Name: Misura flessibile dei reporter bioluminescenti utilizzando un automatizzato Luciferase longitudinale Imaging ottimizzato di Gas e temperatura registratore (ALLIGATOR) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Scopri il sistema ALLIGATOR per l'imaging longitudinale della luciferasi, ideale per monitorare l'espressione genica in modo non invasivo nelle cellule coltivate. Questo metodo automatizzato migliora la riproducibilità sperimentale nei ritmi circadiani.

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Vorremmo ringraziare Cairn ricerca per lavorare con noi per sviluppare questo sistema, in particolare Mark Henson, Jeremy Graham e Joao Correia. Ringraziamo anche David Welsh e Akhilesh Reddy per discussione importante durante la fase di progettazione, così come Peter Laskey (precedentemente di Hamamatsu) per organizzare il prestito di una macchina fotografica demo e David Wong per il suo contributo critico al manoscritto.

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<li>Balsalobre, A., Marcacci, L., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+signaling+pathways+elicit+circadian+gene+expression+in+cultured+Rat-1+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol.+CB%22%5BJournal%5D)">Multiple signaling pathways elicit circadian gene expression in cultured Rat-1 fibroblasts.</a> Curr. Biol. CB. 10 (20), 1291-1294 (2000).</li>
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<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hirota, T., Lewis, W. G., Liu, A. C., Lee, J. W., Schultz, P. G., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+biology+approach+reveals+period+shortening+of+the+mammalian+circadian+clock+by+specific+inhibition+of+GSK-3beta%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (52), 20746-20751 (2008).</li>
<li>Meng, Q., Maywood, E. S., Bechtold, D. A., Lu, W., Li, J., Gibbs, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrainment+of+disrupted+circadian+behavior+through+inhibition+of+casein+kinase+1+%28+CK1+%29+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Entrainment of disrupted circadian behavior through inhibition of casein kinase 1 ( CK1 ) enzymes.</a> Proc Natl Acad Sci. 1, 1-6 (2010).</li>
<li>Khabirova, E., Chen, K. -F., O'Neill, J. S., Crowther, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flyglow%3A+Single-fly+observations+of+simultaneous+molecular+and+behavioural+circadian+oscillations+in+controls+and+an+Alzheimer%27s+model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Flyglow: Single-fly observations of simultaneous molecular and behavioural circadian oscillations in controls and an Alzheimer's model.</a> Sci. Rep. 6, 33759(2016).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi esiste.

Il protocollo descritto qui è per la coltura di cellule di mammifero, sia in condizioni statiche e irrorate. Tuttavia, il coccodrillo può essere facilmente adattato ad altri sistemi di modello. Infatti, già ha dimostrato di fornire una piattaforma eccellente per il monitoraggio simultaneo di locomozione, sonno e ritmi di espressione di gene periferico in Drosophila melanogaster mantenuto sotto costante oscurità15. Si è anche notato che, a seconda dell'applicazione, tipi di fotocamera diverso da quello indicato qui possono essere appropriati. Prevediamo che con i filtri appropriati, una versione modificata del programma di installazione corrente potrebbe in linea di principio essere usata per la quantificazione di fluorescenza.
Le uniche applicazioni per le quali l'alligatore potrebbe non essere appropriato sono quelli per cui è richiesta, come l'imaging dell'organizzazione spazio-temporale dell'espressione PER2::LUC a fette organotypic della cellula umana particolarmente elevata risoluzione spaziale nucleo soprachiasmatico, o altre fettine di tessuto piccolo.
L'alligatore consente molti esperimenti da eseguire che finora non sono state prontamente realizzabili dalle tecniche di registrazione convenzionali. Rispetto agli attuali metodi per la misurazione della bioluminescenza, l'alligatore fornisce una maggiore flessibilità in sia il tipo di piastra di coltura delle cellule o diapositiva che può essere utilizzato, le condizioni di supporti esterni, sensibilità e processivity.
Ciò è particolarmente rilevante in un momento quando c'è un allontanamento da modelli della coltura cellulare 2D standard verso sistemi di coltura organoid e flusso 3D. Come tale, si prevede che l'alligatore fornirà un metodo adattabile che può essere misurata bioluminescenza sopra molti giorni e settimane nell'ambito di una vasta gamma di condizioni.

