Vivo Valutazione Ex della contrattilità, affaticabilità e alternanza in isolati muscoli scheletrici

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare muscoli sani e intatti per studiare la funzione contrattile in vitro. Ciò si ottiene isolando prima l'estensore lungo delle dita intatto o EDL e il soleo o i muscoli della suola dal topo. Il secondo passo consiste nel legare i legamenti e i tendini dell'EDL e i muscoli della suola con sutura chirurgica.

Quindi, montare i muscoli isolati sul trasduttore di forza e nella camera contrattile. Il passaggio finale consiste nello stimolare il muscolo con impulsi elettrici di campo per indurre le contrazioni. Infine, le forze risultanti vengono trasmesse al trasduttore di forza e registrate Possono essere eseguite varie manipolazioni fisiologiche e farmacologiche per confrontare i loro effetti sulla contrattilità muscolare.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto al metodo esistente per valutare la funzione muscolare, come la misurazione della contrattilità in situ, il trattamento delle prestazioni maschili, eccetera, è che questo metodo rimuove le componenti neuronali e vascolari dal muscolo scheletro, consentendo una valutazione diretta della proprietà intrinseca del muscolo in contrazione. Generalmente gli individui nuovi a questo metodo, la ruota lotta perché la dissezione dei muscoli inalatori intatti richiede destrezza e pazienza diffuse. Questa procedura sarà uno, un tecnico nel mio laboratorio e un parco del buco della serratura, un borsista post-dottorato nel laboratorio Dr.Jma.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la dissezione muscolare e il montaggio sulla camera contrattile sono difficili da eseguire. Pertanto, questo video aiuta a comprendere la struttura anatomica del muscolo e ad apprezzare la scala necessaria per il montaggio del muscolo isolato. In questa procedura, sacrificare un topo selvatico di tipo C 57 nero sei, o un modello murino di malattia mediante lussazione cervicale e posizionarlo in posizione laterale.

Per sezionare l'EDL, praticare un'incisione cutanea superficiale. Tagliare la fascia tra la tibia anteriore e il gruppo muscolare posteriore. Individuare l'origine prossimale in cui il legamento è collegato al condilo laterale della tibia e al superiore, tre quarti della superficie fibulare anteriore.

Quindi, tagliare il legamento con delicate forbici oftalmiche il più distale possibile dal muscolo per rilasciare l'origine prossimale del muscolo EDL. Dopodiché, tieni il legamento con un paio di pinze smussate e tiralo lentamente per liberare l'EDL. Potrebbe essere necessario tagliare parte del paramecio che circonda l'EDL e altri muscoli intorno all'EDL.

Questo passaggio deve essere eseguito delicatamente per evitare di danneggiare il muscolo EDL. Quindi, nella regione di inserzione in cui i quattro tendini distali si inseriscono nel mezzo e nelle falangi distali delle dita da due a cinque, tagliare i tendini il più lontano possibile dai muscoli. Trasferire il muscolo EDL isolato in una capsula di dissezione contenente una soluzione di tiropolino isotonico priva di calcio.

Il muscolo EDL è un muscolo glicolitico veloce di colore bianco rosa pallido, una lunghezza di circa 10-13 millimetri e un peso da otto a 11 milligrammi. Successivamente, legare strettamente un nodo chirurgico ad entrambe le estremità del muscolo EDL isolato con sei suture di dimensioni calde il più distale possibile dal muscolo e leggermente al di sopra del punto medio longitudinale del legamento o del tendine. Quindi trasferire il muscolo EDL nella camera del bagno di tessuto saturo di ossigeno.

Montare il muscolo sulla scanalatura del campione del trasduttore di forza e il gancio fisso sul fondo della camera del bagno. Ripetere il processo di isolamento e montaggio per il muscolo EDL dall'altra gamba per sezionare la suola sul lato laterale posteriore della gamba. Spingere da parte il muscolo gastro che normalmente lo ricopre.

La suola è un muscolo ossidativo lento di colore rosso scuro, circa un millimetro più corto dell'EDL, ma pesa leggermente di più dell'EDL. All'origine prossimale. Tagliare il legamento che si collega alla metà prossimale della tibia posteriore lungo la linea della suola e al terzo prossimale del perone posteriore.

Successivamente, all'inserzione distale, tagliare il tendine calcaneare che si inserisce nel calcagno posteriore. Liberate con cura l'anima in seguito. Montare correttamente la suola del muscolo nella camera del bagno.

Una volta che i muscoli sono montati nelle singole camere del bagno tissutale, iniziare a registrare i dati. Ricordarsi di azzerare la linea di base del trasduttore di forza. Ciò faciliterà l'osservazione dei cambiamenti al basale e semplificherà il confronto delle contrazioni muscolari in diverse condizioni sperimentali.

Quindi stimolare i muscoli isolati con impulsi a onda quadra. Utilizza correnti elettriche che vanno da 60 a 300 milliampere con una durata dell'impulso a onda quadra individuale compresa tra 0,3 e un millisecondo e durate del treno stimolatore di 350, 500 o 1000 millisecondi. Il passo successivo è quello di selezionare una frequenza di stimolazione in grado di produrre la massima forza titanica quando il muscolo isolato viene allungato alla sua lunghezza ottimale a temperatura ambiente.

