Monitoraggio Cell-autonome Ritmi orologio circadiano di espressione genica mediante bioluminescenza Reporter luciferasi

Questo protocollo descrive la generazione di linee cellulari reporter con luciferasi e il successivo monitoraggio dei ritmi circadiani autonomi delle cellule mediante espressione di bioluminescenza. In primo luogo, costruire reporter virali lentivirali per l'espressione della luciferasi e produrre particelle lentivirali, quindi procedere all'infezione delle cellule di interesse e all'amplificazione delle colture selezionate. Successivamente, monitorare l'espressione della bioluminescenza in cellule reporter sincronizzate utilizzando un'apparecchiatura di registrazione adeguata.

In definitiva, la registrazione della bioluminescenza viene utilizzata per dimostrare ritmi circadiani autonomi a livello cellulare. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la trasfezione transitoria e la protezione della linea germinale, è che l'integrazione avviene mediante VIR. Il gene garantisce un'integrazione stabile nel genoma cellulare, oltre a una maggiore efficienza e versatilità.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sugli orologi circadiani. Ad esempio, esistono orologi circadiani specifici dei tessuti? In caso affermativo, quali sono le proprietà degli orologi circadiani specifici dei tessuti?

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui meccanismi dell'orologio biologico, può essere applicato anche ad altri sistemi, come la dinamica del ciclo cellulare, la tumorigenesi, ecc. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo deciso di studiare orologi biologici specifici per tessuti o tipi cellulari.

La procedura sarà dimostrata dal Dott. Chita Norm Napkin, ricercatore postdottorato, e da Sandra, studentessa laureanda del mio laboratorio Atory. Generalmente, un costrutto reporter del ritmo circadiano nei mammiferi contiene una cassetta di espressione in cui un promotore circadiano è fuso al gene della luciferasi. In questo reporter lentivirale, la luciferasi destabilizzata è sotto il controllo del promotore del gene del topo per due.

Per istruzioni dettagliate sulla costruzione di vettori reporter mediante reazione di ricombinazione, consultare il manoscritto allegato per una trasfezione efficiente. Iniziare con una coltura di cellule renali embrionali umane a basso numero di passaggi, che siano confluenti al 90-100%. Ora procedere al rivestimento di piastre a sei pozzetti.

Per la trasfezione, aggiungere un millilitro di poli-L-lisina allo 0,001% in ciascun pozzetto, incubare a temperatura ambiente per 20 minuti e risciacquare una volta con PBS. Successivamente, raccogliere le cellule utilizzando la tripsina e seminare le cellule in ciascun pozzetto delle piastre pre-ricoperte. Agitare delicatamente le piastre per ottenere una distribuzione uniforme delle cellule.

Verificare che le cellule seminate abbiano raggiunto una confluenza dell'80-90% in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Preparare la miscela di trasfezione del plasmide contenente un plasmide reporter lentivirale, DNA e i tre vettori di impacchettamento come controllo sia per la trasfezione che per l'infezione successiva. Includere un pozzetto aggiuntivo per un vettore lentivirale di espressione GFP che contiene la proteina verde fluorescente potenziata sotto il controllo del promotore CMV.

Successivamente, aggiungere 100 microlitri di cloruro di calcio 0,25 M ai plasmidi e mescolare accuratamente. Quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione 2 XBBS e mescolare delicatamente ma accuratamente. Incubare il mix di DNA a temperatura ambiente per 15 minuti.

Nel frattempo, sostituire il mezzo delle cellule 293T con due millilitri di mezzo fresco. Rimettere la piastra nell'incubatrice per almeno 10 minuti per equilibrare il pH del mezzo. Successivamente, aggiungere goccia a goccia il mix di trasfezione alle cellule, agitare delicatamente la piastra, osservare la formazione di particelle al microscopio e quindi collocare le cellule nell'incubatrice per tutta la notte.

Circa 16 ore dopo la trasfezione, rinnovare il mezzo con due millilitri di DMEM fresco e coltivare durante la notte. Successivamente, per valutare l'efficienza di trasfezione, analizzare l'espressione di EGFP nelle cellule di controllo della trasfezione. Un'efficienza di trasfezione del 90-100% con elevata espressione di EGFP rappresenta un indicatore affidabile di una buona preparazione virale.

Raccogliere il mezzo contenente le particelle virali infettive secrete, centrifugare per rimuovere le cellule 293T residue e raccogliere il sopranatante contenente il virus. Al terzo giorno, seminare circa 12.000 cellule 293T in una piastra a 12 pozzetti, coltivarle durante la notte fino a raggiungere una confluenza del 20-30% e osservare le cellule al quarto giorno. Sempre al quarto giorno, aggiungere polibrene al mezzo raccolto contenente le particelle virali e mescolare accuratamente mediante pipettaggio.