L'uso della luciferasi come reporter di espressione genica e attività della proteina è diventata una tecnica popolare nella ricerca di biologia molecolare e cellulare. Questo è vero nel campo circadiano, dove la cinetica di firefly luciferase sintesi e inattivazione catalitico sono particolarmente adatti alla segnalazione i longitudinali cambiamenti nell'espressione genica che si presentano durante il ciclo circadiano h circa 24. Come tale, luciferasi sono impiegato come un reporter circadiano attraverso una vasta gamma di organismi, tra cui funghi, piante, mosche e mammiferi1,2,3,4.
Nel quantificare gene circadiano espressione in vitro, un fotomoltiplicatore (PMT) è comunemente utilizzato per registrare il segnale bioluminescente. Le misure basate su PMT hanno limitata flessibilità tuttavia, essendo di solito limitato a una dimensione predeterminata di vassoio o piatto. Inoltre, non è possibile raccogliere tutte le informazioni spaziali di campioni monitorati utilizzando un PMT, che può portare a una perdita di informazioni quando i campioni che mostrano la variazione spaziale nell'espressione di luciferase di imaging. Inoltre, come la PMT ed elettronica associata è inclini a malfunzionamenti quando esposta all'ambiente umidificato di un'incubatrice di cultura cellulare standard, registrazione longitudinale luciferasi utilizzando PMTs viene sempre eseguita in incubatrice non umidificati. Di conseguenza, piastre di coltura delle cellule devono essere sigillati ermeticamente per evitare la perdita di umidità attraverso evaporazione e terreni di coltura devono pertanto essere memorizzati nel buffer con 3-(N- morfolino) acido propansulfonico (MOPS) o 4-(2-idrossietil) -1- acido piperazineethanesulfonic (HEPES), piuttosto che la CO2/bicarbonate sistema che funzioni in vivo ed è usato ordinariamente nella coltura del tessuto dei mammiferi di buffering.
A causa di queste limitazioni, misurazione della bioluminescenza di PMTs posti solitamente severe restrizioni alle condizioni in cui le cellule sono mantenute durante gli esperimenti. Per superare questi problemi e anche per aumentare la gamma delle possibili condizioni sperimentali, usiamo un CO2/n2 170 L coltura tissutale incubatore standard che è stato adattato con l'aggiunta di acqua refrigerata elettrone-moltiplicatore charge coupled device (EMCCD) fotocamera con ottica anti-appannamento e controllo digitale dei livelli di temperatura e di gas. Questo è stato soprannominato un automatico longitudinale Luciferase Imaging Gas e Temperature-Optimized registratore o alligatore. L'alligatore consente flessibilità sostanzialmente aumentata di imaging bioluminescenti, entrambi per l'imaging di alto-rendimento delle piastre di coltura del tessuto standard (fino a 6 x 96 o 384 pozzetti piastre contemporaneamente) e anche per i sistemi di coltura del tessuto non standard, tali come irrorate cellule cresciute in dispositivi microfluidici. Questo strumento consente inoltre di imaging per verificarsi condizioni umidificata e con controllo variabile di CO2 e pressione parziale di O2 sia temperatura.
Il protocollo sottostante descrive un metodo per la registrazione bioluminescente della cellula di mammiferi e sistemi di coltura del tessuto usando un alligatore (d'ora in poi denominato 'incubatore di bioluminescenza'). Dovrebbe essere notato, tuttavia, che il sistema sarebbe ben si adatta all'imaging bioluminescenti e anche, con alcune modifiche, fluorescente di imaging, in un certo numero di altri sistemi biologici e contesti.

