Una procedura ottimizzata per fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS) Isolamento del Sistema Nervoso Autonomo progenitori neurali da organi viscerali di topi fetali

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di derivare una popolazione di progenitori neuronali purificati dai gangli del sistema nervoso periferico. Ciò si ottiene sezionando prima l'organo o i gangli specifici di interesse dai topi fetali. I tessuti vengono quindi parzialmente dissociati per liberare le singole cellule nel mezzo circostante.

Successivamente, la sospensione cellulare viene filtrata per rimuovere eventuali grumi di tessuto residui o aggregati di grandi dimensioni. Infine, la sospensione cellulare viene ordinata a flusso per isolare la popolazione di interesse in base all'espressione di un reporter fluorescente in quella popolazione cellulare. In definitiva, i modelli di espressione genica possono essere confrontati tra progenitori, isolati in diversi stadi di sviluppo o tra popolazioni purificate di diversi tipi di cellule neuronali.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto all'isolamento di popolazioni cellulari basato sulla marcatura degli anticorpi è che spesso non sono disponibili reagenti immunologici. Che etichettano le cellule che esprimono un particolare gene, linee di topi geneticamente modificate che producono proteine fluorescenti in sottogruppi neuronali discreti consentono l'isolamento di queste popolazioni cellulari. Mentre dimostriamo questo metodo per l'isolamento dei progenitori neurali dall'intestino e dalla traccia neurogena della bocca, può essere applicato anche ad altri sistemi modello che esprimono reporter fluorescenti.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché tendono a digerire eccessivamente i tessuti di origine con conseguente perdita di vitalità cellulare. Prima di iniziare la dissezione, osserva gli embrioni con l'illuminazione a campo chiaro per assicurarti che le strutture pertinenti siano a fuoco. Quindi identificare gli embrioni transgenici positivi mediante screening per l'espressione del reporter fluorescente utilizzando uno stereomicroscopio fluorescente.

Dopo l'eutanasia, gli embrioni iniziano aggiungendo una quantità minima di PBS al piatto di dissezione, in modo che l'embrione non galleggi mentre i tessuti vengono sezionati. Aprire la pelle dell'embrione lungo i lati del corpo e attraverso l'addome a livello del fegato. Arrotola l'embrione sulla schiena e usa una pinza fine per fissarlo in posizione.

A livello degli arti anteriori, inserire un altro paio di pinze a livello del diaframma, quindi rapidamente. Tirare gli organi interni verso il basso verso la coda e lontano dalla parete dorsale del corpo per rimuovere i visceri dal fegato fino al tubercolo genitale. Se alcuni organi della cavità toracica, come il cuore o i polmoni, escono attaccati ai visceri, rimuoverli prima di procedere ulteriormente.

Una volta che i visceri addominali sono separati dalla carcassa, inserire un paio di pinze sotto il fegato, vicino allo stomaco, e allontanare delicatamente il fegato dall'intestino. Quindi sezionare con cura l'intestino posteriore lontano dall'uretra dorsale e rimuovere l'intestino dal tratto urogenitale. Infine, capovolgi l'intestino in modo che la milza sia visibile sotto lo stomaco.

Rimuovere la milza e il pancreas. Separare gli anelli del budello tenendoli per il mesentario. Quindi rimuovere il mesentario e la vascolarizzazione di accompagnamento dall'intestino tirando delicatamente il mesenario.

Evitare di tenere l'intestino direttamente con il forcipe. Se l'intestino si rompe, basta raggruppare i pezzi separati nella fase di dissociazione. Raggruppare ogni tipo di tessuto in una provetta conica da 15 millilitri contenente HBSS ghiacciato in base al tipo di tessuto e al tipo di fenotipo embrionale.

Dopo la pellettatura, i tessuti sub sezionati aspirano la massima HBSS possibile. Quindi risospendere il pellet di tessuto in uno o diversi millilitri di ACU max. Sostituzione dei puntali delle pipette tra un campione e l'altro.

Per evitare la contaminazione incrociata dei tipi di tessuto, posizionare le provette in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 20-45 minuti. A seconda dello stadio del tessuto da isolare, la dissociazione e il filtraggio del tessuto sono la parte più complicata della procedura per prevenire la dissociazione evidente del tessuto. E, di conseguenza, bassa vitalità cellulare.

Limitare il tempo di dissociazione e non cercare di dissociare completamente tutti i pezzi di tessuto a metà. E alla fine del tempo di dissociazione, rompere manualmente il tessuto sbattendo energicamente il tubo contro il lato del bagno d'acqua e lanciando il tubo verso il basso con un movimento del polso scattante. Ora sposta i campioni dissociati sul ghiaccio e aggiungi immediatamente un millilitro di quench appena preparato a ciascuna provetta utilizzando una nuova punta della pipetta per ogni campione, fai scorrere il campione su e giù fino a quando il tessuto non è quasi completamente dissociato.

