Misura flessibile dei reporter bioluminescenti utilizzando un automatizzato Luciferase longitudinale Imaging ottimizzato di Gas e temperatura registratore (ALLIGATOR)

L'obiettivo generale di questo sistema è quello di consentire una facile osservazione di reporter bioluminescenti in un'ampia gamma di condizioni extracellulari, compresa la costante perfusione dei media. Questo metodo può essere utilizzato per osservare la bioluminescenza longitudinalmente da cellule e tessuti in coltura. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la registrazione da cellule in condizioni variabili di mezzi extracellulari e gas, cosa che non è possibile nella maggior parte dei sistemi esistenti.

Sebbene qui dimostriamo questa tecnica nel contesto di esperimenti sul ritmo circadiano, potrebbe essere facilmente applicata ad altri sistemi che richiedono la bioluminescenza o la registrazione fluorescente su scale temporali da giorni a settimane. Per iniziare la procedura, seminare le cellule coltivate su piastre o piastre per colture tissutali. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius fino a quando i monostrati non hanno raggiunto il 100% di confluenza.

Immediatamente prima dell'esperimento, utilizzare un'incubatrice ciclica controllata da computer per alternare tra 32 e 37 gradi Celsius ogni 12 ore per un minimo di 72 ore per sincronizzare i ritmi cellulari. Una robusta sincronizzazione delle oscillazioni circadiane cellulari sia all'interno che tra le colture è fondamentale per la riproducibilità sperimentale. Raggiungiamo questo obiettivo applicando cicli di temperatura giornalieri prima di ogni registrazione che sincronizzano le cellule imitando i ritmi della temperatura corporea.

In alternativa, anche la sincronizzazione farmacologica può essere molto efficace. Successivamente, combina 8,3 grammi di polvere di DMEM ad alto contenuto di glucosio con 900 millilitri di acqua ultrapura. Mescolare la soluzione per 30 minuti per sciogliere completamente la polvere.

Quindi, aggiungere alla soluzione 50 millilitri di soluzione di glucosio da 100 grammi per litro, 20 millilitri di una soluzione di pH 7,6, una soluzione molare di MOPS e 10 millilitri di soluzione di penicillina streptomicina 100 volte. Mescolate il composto per 10 minuti. Quindi, aggiungi 4,7 millilitri di una soluzione di bicarbonato di sodio al 7,5% e mescola la miscela per altri cinque minuti.

Utilizzare acido cloridrico o idrossido di sodio per regolare il pH a 7,6 a temperatura ambiente. Aggiungere acqua ultrapura alla soluzione per ottenere un volume finale di un litro. Filtrare la soluzione attraverso un filtro sterile da 0,22 micrometri in un matraccio sterile.

Conservare il brodo filtrato a quattro gradi Celsius. Immediatamente prima di eseguire l'esperimento, integrare la quantità desiderata di terreno madre con il 10% di siero, due millimolari di GlutaMAX, il 2% di NS21 e un millimolare di luciferina. Passare il mezzo di lavoro risultante attraverso un filtro sterile da 0,22 micrometri.

Utilizzare una soluzione di cinque molari di cloruro di sodio per regolare l'osmolalità del mezzo di lavoro a 350 milliosmoli. Quindi, scaldare il mezzo a 37 gradi Celsius a bagnomaria. Quindi, per iniziare a mettere a fuoco la telecamera dell'incubatore a bioluminescenza, svitare il filtro a densità neutra riscaldato impermeabile all'acqua.

Nel software dello strumento, impostare il tempo di esposizione su 0,2 secondi e il tempo del ciclo cinetico su 0,3 secondi. Verificare che il guadagno di moltiplicazione degli elettroni sia disattivato, quindi chiudere la finestra di configurazione e avviare la registrazione video. Utilizzare il cilindro di messa a fuoco per ruotare l'obiettivo della fotocamera fino a quando gli elementi di prova sullo scaffale dei campioni appropriato non sono chiaramente a fuoco.

Quindi, interrompi la registrazione video. Sostituire il filtro a densità neutra e rimuovere gli elementi di prova. Quindi, utilizzare il pannello di controllo sulla parte anteriore dell'incubatore a bioluminescenza per impostare i livelli di ossigeno, anidride carbonica e temperatura desiderati per l'esperimento.

Per un esperimento umidificato, riempire la vaschetta dell'acqua alla base dell'incubatrice. Rimuovere le cellule dall'incubatore per colture tissutali e sostituire il terreno di coltura con il terreno di lavoro preriscaldato. Per esperimenti umidificati che utilizzano piccoli volumi, sigillare le piastre con pellicola o nastro permeabile ai gas.

