Metodi di studio variazioni inerenti l'aggregazione proteica con l'età in Caenorhabditis elegans
November 26th, 2017
L'obiettivo del metodo qui presentato è quello di esplorare l'aggregazione di proteine durante l'invecchiamento normale nell'organismo modello di c. elegans. Il protocollo rappresenta un potente strumento per studiare i grandi aggregati altamente insolubili che formano con l'età e per determinare l'impatto di cambiamenti nel proteostasis aggregazione proteica.
L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di rilevare i cambiamenti nell'insolubilità proteica con l'età in C.elegans e di valutare come il knockdown genico mirato influenzi questo marcatore di invecchiamento. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'invecchiamento e della proteostasi, come ad esempio il motivo per cui gli organismi non riescono a mantenere un proteoma sano con l'età. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'opportunità di studiare l'aggregazione proteica durante il normale invecchiamento in assenza di processi patologici.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'aggregazione proteica in C.elegans, può anche essere adattato ad altri organismi modello, ad esempio per studiare l'insolubilità proteica legata all'età nel topo. Per iniziare il trattamento, aggiungere 207,45 millilitri di terreno basale S con reagenti aggiuntivi come descritto nel protocollo di testo allegato a un pallone di coltura Fernbach da 2.800 millilitri. Aggiungere una concentrazione finale di 50 microgrammi per millilitro di Carbenicillina e un millimolare di IPTG e chiudere il pallone con un tappo a vite a membrana.
Estrarre gli L1 dall'incubatrice a 25 gradi Celsius e trasferirli in provette da 15 millilitri. Centrifugare gli L1 a 1, 900 volte g per tre minuti. Dopo la centrifuga, rimuovere il surnatante.
Al microscopio, conta gli L1 per due microlitri e calcola la media dei numeri ottenuti da almeno nove gocce. Successivamente, aggiungere 50.000 vermi per la raccolta di vermi giovani e 100.000 vermi per la raccolta di vermi invecchiati in quattro fiasche di coltura Fernbach preparate nel passaggio precedente. Quindi, aggiungi i batteri RNAi di controllo e i batteri RNAi per il gene di interesse proporzionalmente al numero di vermi.
Dopo aver aggiunto i batteri, completare la coltura di vermi con S Basal per portare il volume totale a 300 millilitri. Incubare la coltura di vermi a 25 gradi Celsius in un'incubatrice vibrante a 150 giri/min fino alla raccolta. Raccogli i giovani vermi al secondo o terzo giorno per misurare i livelli basali di solubilità delle proteine.
Versare i vermi da un pallone in un imbuto separatore e lasciare sedimentare i vermi per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo che i vermi si sono sedimentati, aprire il rubinetto di arresto e gocciolare i vermi in un tubo da 50 millilitri. Quindi, dividere il pellet di verme in due tubi da 15 millilitri.
Riempire le provette fino a 15 millilitri con M9 e centrifugare i vermi. Per lavare i vermi, rimuovere il surnatante e riempire il tubo fino a 15 millilitri con M9. Ripetere la centrifugazione. Una volta completato il lavaggio, trasferire i vermi in due provette da 50 millilitri e utilizzare M9 ghiacciato per riempire il volume totale a 20 millilitri.
Per rimuovere batteri e vermi morti, aggiungi i due pellet di vermi diluiti da 20 millilitri a due provette da 50 millilitri riempite con 20 millilitri di saccarosio ghiacciato al 60%. Centrifugare rapidamente le provette. Con una pipetta da 25 millilitri, rimuovere con cura fino a 15 millilitri dello strato superiore del verme.
Posizionare lo strato superiore di verme direttamente in 37 millilitri di M9 più octossinolo-9 preparato con ghiaccio. Quindi, centrifugare le provette a 2.700 volte g per tre minuti a quattro gradi Celsius in accelerazione nove e decelerazione sette. Dopo aver scartato il surnatante, trasferire il pellet in quattro tubi da 15 millilitri e lavarli due volte con M9 ghiacciato più octossinolo-9.
Quindi, centrifugare le provette. Rimuovere il surnatante e riempire i tubi fino alla tacca di 15 millilitri con M9 ghiacciato più octoxynol-9. Lavare i vermi con M9 ghiacciato e unire i quattro tubi in due tubi.
Riempire le provette a 15 millilitri e centrifugare. Togliere il surnatante, riempire i due tubi con M9 a temperatura ambiente fino a un volume totale di quattro millilitri e ruotarli su un mixer nutante a 25 gradi Celsius per 40 minuti. Dopo la nutazione, lavare i vermi due volte con M9 ghiacciato più octossinolo-9.
Quindi, lavateli due volte con M9 e trasferite i vermi in un tubo. Lavare i vermi nel tampone di estrazione ad alto contenuto di sale RAB o RAB senza inibitori prima della raccolta. Rimuovere il surnatante fino a quando non c'è più liquido sopra il pellet del verme.