Ora aspirare il mezzo dai tre T tre e aggiungere un millilitro di miscela virale per pozzetto. Dopo aver lavato le cellule una volta con PBS, incubare a 37 gradi Celsius durante la notte, rinnovare il mezzo e incubare le cellule a 37 gradi Celsius durante la notte per il recupero e la crescita. Quando le cellule sono confluenti, suddividerle e coltivarle durante la notte il giorno successivo.

Per iniziare la selezione delle cellule infette, aggiungere mezzo fresco contenente 10 microgrammi per millilitro. La concentrazione di blastico acido necessaria per uccidere le cellule deve essere determinata empiricamente per ciascuna linea cellulare. Rinnovare il mezzo contenente blastico ogni due o tre giorni per la selezione continua delle cellule resistenti all'antibiotico.

Espressione dei reporter dell'orologio biologico. Dopo aver coltivato le cellule resistenti al blastin in piatti da 35 millimetri fino a confluenza, di solito prepariamo tre o più piatti per ciascuna linea cellulare reporter in ogni condizione per il fenotipo sarcy. Dopo un lavaggio con PBS, aggiungere DMEM contenente 10 micromolar forline o 200 nanomolar dexamethasone e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora per sincronizzare le cellule.

Ora posizionare le cellule in un mezzo di registrazione appena preparato. Coprire le piastre di coltura con coprivetri sterili da 40 millimetri e sigillarli con grasso da vuoto per prevenire l'evaporazione. Caricare le piastre sul luminometro con ciclo lumous e avviare la bioluminescenza in tempo reale.

Registrazione per la registrazione di 96 piastre vecchie. Con il GSR, utilizzare due dispositivi di registrazione come descritto nel manoscritto allegato. È possibile registrare facilmente il ritmo per cinque fino a sette giorni nel programma di analisi del ciclo luminoso.

Prima si adatta una linea di base ai dati grezzi. Successivamente si utilizzano i dati corretti per la linea di base per effettuare un adattamento a un'onda sinusoidale e determinare i parametri richiesti per i campioni che mostrano ritmi persistenti. Una bontà di adattamento superiore al 90% è facilmente ottenibile grazie all'elevata luminosità transitoria.

Sensore verso l'alto e cambio del mezzo. Di solito escludiamo il primo ciclo di dati dalla nostra analisi per la presentazione dei dati. Tracciare i dati grezzi in funzione del tempo quando necessario.

Tracciare i dati sottratti alla linea di base per confrontare l'ampiezza e la fase sia nella trasfezione transitoria di cellule 2 9 3 T che nell'infezione di linee cellulari. Le immagini fluorescenti delle cellule trasfettate e transdotte che esprimono GFP indicano che il sistema di trasferimento genico mediato da lentivirus è altamente efficiente. Il ciclo di retroazione principale di un orologio circadiano è costituito da fattori trascrizionali che agiscono sugli elementi enhancer circadiani per produrre un'espressione genica ritmica.

Qui, quattro diversi costrutti reporter in cellule T tre producono fasi distinte di espressione del reporter. Fasi intermedie nuove possono essere generate mediante regolazione combinatoria da parte di più elementi circadiani, utilizzando l'abbattimento genico tramite RNAi e composti farmacologicamente attivi. Questo esperimento ha utilizzato il luminometro lum cycle per la registrazione della bioluminescenza di cellule in piatti da 35 millimetri in cellule U2 OS.

Irna è stato utilizzato per evidenziare gli effetti di silenziamento dei geni cry one e cry two. Qui è stato utilizzato un luminometro Synergy per la registrazione della bioluminescenza delle cellule in una piastra a 96 pozzetti contenente cellule reporter T three.

Gli RNA sono stati utilizzati per valutare gli effetti dell'abbattimento tripartito sui ritmi cellulari. In questo esempio, il sistema UX e un luminometro TECAN sono stati utilizzati per la registrazione della bioluminescenza delle cellule in 3 piastre da 84. Mentre vengono selezionate le piastre indicate, piccole molecole possono farmacologicamente bersagliare e alterare la funzione proteica nei ritmi cellulari delle cellule reporter U2 OS.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada alla ricerca nel campo della biologia circadiana per esplorare i meccanismi dell'orologio biologico e la fisiologia in diversi tipi cellulari e tessutali. Dopo aver guardato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come generare linee cellulari reporter di Lucifer e monitorare i ritmi circadiani.

E non dimenticare che lavorare con il VIR può essere estremamente pericoloso, e le precauzioni, come la protezione personale e la decontaminazione virale, devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.