<table><tbody><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone FetalClone III Siero</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30109.03</td><td></td></tr><tr><td>Terreno neurobasale</td><td>Thermofisher</td><td>21103049</td><td>basale</td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina</td><td>Sigma</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>Catalasi</td><td>Sigma</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>Glutatione</td><td>Sigma</td><td>G6013</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I1882</td><td></td></tr><tr><td>Superossido Dismutasi</td><td>Sigma</td><td>S5395</td><td></td></tr><tr><td>Olo-transferrina</td><td>Calbiochem</td><td>616424</td><td></td></tr><tr><td>T3 (triiodo-L-tironina</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>L-Carnitina</td><td>Sigma</td><td>C7518</td><td></td></tr><tr><td>Etanolammina</td><td>Sigma</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>D (+)-Galattosio</td><td>Sigma</td><td>G0625</td><td></td></tr><tr><td>Putrescina</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Selenito di sodio</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>Corticosterone</td><td>Sigma</td><td>C2505</td><td></td></tr><tr><td>Acido linoleico</td><td>Sigma</td><td>L1012</td><td></td></tr><tr><td>Acido linolenico</td><td>Sigma</td><td>L2376</td><td></td></tr><tr><td>Acido lipoico</td><td>Sigma</td><td>T1395</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di retinolo</td><td>Sigma</td><td>R7882</td><td></td></tr><tr><td>Retinolo, tutti trans</td><td>Sigma</td><td>95144</td><td></td></tr><tr><td>D, L-alfa-tocoferolo</td><td>Sigma</td><td>95240</td><td></td></tr><tr><td>D, L-alfa-tocoferolo acetato</td><td>Sigma</td><td>T3001</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di bicarbonato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S8761-100ML</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Galaxy 170R incubatore&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>CO17301001</td><td></td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Biosynth</td><td>L-8220</td><td></td></tr><tr><td>D -(+)-Soluzione di glucosio</td><td>Sigma</td><td>G8644-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM in polvere</td><td>Sigma</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>PHG0007</td><td></td></tr><tr><td>1 mm ID tubo in silicone&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>19-4692-01</td><td></td></tr><tr><td>Connettore luer a gomito</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>Raccordi luer maschio</td><td>Ibidi</td><td>10826</td><td></td></tr><tr><td>Raccordi luer femmina</td><td>Ibidi</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-slide luer I 0.6</td><td>Ibidi</td><td>80196</td><td></td></tr><tr><td>BD plastipak 20ml siringa</td><td>Becton Dickinson</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>1mm Tubo I.D. ETFE GE</td><td>Healthcare</td><td>18-1142-38</td><td></td></tr><tr><td>PF670462</td><td>Sigma</td><td>SML0795</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplemento (50x)</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra EMCCD camera</td><td>Andor</td><td>iXon 888</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Prism 7.0</td><td>Graphpad Software</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blu</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Deltaphase Isothermal Pad</td><td>Braintree Scientific</td><td>39DP</td><td></td></tr><tr><td>Filtro a densità neutra riscaldata&nbsp;</td><td>Cairn Research</td><td>Articolo</td><td></td>personalizzato</tr><tr><td>Osmomat 030</td><td>Gonotech</td><td>Fuori produzione</td><td></td></tr><tr><td>300 mOsmol/kg standard</td><td>di calibrazione Gonotech</td><td>30.9.0020</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente di misura</td><td>Gonotech</td><td>30.9.0010</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro di messa a fuoco</td><td>Cairn Research</td><td>Articolo</td><td></td>personalizzato</tr><tr><td>NE-1600 pompa a siringa programmabile</td><td>Pump Systems inc. </td><td>NE-1600</td><td></td></tr><tr><td>Andor Solis Software</td><td>Andor</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

misura flessibile dei reporter bioluminescenti utilizzando un automatizzato luciferase longitudinale imaging ottimizzato di gas e temperatura registratore (alligator)

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Basato su luciferase reporter dell'espressione genica cellulare sono nell'uso molto diffuso per entrambi longitudinale ed End-Point saggi di attività biologica. Nella ricerca di ritmi circadiani, ad esempio, fusioni del gene dell'orologio con luciferasi firefly danno luogo a ritmi robusti in bioluminescenza cellulare che persistono per molti giorni. Limiti tecnici associati con tubi di fotomoltiplicatore (PMT) o metodi basati su microscopia convenzionali per la quantificazione di bioluminescenza in genere hanno richiesto che cellule e tessuti essere mantenuto in condizioni abbastanza non-fisiologica durante registrazione, con un compromesso tra sensibilità e velocità effettiva. Qui, segnaliamo un affinamento dei metodi precedenti che permette la formazione immagine a lungo termine bioluminescenza con alta sensibilità e velocità effettiva che supporta una vasta gamma di condizioni di coltura, tra cui gas variabile e controllo di umidità, e che accetta molti differenti piatti e piastre di coltura del tessuto. Questo luciferasi longitudinale automatizzati formazione immagine ottimizzata di gas e temperatura registratore (ALLIGATOR) inoltre permette l'osservazione delle variazioni spaziali nell'espressione di luciferase attraverso un monostrato di cellule o tessuto, che non può essere osservato facilmente dal tradizionale metodi. Si evidenzia come l'alligatore fornisce molto maggiore flessibilità per la rilevazione di attività luciferasica se confrontato con i metodi esistenti.