Questa frequenza è in genere di circa 100 hertz per EDL e 60 hertz. Per l'anima, allunga lentamente il muscolo e attendi 30 secondi, quindi stimolalo a 100 hertz o 60 hertz. Dopodiché, allungalo di nuovo.

Attendere altri 30 secondi e stimolarlo nuovamente durante lo stretching. Se la forza non aumenta ulteriormente, normalmente significa che è stata raggiunta la forza massima. Nel frattempo, dopo cicli ripetitivi di stretching e stimolazione, la diminuzione della forza suggerisce che i muscoli sono stati eccessivamente allungati In questa situazione, rilasciare il muscolo al livello di allungamento precedente e stimolare nuovamente il muscolo fino a quando non si osserva la forza massima.

Ora, ottieni la relazione tra forza e frequenza. Stimolare il muscolo con frequenze da uno a 140 hertz con incrementi da cinque a 10 hertz e una periodicità da 30 a 60 secondi. Quando si eseguono gli esperimenti a 25 gradi Celsius, quando gli esperimenti vengono eseguiti a 37 gradi Celsius, estendere l'FF a frequenze più alte fino a 300 hertz per il muscolo del diaframma, da 180 a 200 hertz per l'anima e da 220 a 250 hertz per l'EDL.

Successivamente, confrontando la quantità di forza generata da ciascuna frequenza di stimolazione, identificare la frequenza che genera la forza titanica massima e circa la metà della forza titanica massima. Tmax fornisce importanti informazioni sulla modulazione dei macchinari a contrattile. Mentre il mezzo Tmax fornisce informazioni più pertinenti alla regolazione del calcio e al processo ECC.

Il muscolo viene quindi stimolato con frequenza tmax a un intervallo di un minuto per 30 minuti, un processo chiamato equilibrio per studiare il contributo del reticolo sarcoplasmatico. Il rilascio di calcio alla contrattilità muscolare dopo l'equilibrio affatica i muscoli erogando una mezza stimolazione Tmax a un intervallo di due secondi per cinque minuti. Abbiamo usato la durata del treno di 500 millisecondi qui, e quindi il ciclo di lavoro è del 25%Quindi recupera il muscolo a metà Tmax a un intervallo di un minuto.

Per 30 minuti o fino a quando la forza non è stabile, è possibile eseguire un ulteriore protocollo di affaticamento. Ora si ritiene che l'utilizzo dell'affaticamento tmax presso Tmax verifichi accuratamente lo stato del macchinario contrattile. Quindi ripetere le procedure per ottenere FF in modo da poter osservare le differenze fenotipiche tra diversi ceppi, modelli di malattia o trattamenti farmacologici.

Analizzando la FF prima e dopo l'affaticamento per sondare il contributo dell'ingresso extracellulare di calcio alla contrattilità muscolare, la soluzione per il bagno può essere modificata in una soluzione che non contiene calcio, ma EGTA 0,1 millimolare. In alternativa, nella soluzione balneare possono essere applicati diversi blocchi dei canali gestiti dal deposito. Al termine dell'esperimento, misurare la lunghezza sperimentale dei muscoli, quindi pesarli singolarmente con una bilancia analitica, flashare, congelare i muscoli in azoto liquido e conservarli a meno 80 gradi Celsius per le analisi biochimiche.

Ora, calibrare il trasduttore di forza. Converti la forza muscolare registrata in millivolt in grammi di forza in base ai risultati della calibrazione. Quindi normalizzarlo nell'area della sezione trasversale fisiologica.

Questa figura mostra le forze contrattili indotte da cinque hertz, 20 hertz, e la forza titanica massima qui mostra una traccia di forza contrattile, di un muscolo danneggiato. Ecco un esempio rappresentativo che mostra le singole contrazioni di una relazione tra forza e frequenza nell'EDL e la curva tracciata risultante dal ff. Questo è un tipico profilo affaticante a declino rapido del muscolo EDL e un profilo affaticante a declino lento del muscolo della pianta del piede.

La stimolazione faticosa porta alla comparsa di alternative meccaniche In un trucco, un muscolo knockout con proprietà di manipolazione del calcio disturbate Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore. Se eseguito correttamente, l'intero esperimento durerà più a lungo e dipenderà dal numero di interventi eseguiti. Durante il tentativo di questa procedura, è molto importante isolare e montare il muscolo DL il più rapidamente possibile perché l'ambiente in vitro a basso contenuto di ossigeno può causare danni irreversibili al digiuno di ciascun muscolo.

Seguendo questa procedura, l'analisi genica, l'immunoistochimica del western blotting e gli studi strutturali possono essere eseguiti sugli stessi muscoli sperimentali per rispondere a ulteriori domande. Ad esempio, il livello di espressione e la localizzazione di una particolare proteina o dei componenti delle proteine muscolari che regolano la contrattilità o la segnalazione del calcio, nonché le alterazioni morfologiche o ultra strutturali nei muscoli derivanti da una specifica condizione dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della fisiologia muscolare per esplorare i difetti genetici che influenzano la funzione del muscolo scheletrico in vari modelli, tra cui topi, ratti e criceti.