Ora, utilizzando un paio di pinze sterilizzate con etanolo, posizionare un quadrato di tre centimetri di membrana a rete di nylon da 38 micron sulla bocca di un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Utilizzare quindi puntali a foro stretto per filtrare la singola soluzione di cellula risospesa attraverso la rete pipettandola al centro della membrana. Una volta filtrata la sospensione cellulare, sciacquare la provetta del campione con un millilitro di quench da uno a cinque e filtrare le cellule rimanenti.

Quindi rimuovere la membrana facendo attenzione a evitare che eventuali campioni di tessuto non filtrati entrino nella provetta. Dopo la pellettatura, le sospensioni cellulari aspirano il surnatante e riprospendono il pellet in un millilitro di quench da uno a cinque. Quindi filtrare ogni sospensione cellulare attraverso una rete di nylon in tubi di polistirene da cinque millilitri come appena mostrato.

Iniziare riservando una piccola aliquota del campione di fluorescenza per il solo controllo di compensazione EGFP. Quindi dividere il campione di tessuto wild type in due porzioni, etichettando solo un wild type e gli altri sette A a d.Only. A questo punto, riempire tutte le provette dei campioni con il quench da uno a cinque e, dopo la pellettizzazione, aspirare tutti i campioni tranne gli ultimi 200 microlitri di surnatante in ciascuna provetta.

Infine, aggiungere sette a d ai campioni da ordinare e i sette a a d solo il controllo. Quindi aggiungere 0,75 millilitri di triazolo LS alla microcentrifuga da 1,5 millilitri. Le provette di raccolta dei campioni iniziano utilizzando i campioni di controllo per impostare i parametri di compensazione e i gate per evitare sette cellule morte positive A a D e per raccogliere le cellule che presentano un'elevata intensità di fluorescenza GFP.

Dopo aver impostato i parametri di compensazione, iniziare la cernita alla pressione più bassa possibile con un ugello a foro largo e una portata bassa. Raccogliere un massimo di 25.000 cellule in ciascuna provetta per microcentrifuga in modo che il triolo LS non sia eccessivamente diluito. Immediatamente dopo il vortice di smistamento, ogni provetta di cellule catturata nel triolo ls.

In questa prima figura, un intero tratto genitale europeo a 15,5 giorni dopo il coito visto ventralmente sotto illuminazione in campo chiaro è mostrato qui. Lo stesso campione viene visualizzato sotto illuminazione a fluorescenza per dimostrare la distribuzione delle cellule EGFP positive nei gangli celiaci surrenalici e medialmente localizzati, come identificato dalla loro espressione transgenica TH EGFP. Questa vista laterale di una vescica sub sezionata TH EGFP a 15,5 giorni dal cotus mostra la fluorescenza dall'espressione del transgene nei gangli pelvici, nella parete vescicale e nell'uretra.

In questa vista dorsale dello stesso EGFP, le cellule positive sono evidenti nella dissociazione del tessuto dell'uretra dorsale anteriore per produrre sospensioni cellulari per il flusso. Queste micrografie fotografiche mostrano il tratto urogenitale inferiore e i tessuti intestinali a metà del tempo di dissociazione. Come si vede in queste foto di tessuto opportunamente digerito prima e dopo il manuale, i tre pezzi di organi sub sezionati sono ancora chiaramente evidenti nei tessuti che vengono trattati enzimaticamente per troppo tempo o a una concentrazione troppo alta di enzima.

Tuttavia, la sospensione risultante manca di qualsiasi residuo di grandi pezzi di tessuto La dissociazione appropriata e il filtraggio manuale producono profili di citometria a flusso che in genere mostrano più del 90% di cellule vitali e quelle cellule che esprimono il reporter in questa popolazione vitale, le cellule mantengono un'espressione di EGFP ad alta intensità. La popolazione nera è composta da singole cellule morte e marcate mediante captazione di sette muoiono di fluorescenza. La popolazione grigia è composta da cellule singoletto basate sulla dispersione diretta e laterale che hanno escluso sette a a d, e sono quindi vitali.

La popolazione verde proviene dall'area gated GFP positiva ed è composta da singole cellule vitali che hanno escluso sette A a d e che mostrano fluorescenza EGFP. Con questa procedura, l'isolamento dei progenitori neuronali da altri tessuti periferici come la catena simpatica, la radice dorsale, i gangli o il polmone può essere eseguito per rispondere a domande sulle differenze nei profili di espressione genica tra le popolazioni o sullo sviluppo di linee distinte.