Questo articolo descrive un protocollo per l'imaging bioluminescente di cellule di mammifero usando un alligatore (incubatore di bioluminescenza). Questa tecnica consente flessibilità di configurazione fisica e condizioni extracellulari quando bioluminescenti sistemi di imaging. Vengono descritti metodi per coltura del tessuto statico semplice (Figura 1, complementare Video 1) e la coltura cellulare irrorato (Figura 2, complementare Video 2), ma molte altre configurazioni potrebbero essere imaged usando questo sistema. Tutti i dati sono stati quantificati utilizzando i metodi descritti nella sezione 7.
Figura 1A Mostra un esempio dei video di una registrazione da 6 x 96 pozzetti piastre contenenti PER2::LUC fibroblasti4di bioluminescenza. I pozzi più esterno non contengono cellule come questi non sono stati richiesti per questo esperimento. Le cellule hanno subito trascinamenti di temperatura differenziale, per cui subiscono sia ciclo di temperatura di 12 h, a 32 ° C, seguita da 12 h 37 ° C per 72 h o il contrario (12 ore, a 37 ° C, seguita da 12 ore, a 32 ° C per 72 h), prima che si terrà a costante di 37 ° C per la registrazione. 60 min esposizioni sono state scattate ogni ora. Due di queste condizioni sono quantificati in Figura 1B.
La Figura 2A Mostra un disegno schematico dell'installazione di un sistema di coltura del tessuto irrorato. Si tratta di due scivoli di canale collegati con la tubazione. Media è guidato attraverso le cellule da una pompa a siringa. La prima di queste diapositive agisce come una trappola di gas permeabile bolla (diapositiva buffer) e non contiene nessun cellule, con il secondo contenente le celle da cui è registrata la bioluminescenza. Un rappresentante di registrazione video da questo sistema è illustrato nella Figura 2B. 15 min esposizioni sono state scattate ogni 15 min. Qui, le cellule sono mantenute in condizioni standard di aspersione o in presenza di inibitore di caseina chinasi PF670462, che precedentemente è stato indicato per allungare il periodo circadiano e ridurre l'ampiezza dei ritmi di espressione genica orologio in coltura cellule di mammifero14. L'effetto sull'espressione di PER2::LUC è mostrato in Figura 2 (pannello superiore) contro le cellule trattate con la stessa concentrazione di farmaco in condizioni di coltura cella statica standard illustrato nella Figura 2 (pannello inferiore), con quantificazione del periodo mostrato in Figura 2D. È chiaro da questo che il trattamento con PF670462 influenza l'espressione di PER2::LUC sotto entrambi gli insiemi di condizioni. Tuttavia, mentre le cellule trattate con PF670462 sotto condizioni irrorate Visualizza periodo allungamento di circa 3 h (3 h di ±0.9), le cellule in condizioni statiche, trattate con il farmaco mostrano allungamento periodo sostanzialmente maggiore per un periodo di &gt; 48 h. Questo può essere in forma per un coseno smorzato, come descritto nella sezione 7, (extra-somma dei quadrati F prova contro una linea retta, p &lt; 0,0001). È interessante notare che, la grandezza del periodo allungamento sotto perfusione è molto più vicina a quella osservata in vivo14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2.jpg"> 
Figura 1: esempio di dati. (A) esempio istantanea video di bioluminescenza da PER2::LUC immortalata in 6 x 96 pozzetti nell'incubatrice bioluminescenza. Pozzi per essere quantificati sono stati evidenziati in giallo nel supplementare Video 1. (B) quantificazione della bioluminescenza A. Due set di 3 piastre delle cellule erano trascinato utilizzando cicli di temperatura (12 h, a 32 ° C; 12 ore a 37° C) che erano anti-fasiche a vicenda per produrre fronte fasi dell'espressione della proteina PER2 (n = 6, media ± SEM). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2.jpg"> 