Quindi, stimare il volume del pellet di vite senza fine e aggiungere un volume identico di RAB con inibitori. Preparare una provetta da 50 millilitri riempita per metà con azoto liquido su ghiaccio secco e utilizzando una pipetta Pasteur, aspirare i vermi e farli gocciolare lentamente nella provetta. Lasciare evaporare l'azoto liquido e conservare i vermi congelati a meno 80 gradi Celsius fino a un'ulteriore lavorazione.
Raffreddare il mortaio con azoto liquido ed eseguire la disgregazione dell'animale su ghiaccio secco. Trasferire i vermi congelati nel mortaio preraffreddato e macinarli per 2,5 minuti. Aggiungere 100 millilitri di azoto liquido alla polvere e macinare per altri 2,5 minuti.
Usa un microscopio per verificare che i corpi dei vermi siano rotti in piccoli pezzi. Quindi, trasferisci la polvere in tubi da due millilitri e conservali a meno 80 gradi Celsius. Su ghiaccio secco, pesare due volte 350 milligrammi di vermi macinati per punto temporale e per batterio RNAi in provette da due millilitri.
Per rimuovere le proteine solubili ad alto contenuto di sale, aggiungere due volumi per peso di RAB già preparato con inibitori, un millimolare PMSF, 200 unità per millilitro di DNasi I e 100 microgrammi per millilitro di RNasi A a ciascuna provetta e solubilizzare la polvere con ghiaccio. Aspirare la sospensione in una siringa da un millilitro 15 volte e incubarla con ghiaccio per 10 minuti. Centrifugare a 18, 400 volte g per 20 minuti a quattro gradi Celsius.
Passa attraverso lo strato di grasso e raccogli il surnatante contenente proteine solubili ad alto contenuto di sale in una provetta da due millilitri per condizione. Eliminate il grasso e scartatelo. Aliquotare proteine solubili ad alto contenuto di sale da congelare a meno 80 gradi Celsius.
Per scartare i lipidi, solubilizzare il pellet con 700 microlitri di RAB con inibitori contenenti un molare di saccarosio senza DNasi I e RNasi A.Aspirare la sospensione in una siringa 10 volte e incubarla con ghiaccio per cinque minuti. Assicurati di rimuovere tutto il surnatante e i lipidi e di scartarli. Per rimuovere le proteine solubili in SDS, solubilizzare il pellet con 700 microlitri di tampone RIPA.
Aspirare la sospensione in una siringa 10 volte e incubarla per 10 minuti con ghiaccio. Centrifugare a 18, 400 g per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere il surnatante contenente proteine solubili in SDS e aliquotare per il congelamento a meno 80 gradi Celsius.
Raggruppare due campioni di ciascuna condizione dopo aver solubilizzato ogni pellet con 500 microlitri di tampone RIPA e aspirare la sospensione in una siringa 10 volte. Fare attenzione a rimuovere tutto il surnatante e a gettarlo. Solubilizzare il pellet finale contenente proteine altamente insolubili con 400 microlitri di acido formico al 70% e aspirare la sospensione in una siringa 20 volte.
Incubare la sospensione per 20 minuti con ghiaccio. Centrifugare la sospensione in provette da ultracentrifuga per rimuovere i detriti della cuticola del verme. Raccogli il surnatante che contiene proteine altamente insolubili e congelalo a meno 80 gradi Celsius.
La colorazione proteica totale del contenuto proteico insolubile di vermi giovani e anziani ha rivelato un forte aumento correlato all'età dei livelli di proteine altamente insolubili negli animali di controllo e non negli animali longevi. La colorazione con anticorpi di PAB-1, una proteina legante l'RNA con un dominio simile ai prioni, ha confermato i dati della spettrometria di massa che gli animali longevi mantenevano il PAB-1 solubile con l'età. L'analisi in vivo è stata eseguita su animali transgenici che esprimono tagRFP PAB-1 nei muscoli faringei.
Negli animali giovani, il tagRFP PAB-1 era localizzato principalmente in tutta la faringe. Con l'età, un progressivo accumulo di punti luminosi a partire dal bulbo faringeo posteriore. Durante l'invecchiamento, abbiamo anche osservato l'aggregazione nel bulbo faringeo anteriore in un numero crescente di animali.
La quantificazione dei diversi livelli di aggregazione di tagRFP PAB-1 con l'età in wild type e daf-2 mutante rivela un'aggregazione di tagRFP PAB-1 fortemente ritardata con l'età negli animali longevi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come raccogliere un gran numero di vermi per l'estrazione di proteine e come isolare grandi aggregati altamente insolubili per ulteriori analisi mediante spettrometria di massa o pagina SDS.
