A High-contenuti In Vitro La replica della piattaforma Discovery isole pancreatiche β-cellule

L'obiettivo generale di questa piattaforma di screening della replicazione delle cellule beta ad alto contenuto è quello di facilitare lo studio delle vie molecolari che limitano la crescita delle cellule beta. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande importanti nel campo della biologia delle cellule beta. Come una delle molecole di segnalazione chiave e le vie che controllano la rigenerazione delle cellule beta.

I principali vantaggi di questa tecnica sono che consente di aumentare il throughput del rivestimento cellulare per una valutazione specifica e l'analista di dati automatizzato di una replicazione primaria delle cellule insulari. L'impiego di questa tecnica ha il potenziale per estendersi allo sviluppo della terapia rigenerativa per il diabete. Una malattia con un grave costo sanitario ed economico per la nostra società.

Iniziare utilizzando una siringa da 10 millilitri caricata con soluzione digestiva pancreatica dotata di un ago calibro 22 per chemulare il dotto biliare comune in corrispondenza o appena distale alla giunzione dei dotti cistico ed epatico comune. Sostenendo il dotto biliare comune con un manico di bisturi, iniettare lentamente 10 millilitri di soluzione. Dopo che tutta la collagenasi è stata somministrata, utilizzare una pinza curva e le forbici per separare il pancreas gonfiato dal colon discendente, dall'intestino, dallo stomaco e dalla scanalatura.

Quindi mettere fino a due pancreate in una provetta da 50 millilitri su ghiaccio contenente cinque millilitri di soluzione per la digestione pancreatica. Quando tutta la pancreata è stata raccolta, mettere i tubi di digestione in un bagnomaria a 37 gradi Celsius per 15 minuti con un leggero roteolio ogni tre minuti. Al termine della digestione, agitare energicamente i tubi verticalmente per 10 volte.

E aggiungi 10 millilitri di tamponi per lavaggio a freddo ai campioni. Agitare energicamente i tubi altre cinque volte e metterli sul ghiaccio. Quindi riempire i tubi fino a un volume finale di 50 millilitri con un tampone di lavaggio a freddo e capovolgere i tubi cinque volte.

Quindi centrifugare i fazzoletti e versare i surnatanti, facendo attenzione a non rimuovere i pellet. Risospendere l'impasto tissutale in 25 millilitri di tampone di lavaggio seguito da un leggero vortex. Ripetere le fasi di rotazione e risospensione altre due volte.

Versare le sospensioni tissutali attraverso un setaccio da 30 maglie in un becher sterile da 250 millilitri. Sciacquare i tubi di digestione con altri 20 millilitri di tampone di lavaggio e versare i lavaggi sulla rete per rimuovere i tessuti pancreatici e adiposi non digeriti. Dividere il materiale filtrato tra due nuove provette da 50 millilitri e pellettare il tessuto mediante centrifugazione.

Quindi decantare il surnatante e capovolgere le provette per drenare il tampone in eccesso. Per purificare le isole, aggiungere 20 millilitri di gradiente di densità fredda ai pellet di tessuto pancreatico e pipettare delicatamente su e giù cinque volte per risospendere in modo omogeneo il contenuto. Successivamente, sovrapporre lentamente 10 millilitri di HBSS lungo la parete di ciascuna provetta di gradiente, facendo attenzione a mantenere un'interfaccia liquida nitida e separare le cellule pancreatiche mediante centrifugazione.

Utilizzare una pipetta da 10 millilitri per trasferire lo strato di isole dall'interfaccia in nuove provette coniche da 50 millilitri. Quindi lavare le isole in 40-50 millilitri di tampone di lavaggio tre volte. Capovolgono i loro tubi per risospendere i pellet tra ogni centrifugazione.

Dopo il lavaggio finale, portare le provette in una cappa di coltura tissutale. Aspirare il surnatante. E ri-sospendere i pellet in sei millilitri di terreno isolotto.

