Monitoraggio Cell-autonome Ritmi orologio circadiano di espressione genica mediante bioluminescenza Reporter luciferasi

Questo protocollo descrive in dettaglio la generazione di linee cellulari reporter di luciferasi e il successivo monitoraggio dei ritmi circadiani autonomi cellulari di espressione della bioluminescenza. In primo luogo, costruire reporter di espressione della luciferasi lentivirale e produrre particelle lentivirali, procedere a infettare le cellule di interesse e amplificare le colture selezionate. Quindi monitorare l'espressione della bioluminescenza nelle cellule reporter sincronizzate utilizzando un dispositivo di registrazione appropriato.

In definitiva, la registrazione della bioluminescenza viene utilizzata per dimostrare i ritmi circadiani autonomi delle cellule. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la trasfezione transitoria e la protezione germinale è che VIR è mediato. Il gene fornisce un'integrazione stabile nel genoma delle cellule, nonché una maggiore efficienza e versatilità.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sugli orologi cied. Ad esempio, esistono orologi circadiani tessuto-specifici? In caso affermativo, quali sono le proprietà degli orologi circadiani tessuto-specifici?

Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sui meccanismi dell'orologio. Può essere applicato anche ad altri sistemi come la dinamica del ciclo cellulare, la tumorgenesi, eccetera. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo deciso di studiare orologi di sicurezza specifici per tipo di tessuto o cellula.

A dimostrare la procedura saranno la dottoressa Chita Norm Napkin, una borsista post-dottorato, e Sandra, una studentessa laureata del mio laboratorio Atory. Tipicamente, un costrutto reporter circadiano di mammifero contiene una cassetta di espressione in cui un promotore circadiano è fuso con il gene della luciferasi. In questo reporter lentivirale, la luciferasi destabilizzata è sotto il controllo del topo per due promotori.

Per istruzioni dettagliate sulla costruzione di vettori reporter mediante reazione di ricombinazione, consultare il manoscritto di accompagnamento per una trasfezione efficiente. Inizia con una coltura di cellule renali embrionali umane con un basso numero di passaggi che sono dal 90 al 100% confluenti. Ora per rivestire sei piastre di coltura bene.

Per la trasfezione, aggiungere un millilitro di polietilene L allo 0,001% a ciascuno, incubare bene a temperatura ambiente per 20 minuti e risciacquare una volta con PBS. Quindi, raccogli le cellule usando la tripsina e semina le cellule su ciascun pozzetto delle piastre pre-rivestite. Agitare le piastre per ottenere una distribuzione uniforme delle celle.

Verificare che le cellule seminate abbiano raggiunto la confluenza dell'80-90% in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Preparare la miscela di trasfezione plasmidica di un plasmide reporter lentivirale, del DNA e dei tre vettori di imballaggio come controllo sia per la trasfezione che per la successiva infezione. Includere un pozzetto aggiuntivo per un vettore di espressione di GFP lentivirale che ospita la proteina fluorescente verde potenziata sotto il controllo del promotore del CMV.

Quindi, aggiungi 100 microlitri di cloruro di calcio molare 0,25 ai plasmidi e mescola accuratamente. Quindi aggiungere 100 microlitri di due soluzioni XBBS e mescolare delicatamente ma accuratamente. Incubare la miscela di DNA a temperatura ambiente per 15 minuti.

Durante l'attesa, sostituire il terreno delle 2 9 3 cellule T con due millilitri di terreno fresco. Rimettere la piastra nell'incubatore per almeno 10 minuti per equilibrare il pH medio. Quindi, in modo graduale, aggiungere la miscela di trasfezione alle cellule, far roteare delicatamente la piastra, osservare la formazione delle particelle al microscopio, quindi posizionare le cellule in un incubatore per una notte.

Circa 16 ore dopo la trasfezione, ricaricare il terreno con due millilitri di DMEM fresco e coltura durante la notte. Successivamente, per valutare l'efficienza della trasfezione, valutare l'espressione di EGFP nelle cellule di controllo della trasfezione. L'efficienza di trasfezione dal 90 al 100% con un'elevata espressione di EGFP è un predittore affidabile di una buona preparazione virale.

Raccogliere il terreno contenente particelle virali infettive secrete, centrifugare per rimuovere le 2, 9, 3 cellule T residue e raccogliere il virus contenente supernat. Il terzo giorno seminare circa 12.003 cellule T su una coltura su piastra a 12 pozzetti durante la notte con una fluenza del 20-30% di co e osservare le cellule il quarto giorno. Sempre il quarto giorno, aggiungere il poly brain al terreno raccolto contenente particelle virali e mescolare bene mediante pipettaggio.

