Tridimensionale Cultura modello cellulare per misurare gli effetti del flusso del fluido interstiziale sulla Invasion cellule tumorali

Lo scopo di questa procedura è esporre cellule coltivate in 3D a un flusso di fluido interstiziale e quantificare gli effetti mediati dal flusso sull'invasione cellulare. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto una soluzione di gel composta da collagene di tipo I e matrigel. Il secondo passaggio consiste nell'aggiungere alla soluzione di gel una concentrazione definita di cellule.

Successivamente, la sospensione cellulare viene aggiunta a un transwell con diametro di 12 millimetri e pori di 8 micron e incubata a 37 gradi Celsius fino a quando la matrice non si è gelificata. L'ultimo passaggio nell'allestimento del saggio consiste nell'aggiungere quantità specifiche di mezzo ai transwell per creare condizioni statiche e dinamiche. Dopo 24 ore, le membrane dei transwell vengono fissate, colorate e osservate al microscopio per la quantificazione del numero di cellule penetrate.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le camere a flusso interstiziale microfluidiche, è che non richiede pompe né attrezzature specializzate e consente ai ricercatori di testare facilmente e rapidamente molteplici condizioni o trattamenti. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla migrazione e sull'invasione cellulare, può anche essere utilizzato per studiare l'effetto del flusso del liquido interstiziale su altri comportamenti cellulari rilevanti, come l'espressione proteica, la proliferazione cellulare e le alterazioni nella segnalazione cellulare. A dimostrazione di questa procedura sarà presente un LIMA two chaa.

Uno studente laureando nel mio laboratorio inizia questa procedura ponendo un piccolo aliquota di matrigel sul ghiaccio a quattro gradi Celsius. Successivamente, preparare la ricetta del gel con acqua sterile PBS, idrossido di sodio, matrigel e collagene di tipo uno da coda di ratto. Quindi, mescolare i componenti del gel sul ghiaccio nello stesso ordine e incubare la soluzione finale per un'ora a quattro gradi Celsius.

Ora posizionare un inserto per coltura cellulare da 12 millimetri di diametro con membrana microporosa in una piastra a 12 pozzetti utilizzando una pinzetta sterilizzata. Quindi contare le cellule e risospendere in mezzo privo di siero a una concentrazione di cinque volte 10 alla sesta cellule per millilitro, aggiungere 100 microlitri di sospensione cellulare a 900 microlitri di soluzione di gel. Successivamente, mescolare accuratamente aspirando e dispensando delicatamente con una pipetta.

Successivamente, aggiungere 150 microlitri della miscela finale in ciascun inserto. Quindi trasferire gli inserti in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 30 minuti, fino al completamento della polimerizzazione del gel. Per la condizione statica, aggiungere 100 microlitri di mezzo privo di siero sopra il gel e 1.200 microlitri sotto l'inserto.

I livelli di fluido all'interno e all'esterno dell'inserzione nel pozzetto dovrebbero essere approssimativamente uguali, determinando una differenza di pressione minima attraverso il gel e l'assenza di flusso interstiziale. Per la condizione di flusso, aggiungere 100 microlitri di mezzo privo di siero sotto l'inserzione e 650 microlitri sopra il gel. Allo stesso tempo, cercare di evitare la formazione di bolle d'aria sotto l'inserzione, poiché impedirebbero alle cellule di migrare attraverso la membrana in quelle zone.

Quindi posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per 24 ore. In questo passaggio, aggiungere 500 microlitri di PBS 1x per pozzetto in una nuova piastra a 24 pozzetti per lavare gli inserti. Quindi rimuovere il mezzo residuo nella porzione superiore dei pozzetti del flusso.

Successivamente, utilizzare bastoncini di cotone per rimuovere il gel dagli inserti. Pulire la superficie superiore della membrana per rimuovere le cellule non VA. Quindi lavare gli inserti posizionandoli nella piastra a 24 pozzetti contenente PBS 1x per 15 secondi.

In seguito, rimuovere il PBS e aggiungere 500 microlitri di paraformaldeide al 4% sotto ciascun inserto. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente per fissare le cellule transmigrate. Quindi rimuovere la PFA e risciacquare una volta con 500 microlitri di PBS per rimuovere il fissativo residuo.

Successivamente, aggiungere 500 microlitri di soluzione di Triton X-100 allo 0,5% al di sotto degli inserti e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Per permeabilizzare le cellule, tagliare le membrane dall'inserto utilizzando una lametta. Quindi posizionarle in 100 microlitri di DPI a due microgrammi per millilitro in soluzione di PBS 1x.

Avendo cura di posizionare il lato inferiore della membrana rivolto verso il basso. La soluzione di DPI deve essere preparata alcuni minuti prima dell'uso e mantenuta al buio. Ora avvolgere la piastra con della carta d'alluminio.

Posizionarlo su un agitatore a 150 RPM per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi lavare le membrane in 500 microlitri di PBS una volta e riposizionarle sull'agitatore per 10 minuti. Per rimuovere il jy libero, ripetere il lavaggio altre due volte.

Il passo successivo consiste nel posizionare le membrane su vetrini con le cellule transmigrate rivolte verso l'alto. Aggiungere la soluzione di montaggio sulle membrane. Quindi coprirle con coprioggetti.

In seguito, contare la colorazione di dappy rispetto ai nuclei e calcolare il numero di cellule invase secondo il manoscritto allegato. Questa figura mostra le cellule MDA MB 4 35 s transmigrate sulla membrana. Le cellule invase sono state fissate dopo il saggio di invasione mediante flusso del liquido interstiziale e colorate con DPI e foid coniugato ad Alexa Fluor 4 88 per facilitare il conteggio delle cellule invase.

Questa è la membrana in campo chiaro ed ecco i nuclei colorati con DAPI. Qui sono mostrati l’Alexa Fluor 488 e il foid marcato con F-actina. Questo grafico mostra che l'invasione delle cellule di melanoma metastatico MDA MB 435s è stata significativamente potenziata dal flusso interstiziale.

Dopo 24 ore, i risultati vengono normalizzati rispetto alla media della condizione di invasione statica e viene presentata la media di sei inserti per coltura cellulare. La differenza tra le condizioni è statisticamente significativa con un valore P di 0,003. Una volta acquisita padronanza, il saggio del flusso del liquido interstiziale può essere allestito in due ore, seguite da un'incubazione di 24 ore e quindi da altre due ore per la fissazione e la colorazione delle membrane trasformate.

Seguendo questa procedura, è possibile estrarre facilmente cellule, proteine o acidi nucleici al fine di rispondere a ulteriori domande, ad esempio come l'espressione genica e proteica cambia in risposta al flusso del liquido interstiziale. Da quando è stata sviluppata, questa è diventata un'analisi essenziale per i ricercatori che studiano gli effetti del flusso interstiziale sulle cellule tumorali.