Setacciare le isole da ciascuna provetta in pozzetti individuali di piastra di coltura tissutale a sei pozzetti. E fai roteare la piastra per raccogliere gli isolotti al centro dei pozzi. Valutare la purezza delle isole al microscopio.

Per purificare ulteriormente le isolette, raccoglierle utilizzando una pipetta da un millilitro e trasferirle nel pozzo adiacente utilizzando sei millilitri di terreno di coltura per isolotti. Ripetere l'agitazione delle isole, la raccolta, il trasferimento e la valutazione microscopica fino a raggiungere una purezza superiore al 90%. Quindi, trasferire le isole in un singolo piatto di coltura tissutale da 10 centimetri contenente 20 millilitri di terreno insulare.

Dopo che tutte le isole sono state raccolte, posizionare la piastra di coltura in un incubatore di coltura tissutale per una notte. Quindi rivestire i pozzetti di una piastra da 384 pozzetti con 40 microlitri di 804 G, terreno condizionato per pozzetto e posizionare la piastra nell'incubatore per una notte. Il giorno successivo, usa un raschietto cellulare per staccare delicatamente le isole.

Quindi trasferisci le isole in una provetta da 50 millilitri. Raccogliere le isole per centrifugazione. Quindi lavateli con 20 millilitri di p, b, s tiepidi.

Centrifugare per un minuto. Aspirare il surnatante. E ri-sospendere il pellet in zero virgola due, cinque per cento di tripsina.

Incubare le isole per 10 minuti a 37 gradi Celsius utilizzando una pipetta da un millilitro per aspirare e dispensare le isole 10 volte a cinque e 10 minuti. Dopo la seconda triterazione, contare un campione di 20 microlitri delle cellule insulari tripsinizzate. Se i tessuti sono completamente digeriti, sospendere le cellule insulari dissociative a una concentrazione di quattro punti cinque volte dieci a quattro cellule per millilitro nel mezzo di funzione delle isole.

Quindi utilizzare un aspiratore a 12 pozzetti per rimuovere il mezzo di condizione 804G dalla piastra a 384 pozzetti precedentemente preparata. E setacciare 70 microlitri di isolotti per pozzetto nelle file da c a n nelle colonne da quattro a 21. Lasciare che le isole aderiscano nell'incubatore per colture tissutali per 48 ore.

Dopo due giorni, utilizzare l'aspiratore a 12 pozzetti per rimuovere con cura il terreno insulare e utilizzare una pipetta a 12 canali per aggiungere 35 microlitri di terreno di funzione insulare a ciascun pozzetto. Quindi trasferire 35 microlitri delle due soluzioni composte di interesse appena preparate in ciascun pozzetto. E rimetti le isole nell'incubatrice per altre 48 ore.

Dopo 48 ore, fissare, colorare e analizzare le colture di isole trattate con composto utilizzando una piattaforma di imaging automatizzata ad alto contenuto. In un tipico esperimento, il tasso di replicazione delle cellule beta DAPI, PD-1 e insulino-positive è determinato dalla percentuale di cellule beta che co-esprimono Ki-67. La replicazione delle cellule alfa è misurata come percentuale di cellule co-esprimenti DAPI positive, PD negative, glucagone positive e Ki-67.

Ad esempio, in questo esperimento rappresentativo, è stato osservato che il dipridamolo promuove la replicazione delle cellule beta ma non delle cellule alfa. Questa tecnica può essere completata in sette giorni. Seguendo questa procedura, i composti che nella replicazione delle cellule beta possono essere ulteriormente studiati per rivelare i meccanismi d'azione.

Questa tecnica ha permesso alle ricerche nel campo della biologia delle cellule beta di identificare nuovi fattori di segnalazione e vie che regolano la crescita delle cellule beta. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come testare la capacità di piccole molecole di stimolare selettivamente la rigenerazione delle cellule beta.