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Panoramica
Questo studio esplora l'aggregazione delle proteine durante l'invecchiamento normale nell'organismo modello C. elegans. Il metodo consente l'esame degli aggregati proteici insolubili e l'impatto della proteostasi sull'invecchiamento.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biologia
- Ricerca sull'invecchiamento
Sfondo
- L'aggregazione delle proteine è un marcatore chiave dell'invecchiamento.
- C. elegans serve come un modello prezioso per studiare l'invecchiamento.
- Comprendere la proteostasi è cruciale per ottenere informazioni sulle malattie legate all'età.
- Questo metodo può essere adattato per l'uso in altri organismi, come i topi.
Obiettivo dello studio
- Rilevare i cambiamenti nell'insolubibilità delle proteine con l'età in C. elegans.
- Valutare l'influenza del knockdown genico mirato sull'aggregazione delle proteine.
- Affrontare il motivo per cui gli organismi faticano a mantenere un proteoma sano mentre invecchiano.
Metodi utilizzati
- Preparazione di media S Basal con reagenti specifici.
- Uso di Carbenicillina e IPTG nel processo di coltura.
- Monitoraggio dell'aggregazione proteica nel tempo.
- Applicazione di tecniche di knockdown genico per valutare gli effetti sui marcatori dell'invecchiamento.
Risultati principali
- Identificazione dei modelli di aggregazione delle proteine nell'invecchiamento di C. elegans.
- Valutazione di come il knockdown genico altera la solubilità delle proteine.
- Approfondimenti sui meccanismi di fallimento della proteostasi con l'età.
- Potenziale per applicazioni più ampie nella ricerca sull'invecchiamento tra le specie.
Conclusioni
- Il metodo fornisce un quadro robusto per studiare l'aggregazione delle proteine legata all'invecchiamento.
- I risultati contribuiscono alla comprensione del processo di invecchiamento e della proteostasi.
- La ricerca futura può espandere questo approccio ad altri organismi modello.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Studying inherent protein aggregation during normal aging provides a disease-agnostic framework for evaluating proteostasis mechanisms relevant to neurodegenerative target validation. This approach enables mechanistic de-risking of hypotheses linking protein solubility to functional decline in aging populations. Insights support early discovery decisions by identifying genetic modifiers that maintain proteome integrity without relying on ectopic disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses about genes that promote or prevent age-dependent protein insolubility.
- Operational Value: Use quantitative mass spectrometry or antibody-based analysis to dissect gene function in aggregation pathways.
- Predictive Value: Identify targets whose modulation delays aggregation, supporting portfolio triage based on mechanistic confidence.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepare age-synchronized worm populations to generate reproducible insoluble protein fractions for compound screening.
- Quantitative Output: Measure changes in highly insoluble large aggregates as a functional readout of proteostasis modulation.
- Scalability: Enable large-scale worm culture and biochemical isolation for consistent compound evaluation across conditions.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Link inherent aggregation mechanisms to age-associated proteinopathies without confounding disease transgene expression.
- Translational Continuity: Validate findings in vivo using fluorescent-tagged aggregation-prone proteins to confirm biochemical results.
- Risk-Adjusted Advancement: Use aggregation delay in long-lived mutants as a biomarker for target engagement and proteostasis enhancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows by providing a quantitative, genetically tractable readout of proteostasis decline that informs lead identification and target prioritization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene knockdown effects on inherent aggregation, clarifying pathway involvement in aging-related insolubility.
- Screening: Enables assay development based on insoluble protein isolation, offering a standardized, quantitative phenotype for compound or genetic modulator evaluation.
- Analytics: Generates mass spectrometry and immunoblot data to compare insoluble protein profiles across conditions, enabling objective comparison of interventions.
- Translational Research: Connects biochemical aggregation data to in vivo puncta formation in transgenic models, supporting biomarker alignment and mechanistic validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing proteostasis modifiers across multiple targets and therapeutic areas related to aging.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by distinguishing aggregation-promoting from aggregation-preventing genetic factors.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible isolation of highly insoluble proteins enabling cross-functional data comparison.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in proteostasis-targeted programs.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on their ability to maintain protein solubility during aging.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans culture, age synchronization, and biochemical fractionation techniques.
- Depends on access to ultracentrifugation, mass spectrometry, and fluorescence microscopy for aggregate analysis.
- Necessitates standardization of worm harvesting and lysis protocols across labs to ensure reproducible insoluble protein yields.
- Involves adaptation considerations when transferring the biochemical fractionation to other model systems like mouse tissue.
- Limited by the need for large worm numbers and extended culture times for aged collections, affecting throughput.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:53
Liquid Culture for Treatment with RNAi Starting at L1
2:40
Collection of Young and Aged Worms Subjected to RNAi in Liquid Culture
6:14
Disruption of Animals
6:58
Isolation of SDS-insoluble Proteins for Mass Spectrometry
10:03
Results: Reduced IIS Prevents Age-dependent Protein Aggregation
11:26
Conclusion