Posizionare le piastre nell'incubatore bioluminescente. Chiudere l'incubatrice e fissare il coperchio dello sportello per escludere la luce dal sistema. Quindi, nel software dello strumento, impostare la modalità di acquisizione su cinetica.

Impostare il tempo di esposizione desiderato. Impostare gli accumuli su uno, la lunghezza della serie cinetica sul numero desiderato di cicli di acquisizione e il tempo del ciclo cinetico sull'intervallo di imaging desiderato. Imposta una velocità di cambiata di 4,33 microsecondi, un guadagno di uno e un guadagno EM del livello desiderato.

Quindi, imposta il tipo di file di salvataggio automatico su sif o tiff. Assegna un nome al file di salvataggio automatico e imposta il relativo percorso. Impostare il tipo di file di spooling su sif o tiff.

Assegna un nome allo stack di file e imposta il percorso del file. Chiudere la finestra di configurazione e avviare la registrazione dei dati. Una volta terminata la raccolta dei dati, importare lo stack di immagini acquisite nel software di elaborazione delle immagini.

Regola la luminosità e il contrasto per una visione ottimale della bioluminescenza. Quindi, selezionare le regioni di interesse ed esportare il segnale medio per le aree selezionate. Copiare i dati nel software di analisi per un'ulteriore elaborazione.

Per iniziare l'esperimento, seminare le celle su vetrini a canale singolo con connettori Luer e una profondità del canale di 0,6 o 0,8 millimetri. Coltura e trascinamento delle cellule. Preparare e riscaldare il mezzo di perfusione DMEM a basso contenuto di glucosio tamponato con carbonato di idrogeno.

Quindi, taglia cinque sezioni di due centimetri di tubo in silicone con un diametro interno di un millimetro. Tagliare 1,2 metri, 10 centimetri e 30 centimetri di tubi in etilene tetrafluoroetilene con diametro interno di un millimetro. Sterilizzare il tubo con etanolo al 70% e lavare il tubo con PBS sterile.

Utilizzare il tubo in silicone sterilizzato per collegare il tubo in ETFE da 1,2 metri a un connettore Luer femmina sterile e a un connettore Luer a gomito sterile. Utilizzare questo gruppo per collegare la siringa del mezzo di perfusione a un vetrino vuoto del canale Luer. Quindi, sostituire il terreno di coltura cellulare con un terreno di perfusione preriscaldato.

Riempire una siringa sterile da 20 millilitri con terreno di perfusione preriscaldato. Montare il tubo in ETFE da 10 centimetri con connettori Luer utilizzando il tubo in silicone e collegare il tubo alla slitta. Lavare da tre a cinque millilitri di mezzo di perfusione attraverso il tubo e il vetrino del canale.

Quindi, montare il tubo in ETFE da 30 centimetri sul vetrino del canale contenente le celle. Collegare l'estremità libera del tubo in ETFE da 10 centimetri all'altra estremità del vetrino del canale cellulare per formare il sistema di perfusione completo. Sciacquare un millilitro di mezzo di perfusione attraverso il tubo e i vetrini per escludere le bolle d'aria.

Trasportare il sistema di perfusione all'incubatore a bioluminescenza. Fissare la siringa riempita di mezzo di perfusione in una pompa a siringa facendo attenzione a non scollegare il tubo. Utilizzare la pompa a siringa per lavare un millilitro di mezzo di perfusione attraverso il sistema di perfusione.

Inserire il diametro della siringa sulla pompa e impostare la portata a 50 microlitri all'ora. È fondamentale che non ci siano bolle nel sistema di perfusione all'inizio dell'esperimento in quanto queste possono interrompere il segnale di bioluminescenza. Avviare la pompa e chiudere immediatamente lo sportello dell'incubatore a bioluminescenza.

Fissare il coperchio della porta per escludere la luce dal sistema. Acquisire e analizzare i dati come descritto per le colture di tessuti statici. Sei piastre di fibroblasti PER2 LUC sono state trascinate utilizzando cicli di temperatura giornalieri e visualizzate utilizzando un incubatore a bioluminescenza.

Sono state analizzate le immagini provenienti da pozzi selezionati e l'output di bioluminescenza è stato quantificato. Le cellule PER2 LUC sono state anche sottoposte a imaging in condizioni di perfusione per valutare gli effetti di un inibitore della caseina chinasi sull'espressione di PER2 LUC. I risultati sono stati confrontati con cellule trattate con la stessa concentrazione dell'inibitore in condizioni statiche, che hanno rivelato un allungamento del periodo sostanzialmente maggiore in condizioni statiche.

L'entità dell'allungamento del periodo in condizioni di perfusione è risultata vicina a quella osservata in vivo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire esperimenti di bioluminescenza statica e perfusa utilizzando un ALLIGATORE.