ad alta resa e alta purezza per l'uso diretto in studi di trapianto o in vitro .

Isolamento e purificazione degli isoli pancreatici da ratti Lewis tramite digestione enzimatica e separazione tra densità e gradiente

Impara a valutare la replicazione delle isole pancreatiche e la funzione delle cellule beta in ratti usando vettori adenovirali. Questo metodo identifica vie di segnale chiave per la ricerca sul diabete.

Isolotti roditori Valutazione di replica e la funzione delle cellule beta in Adenovirally-trasdotte Isolati

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