Tridimensionale Cultura modello cellulare per misurare gli effetti del flusso del fluido interstiziale sulla Invasion cellule tumorali

Lo scopo di questa procedura è quello di esporre le cellule coltivate in 3D al flusso di fluido interstiziale e di quantificare gli effetti mediati dal flusso sull'invasione cellulare. Ciò si ottiene preparando prima una soluzione in gel composta da collagene di tipo uno e matrigel. Il secondo passo consiste nell'aggiungere una concentrazione specificata di cellule alla soluzione in gel.

Successivamente, la sospensione cellulare viene aggiunta a un pozzetto di 12 millimetri di diametro e otto micron di pori e incubata a 37 gradi Celsius fino a quando la matrice non gelifica. La fase finale della configurazione del saggio consiste nell'aggiungere quantità specifiche di terreno ai pozzetti per creare condizioni statiche e di flusso. 24 ore dopo, le membrane del transwell vengono fissate, colorate e visualizzate per la quantificazione del numero di cellule invase.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le camere a flusso microfluidiche e interstiziali, è che non richiede pompe o attrezzature specializzate e consente ai ricercatori di testare più condizioni o trattamenti in modo facile e rapido. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla migrazione e l'invasione cellulare, può anche essere utilizzato o applicato per studiare l'effetto del flusso di fluido interstiziale su altri comportamenti cellulari rilevanti, come l'espressione proteica, la proliferazione cellulare e le alterazioni della segnalazione cellulare. A dimostrare questa procedura sarà un LIMA due chaa.

Uno studente laureato nel mio laboratorio Inizia questa procedura gettando una piccola aliquota di matri gel sul ghiaccio a quattro gradi Celsius. Quindi, prepara la ricetta del gel con acqua sterile PBS, idrossido di sodio, matrigel e collagene di coda di topo di tipo uno. Quindi mescolare i componenti del gel con ghiaccio nella stessa sequenza e incubare la soluzione finale per un'ora a quattro gradi Celsius.

Ora posiziona un inserto di coltura di otto micro po da 12 millimetri di diametro in una piastra a 12 pozzetti utilizzando un paio di pinze sterilizzate. Quindi contare le cellule e risospenderle in terreni privi di siero a cinque volte da 10 a sei cellule per millilitro, aggiungere 100 microlitri di sospensione cellulare a 900 microlitri di soluzione in gel. Successivamente, mescolarli accuratamente pipettandoli delicatamente su e giù.

Successivamente, aggiungere 150 microlitri della miscela finale a ciascun inserto. Quindi trasferire gli inserti in un incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica per 30 minuti fino a quando il gel non polimerizza. Per la condizione statica, aggiungere 100 microlitri di terreno privo di siero sopra il gel e 1.200 microlitri sotto l'inserto.

I livelli del fluido all'interno e all'esterno dell'inserto nel pozzetto devono essere approssimativamente uguali, con conseguente differenza di pressione minima attraverso il gel e nessun flusso interstiziale. Per la condizione di flusso, aggiungere 100 microlitri di terreno privo di siero sotto l'inserto e 650 microlitri sopra il gel. Allo stesso tempo, cerca di evitare di creare bolle d'aria sotto l'inserto in quanto impediranno alle cellule di migrare attraverso la membrana in queste posizioni.

Quindi posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica per 24 ore. In questa fase, aggiungere 500 microlitri di una volta PBS per pozzetto in una nuova piastra a 24 pozzetti per il lavaggio degli inserti. Quindi rimuovere il fluido rimasto nella parte superiore dei pozzetti di andamento del flusso.

Quindi, usa dei tamponi di cotone per rimuovere il gel dagli inserti. Strofinare la parte superiore della superficie della membrana per rimuovere le cellule non VA. Quindi lavare gli inserti inserendoli nella piastra a 24 pozzetti contenente una volta PBS per 15 secondi.

Successivamente, rimuovere il PBS e aggiungere 500 microlitri di para formaldeide al 4% sotto ogni inserto. Incubarli per 30 minuti a temperatura ambiente per fissare le cellule trasmigrate. Quindi rimuovere il PFA e sciacquarli una volta con 500 microlitri una volta PBS per rimuovere il fissativo residuo.

Successivamente, aggiungere 500 microlitri di soluzione di Triton X 100 allo 0,5% sotto gli inserti e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Per permeare le cellule, tagliare le membrane dall'inserto usando una lama di rasoio. Quindi metterli in 100 microlitri di due microgrammi per millilitro DPI in una soluzione PBS una volta.

Facendo attenzione a posizionare la parte inferiore della membrana rivolta verso il basso. La soluzione DPI deve essere preparata alcuni minuti prima dell'uso e tenuta al buio. Ora avvolgi il piatto in un foglio di alluminio.

Posizionarlo su uno shaker a 150 RPM per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi lavare le membrane in 500 microlitri una volta PBS e rimetterle sullo shaker per 10 minuti. Per rimuovere il jy libero, ripetere il lavaggio altre due volte.

Il passo successivo consiste nel posizionare le membrane su vetrini con le cellule transmigrate rivolte verso l'alto. Aggiungere la soluzione di montaggio alle membrane. Quindi coprili con vetrini.

Successivamente, conta la macchia dappy sui nuclei e calcola il numero di cellule invase secondo il manoscritto di accompagnamento. Questa figura mostra le cellule MDA MB 4 35 s trasmigrate sulla membrana. Le cellule invase sono state fissate dopo il test di invasione del flusso di fluido interstiziale e colorate con DPI e foide coniugato Alexa Fluor 4 88 per facilitare il conteggio delle cellule invase.

Questa è la membrana in campo chiaro e qui ci sono i nuclei di macchia dappy. I foidi Alexa Fluor 4 88 colorati con F actina sono mostrati qui. Questo grafico mostra che l'invasione delle cellule di melanoma metastatico MDA MB 4 35 s è stata significativamente potenziata dal flusso interstiziale.

Dopo 24 ore, i risultati vengono normalizzati alla media della condizione di invasione statica e viene presentata la media di sei inserti di coltura cellulare. La differenza tra le condizioni è statisticamente significativa con un valore P di 0,003. Una volta padroneggiato, il saggio del flusso di fluido interstiziale può essere impostato in due ore, seguito da un'incubazione di 24 ore e quindi da due ore per il fissaggio e la colorazione delle membrane trasformate.

Seguendo questa procedura, le cellule, le proteine o gli acidi nucleici possono essere facilmente estratti per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio il modo in cui l'espressione genica e proteica cambia in risposta al flusso di fluido interstiziale. Sin dal suo sviluppo, questo è diventato un test essenziale per i ricercatori che studiano gli effetti del flusso interstiziale sulle cellule tumorali.