Figura 2: aspersione con inibitori di CK1δ. (A) schema del sistema di perfusione. (B) esempio istantanea video di una registrazione da PER2::LUC di bioluminescenza cellule sotto perfusione. Un'area campione di quantificazione è evidenziata in giallo. (C) quantificazione della bioluminescenza dei fibroblasti PER2::LUC sotto l'aspersione e in condizioni statiche con e senza inibitore di 3 µM CK1 PF670462 (n = 3, media ± SEM). Bioluminescenza è stata normalizzata a valori minimi e massimi. (D) analisi del periodo (Two-way ANOVA, test comparazioni multiple di Holm-Sidak).<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>Concentrazione media finale (μM)</td>
			<td>Stock (mg/mL)</td>
			<td>Per NS21 400 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumina bovina</td>
			<td>37</td>
			<td>-</td>
			<td>50 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalasi</td>
			<td>0,01</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutatione</td>
			<td>3.2</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulina</td>
			<td>0.6</td>
			<td>10</td>
			<td>8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superossido dismutasi</td>
			<td>0,077</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-transferrina</td>
			<td>0,062</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (triiodo-L-tironina)</td>
			<td>0,0026</td>
			<td>2</td>
			<td>20 Μ l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-carnitina</td>
			<td>12</td>
			<td>-</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etanolammina</td>
			<td>16</td>
			<td>Liquido (1 g/ml)</td>
			<td>20 Μ l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D (+)-galattosio</td>
			<td>83</td>
			<td>-</td>
			<td>300 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescina</td>
			<td>183</td>
			<td>-</td>
			<td>322 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenito di sodio</td>
			<td>0,083</td>
			<td>1</td>
			<td>280 Μ l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>0,058</td>
			<td>2</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acido linoleico</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acido linolenico</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acido lipoico</td>
			<td>0.2</td>
			<td>4.7</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>0,02</td>
			<td>3.2</td>
			<td>0,04 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinolo acetato</td>
			<td>0.2</td>
			<td>20</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinolo, tutti trans</td>
			<td>0.3</td>
			<td>10</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S, L-alfa-tocoferolo</td>
			<td>2.3</td>
			<td>100</td>
			<td>0. 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S, L-alfa-tocoferolo acetato</td>
			<td>2.1</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: NS21 preparazione.
Complementare 1 Video: video di esempio di bioluminescenza da piatti ben. Istantanea video esempio di bioluminescenza da PER2::LUC immortalata in 6 x 96 pozzetti nell'incubatrice bioluminescenza. Pozzi da quantificare sono evidenziati in giallo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_1A_Revision-1.avi">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Supplementare Video 2: l'istantanea video esempio di una registrazione da PER2::LUC di bioluminescenza cellule sotto aspersione. Un'area campione di quantificazione è evidenziata in giallo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_2B_Revision-1.avi">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