Ora aspirare il terreno dalle tre cellule T e aggiungere un millilitro di miscela virale per pozzetto. Incubato a 37 gradi Celsius durante la notte dopo aver lavato le cellule una volta con PBS, reintegrare il terreno e incubare le cellule a 37 gradi Celsius durante la notte per il recupero e la crescita. Quando confluente, dividere le cellule e la coltura durante la notte del giorno successivo.

Per iniziare la selezione delle cellule infette, aggiungere un terreno fresco contenente 10 microgrammi per millilitro. Blastico a parte, l'acido esplosivo nell'auto di uccisione deve essere determinato empiricamente per ogni linea cellulare. Reintegrare il terreno contenente blastina ogni due o tre giorni per una selezione continua di cellule resistenti agli antibiotici.

Esprimere i giornalisti dell'orologio. Dopo aver propagato la coltura di cellule reporter resistenti alla blastina in piastre di coltura da 35 millimetri fino a renderle confluenti, di solito prepariamo tre o più piastre per ogni linea cellulare reporter in ogni condizione per il fenotipo sarcy. Dopo un lavaggio con PBS, aggiungere DMEM contenente 10 micromolari di forlina o 200 nanomolari di desametasone incubati a 37 gradi Celsius per un'ora per sincronizzare le cellule.

Ora metti le celle nel mezzo di registrazione appena fatto. Coprire le piastre di coltura con vetrini coprioggetti sterili da 40 millimetri e sigillare in posizione con grasso sottovuoto per evitare l'evaporazione. Carica le parabole sul luminometro a ciclo luminoso e avvia la bioluminescenza in tempo reale.

Registrazione Per la registrazione di 96 vecchie targhe. Con il GSR due dispositivi di registrazione vedi manoscritto comportuno. Registriamo facilmente il ritmo per cinque o sette giorni nel programma di analisi del ciclo lum.

Prima baseline fit i dati grezzi. Quindi utilizzare i dati sottratti dalla linea di base per adattarli a un'onda sinusoidale e determinare i parametri richiesti per i campioni che mostrano ritmi persistenti. Una bontà dei dati in piedi superiore al 90% è facilmente raggiungibile grazie all'elevato transitorio di Luminate.

Senso in alto e cambiamento medio. Di solito escludiamo il primo ciclo di dati dalla nostra analisi per la presentazione dei dati. Traccia i dati grezzi rispetto al tempo quando necessario.

Tracciare i dati sottratti al basale per confrontare l'ampiezza e la fase sia nella trasfezione transitoria di 2, 9, 3 cellule T che nell'infezione di linee cellulari. Le immagini fluorescenti delle cellule che esprimono GFP trasfettate e trasdotte indicano che il sistema di rilascio genico mediato da lentivirali è altamente efficiente. Il ciclo di feedback centrale di un orologio circadiano è costituito da fattori trascrizionali che agiscono sugli elementi di potenziamento circadiano per produrre un'espressione genica ritmica.

Qui, quattro diversi costrutti reporter in tre cellule T producono fasi distinte dell'espressione del reporter. Nuove fasi intermedie possono essere generate con regolazione combinatoria da parte di più elementi circadiani utilizzando il knockdown genico tramite RNAi e composti farmacologicamente attivi. Questo esperimento ha utilizzato il luminometro a ciclo lum per la registrazione della bioluminescenza di cellule in piastre da 35 millimetri in cellule OS U2.

Irna è stato utilizzato per illuminare gli effetti di knockdown dei geni cry one e cry two. Qui è stato utilizzato un luminometro a sinergia per la registrazione della bioluminescenza delle cellule. In una piastra a 96 pozzetti in tre celle reporter T.

Gli RNA sono stati utilizzati per valutare gli effetti del knockdown trino sui ritmi cellulari. In questo esempio, il sistema UX e un luminometro tecan sono stati utilizzati per la registrazione della bioluminescenza delle cellule in 3 84. Mentre le piastre come indicato selezionate, piccole molecole possono colpire farmacologicamente e perturbare la funzione delle proteine nei ritmi cellulari delle cellule reporter U2 OS.

Dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada alla ricerca nel campo della biologia circadiana per esplorare i meccanismi dell'orologio e la fisiologia in diversi tipi di cellule e tessuti. Dopo aver visto questo video, dovrebbe avere una buona comprensione di come generare Lucifero, riportare le linee cellulari e monitorare i volumi.

E non dimenticare che lavorare con il VIR può essere un ordine estremamente pericoloso e la precauzione, come le protezioni personali e la decontaminazione virale, dovrebbe essere sempre presa durante l'esecuzione di questa procedura.