Luciferasi codificato geneticamente sono un popolare reporter non invasiva dell'espressione genica. Utilizzo di un automatizzato luciferasi longitudinale imaging ottimizzato di gas e temperatura registratore (ALLIGATOR) consente la registrazione longitudinale da cellule bioluminescenti nell'ambito di una vasta gamma di condizioni. Qui vi mostriamo come alligatore possono essere utilizzati nel contesto della ricerca di ritmi circadiani.

Misura flessibile dei reporter bioluminescenti utilizzando un automatizzato Luciferase longitudinale Imaging ottimizzato di Gas e temperatura registratore (ALLIGATOR)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

L'obiettivo generale di questo sistema è quello di consentire una facile osservazione di reporter bioluminescenti in un'ampia gamma di condizioni extracellulari, compresa la costante perfusione dei media. Questo metodo può essere utilizzato per osservare la bioluminescenza longitudinalmente da cellule e tessuti in coltura. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la registrazione da cellule in condizioni variabili di mezzi extracellulari e gas, cosa che non è possibile nella maggior parte dei sistemi esistenti.Sebbene qui dimostriamo questa tecnica nel contesto di esperimenti sul ritmo circadiano, potrebbe essere facilmente applicata ad altri sistemi che richiedono la bioluminescenza o la registrazione fluorescente su scale temporali da giorni a settimane. Per iniziare la procedura, seminare le cellule coltivate su piastre o piastre per colture tissutali. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius fino a quando i monostrati non hanno raggiunto il 100% di confluenza.Immediatamente prima dell'esperimento, utilizzare un'incubatrice ciclica controllata da computer per alternare tra 32 e 37 gradi Celsius ogni 12 ore per un minimo di 72 ore per sincronizzare i ritmi cellulari. Una robusta sincronizzazione delle oscillazioni circadiane cellulari sia all'interno che tra le colture è fondamentale per la riproducibilità sperimentale. Raggiungiamo questo obiettivo applicando cicli di temperatura giornalieri prima di ogni registrazione che sincronizzano le cellule imitando i ritmi della temperatura corporea.In alternativa, anche la sincronizzazione farmacologica può essere molto efficace. Successivamente, combina 8,3 grammi di polvere di DMEM ad alto contenuto di glucosio con 900 millilitri di acqua ultrapura. Mescolare la soluzione per 30 minuti per sciogliere completamente la polvere.Quindi, aggiungere alla soluzione 50 millilitri di soluzione di glucosio da 100 grammi per litro, 20 millilitri di una soluzione di pH 7,6, una soluzione molare di MOPS e 10 millilitri di soluzione di penicillina streptomicina 100 volte. Mescolate il composto per 10 minuti. Quindi, aggiungi 4,7 millilitri di una soluzione di bicarbonato di sodio al 7,5% e mescola la miscela per altri cinque minuti.Utilizzare acido cloridrico o idrossido di sodio per regolare il pH a 7,6 a temperatura ambiente. Aggiungere acqua ultrapura alla soluzione per ottenere un volume finale di un litro. Filtrare la soluzione attraverso un filtro sterile da 0,22 micrometri in un matraccio sterile.Conservare il brodo filtrato a quattro gradi Celsius. Immediatamente prima di eseguire l'esperimento, integrare la quantità desiderata di terreno madre con il 10% di siero, due millimolari di GlutaMAX, il 2% di NS21 e un millimolare di luciferina. Passare il mezzo di lavoro risultante attraverso un filtro sterile da 0,22 micrometri.Utilizzare una soluzione di cinque molari di cloruro di sodio per regolare l'osmolalità del mezzo di lavoro a 350 milliosmoli. Quindi, scaldare il mezzo a 37 gradi Celsius a bagnomaria. Quindi, per iniziare a mettere a fuoco la telecamera dell'incubatore a bioluminescenza, svitare il filtro a densità neutra riscaldato impermeabile all'acqua.Nel software dello strumento, impostare il tempo di esposizione su 0,2 secondi e il tempo del ciclo cinetico su 0,3 secondi. Verificare che il guadagno di moltiplicazione degli elettroni sia disattivato, quindi chiudere la finestra di configurazione e avviare la registrazione video. Utilizzare il cilindro di messa a fuoco per ruotare l'obiettivo della fotocamera fino a quando gli elementi di prova sullo scaffale dei campioni appropriato non sono chiaramente a fuoco.Quindi, interrompi la registrazione video. Sostituire il filtro a densità neutra e rimuovere gli elementi di prova. Quindi, utilizzare il pannello di controllo sulla parte anteriore dell'incubatore a bioluminescenza per impostare i livelli di ossigeno, anidride carbonica e temperatura desiderati per l'esperimento.Per un esperimento umidificato, riempire la vaschetta dell'acqua alla base dell'incubatrice. Rimuovere le cellule dall'incubatore per colture tissutali e sostituire il terreno di coltura con il terreno di lavoro preriscaldato. Per esperimenti umidificati che utilizzano piccoli volumi, sigillare le piastre con pellicola o nastro permeabile ai gas.Posizionare le piastre nell'incubatore bioluminescente. Chiudere l'incubatrice e fissare il coperchio dello sportello per escludere la luce dal sistema. Quindi, nel software dello strumento, impostare la modalità di acquisizione su cinetica.Impostare il tempo di esposizione desiderato. Impostare gli accumuli su uno, la lunghezza della serie cinetica sul numero desiderato di cicli di acquisizione e il tempo del ciclo cinetico sull'intervallo di imaging desiderato. Imposta una velocità di cambiata di 4,33 microsecondi, un guadagno di uno e un guadagno EM del livello desiderato.Quindi, imposta il tipo di file di salvataggio automatico su sif o tiff. Assegna un nome al file di salvataggio automatico e imposta il relativo percorso. Impostare il tipo di file di spooling su sif o tiff.Assegna un nome allo stack di file e imposta il percorso del file. Chiudere la finestra di configurazione e avviare la registrazione dei dati. Una volta terminata la raccolta dei dati, importare lo stack di immagini acquisite nel software di elaborazione delle immagini.Regola la luminosità e il contrasto per una visione ottimale della bioluminescenza. Quindi, selezionare le regioni di interesse ed esportare il segnale medio per le aree selezionate. Copiare i dati nel software di analisi per un'ulteriore elaborazione.Per iniziare l'esperimento, seminare le celle su vetrini a canale singolo con connettori Luer e una profondità del canale di 0,6 o 0,8 millimetri. Coltura e trascinamento delle cellule. Preparare e riscaldare il mezzo di perfusione DMEM a basso contenuto di glucosio tamponato con carbonato di idrogeno.Quindi, taglia cinque sezioni di due centimetri di tubo in silicone con un diametro interno di un millimetro. Tagliare 1,2 metri, 10 centimetri e 30 centimetri di tubi in etilene tetrafluoroetilene con diametro interno di un millimetro. Sterilizzare il tubo con etanolo al 70% e lavare il tubo con PBS sterile.Utilizzare il tubo in silicone sterilizzato per collegare il tubo in ETFE da 1,2 metri a un connettore Luer femmina sterile e a un connettore Luer a gomito sterile. Utilizzare questo gruppo per collegare la siringa del mezzo di perfusione a un vetrino vuoto del canale Luer. Quindi, sostituire il terreno di coltura cellulare con un terreno di perfusione preriscaldato.Riempire una siringa sterile da 20 millilitri con terreno di perfusione preriscaldato. Montare il tubo in ETFE da 10 centimetri con connettori Luer utilizzando il tubo in silicone e collegare il tubo alla slitta. Lavare da tre a cinque millilitri di mezzo di perfusione attraverso il tubo e il vetrino del canale.Quindi, montare il tubo in ETFE da 30 centimetri sul vetrino del canale contenente le celle. Collegare l'estremità libera del tubo in ETFE da 10 centimetri all'altra estremità del vetrino del canale cellulare per formare il sistema di perfusione completo. Sciacquare un millilitro di mezzo di perfusione attraverso il tubo e i vetrini per escludere le bolle d'aria.Trasportare il sistema di perfusione all'incubatore a bioluminescenza. Fissare la siringa riempita di mezzo di perfusione in una pompa a siringa facendo attenzione a non scollegare il tubo. Utilizzare la pompa a siringa per lavare un millilitro di mezzo di perfusione attraverso il sistema di perfusione.Inserire il diametro della siringa sulla pompa e impostare la portata a 50 microlitri all'ora. È fondamentale che non ci siano bolle nel sistema di perfusione all'inizio dell'esperimento in quanto queste possono interrompere il segnale di bioluminescenza. Avviare la pompa e chiudere immediatamente lo sportello dell'incubatore a bioluminescenza.Fissare il coperchio della porta per escludere la luce dal sistema. Acquisire e analizzare i dati come descritto per le colture di tessuti statici. Sei piastre di fibroblasti PER2 LUC sono state trascinate utilizzando cicli di temperatura giornalieri e visualizzate utilizzando un incubatore a bioluminescenza.Sono state analizzate le immagini provenienti da pozzi selezionati e l'output di bioluminescenza è stato quantificato. Le cellule PER2 LUC sono state anche sottoposte a imaging in condizioni di perfusione per valutare gli effetti di un inibitore della caseina chinasi sull'espressione di PER2 LUC. I risultati sono stati confrontati con cellule trattate con la stessa concentrazione dell'inibitore in condizioni statiche, che hanno rivelato un allungamento del periodo sostanzialmente maggiore in condizioni statiche.L'entità dell'allungamento del periodo in condizioni di perfusione è risultata vicina a quella osservata in vivo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire esperimenti di bioluminescenza statica e perfusa utilizzando un ALLIGATORE.

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Misura flessibile dei reporter bioluminescenti utilizzando un automatizzato Luciferase longitudinale Imaging ottimizzato di Gas e temperatura registratore (ALLIGATOR)

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