Name: Un metodo di optogenetica per controllare e analizzare il pattern di espressione genica nelle interazioni della cellula--cellula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Scopri un metodo di optogenetica per controllare e analizzare il trasferimento di informazioni oscillanti tra cellule C2C12. Questa tecnica consente di monitorare la dinamica dell'espressione genica con alta precisione.

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Questo lavoro è stato supportato da JST, PRESTO (A.I.), Core ricerca evolutiva di scienza e tecnologia (JPMJCR12W2 (R.K.)), sovvenzione per la ricerca scientifica in settori innovativi (Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia (MEXT), Giappone 26119708 (A.I.) e 16 H 06480 (R.K.)), scientifico (A) (Giappone società per la promozione della scienza (JSPS) 24240049 (R.K.)), di ricerca e giovani ricercatori (A) (JSPS 15 H 05326 (A.I.)) e una sovvenzione per la ricerca scientifica in settori innovativi "fluorescenza Live imaging"del MEXT, Giappone e piattaforma per approcci dinamici a Living System da MEXT, Giappone.

1. generazione di linee cellulari stabili dal sistema Tol2
<ol><li>
Transfect vettori plasmidici (Figura 1A) di moduli basati su Tol2 optogenetica insieme con il vettore di espressione transposase (Tol2) (pCAGGS-mT2TP) in cellule C2C12. In tutte le fasi, le cellule di cultura con medium DMEM supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) e penicillina-streptomicina a 37 ° C (tabella 1), in presenza di 5% CO2, altrimenti indicato.
	<ol>
<li>Contare tripsinizzate con un contatore di cellule e piastra 5x104 C2C12 cellule per pozzetto in un piatto di 12-pozzetti un giorno prima di transfezione.</li>
		<li>Co-transfect 0,375 μg di vettori basati su Tol2 optogenetica (pAI177 o pAI218), 0,125 μg di un vettore di selezione della droga (pAI170) e 0,5 μg di pCAGGS-mT2TP vettoriale utilizzando lipofezione reagente.</li>
		<li>Tripsinizzano cellule trasfettate e impiattatelo in piastre di coltura di 100 mm, un giorno dopo la trasfezione.</li>
		<li>Cambio di coltura per cellule trasfettate per cultura supplementato con igromicina 100 mg/mL.</li>
		<li>Cellule di coltura per 3 giorni eliminare le cellule non trasfettate. Si noti che il cambiamento medio non è necessaria.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tripsinizzano cellule trasfettate e purificare una popolazione di cellule che esprimono le proteine fluorescenti per la selezione. Per le cellule ricevitore pAI177, impostata il cancello ordinamento canale verde-PE per la purificazione della popolazione delle cellule mCherry-positivi. Per le cellule fotosensibili mittente pAI218, impostata il cancello ordinamento canale APC per la purificazione della popolazione delle cellule iRFP713-positivi.</li>
	<li>(opzionale) Stabilire una popolazione clonale delle cellule con i metodi standard, ad esempio diluizione limitato o singolo-cella ordinamento di FACS.</li>
</ol>2. valutazione della sensibilità della foto di cellule ingegnerizzate a livello della popolazione
Nota: Questa parte descrive un protocollo per controllare la dinamica induzione delle proteine di ligando Dll1 su illuminazione luce blu di saggi biochimici, quali qPCR e Western blotting.
<ol><li>Impostare due tipi di incubatori con o senza fonti di luce per una condizione indotta dalla luce o una condizione di buio, rispettivamente. Set-up luce-intensità di un blu-trans-illuminatore LED, come illustrato nella Figura 1B, utilizzando un misuratore di luce. Gli orari del programma e la durata dell'illuminazione dal caricamento di uno script di controllo a un micro-controller monoscheda che consente orari programmabili per l'illuminazione (Figura 1).</li>
	<li>Conta cellule tripsinizzate con un contatore di cellule e piastra 1.0 x 105 mittente fotosensibile cellule portando pAI218 e pAI170 su piastre di coltura in plastica di diametro 35 mm (più di 12 piatti per condizione di luce e 1 piatto per condizione di buio) e impostare i piatti separare gli incubatori per condizioni di buio/luce. Dopo aver impostato piatti, tenere porte di incubatrici chiuse fino al collezionismo lisati cellulari.</li>
	<li>Giorni di un anno e mezzo dopo il placcaggio, avviare illuminazione luce (cellule dovrebbero essere più di 80% confluenti). Non esporre le cellule alla luce per evitare indesiderata foto-stimolazione. Nota: Gli orari per l'illuminazione dipende dallo scopo di esperimenti. Si noti che una condizione di illuminazione costante (ad es. 1-min intervalli di durata e 10 min con 40 µmol/m2/s-intensità luce) è sufficiente per un semplice controllo della foto-induzione e quel forte illuminazione luce è dannoso per le cellule. Così, di assicurarsi che siano selezionati i parametri innocui per l'illuminazione.</li>
	<li>Circa 2 giorni dopo il placcaggio, preparare delle cellule-lisato con intervalli di 30 min. Spostare assaggiare piatti dalle incubatrici sul ghiaccio e iniziare a preparare i lisati cellulari per ulteriori analisi.</li>
</ol>3. dinamica mittente-destinatario test a livello di popolazione: monitoraggio in tempo reale delle risposte cellulari dopo stimolazione ottica di PMT
<ol><li>Tripsinizzano e contare i numeri del mittente e le cellule del ricevitore con metodi standard. Preparare un volume totale di 1 mL di sospensione di 2,5 x 1,25 x 10 e 104 ricevitore di miscelazione cellule mittente5 (rapporto 1:5). Nota: 2:1, 1:1, o rapporti di 1:2 mittente-destinatario anche lavorano con un numero totale di cellule di 1.5 x 105. 10
</li>
	<li>Piatto miscelati di cellule in tutti i pozzetti di piastre nere 24 pozzetti con mezzo di coltura contenente luciferina di 1 mM.</li>
	<li>Analizzare le cellule il lettore di piastre per l'analisi di luciferase e confermare che i segnali in uscita non sono troppo elevati per il sistema di registrazione. Nota: Se segnali di uscita sono superiori a 1 x 106 fotone conteggi/s, essi possono essere saturo. In tal caso, ridurre la concentrazione di luciferina a valori ottimali in modo che segnali di uscita sono inferiori a 1 x 106 fotone conteggi/s.</li>
	<li>Mettere la piastra sul sistema di registrazione e avviare un programma di registrazione (Figura 1). Ad esempio, avviare illuminazione luce a 18 h dopo aver impostato la registrazione. Nota: Filtro temporale, quali i segnali di detrending con lo spostamento in media e Savitzky-Golay filtraggio, sono utile per la visualizzazione delle forme d'onda e rilevamenti di picco.</li>
</ol>4. dinamica mittente-destinatario l'analisi a livello di singola cellula: in tempo reale di Imaging delle risposte di singola cellula sotto il controllo di optogenetica perturbazione
<ol><li>Ricevitore5 piastra di 0,5 x 10 e 2,5 x 10 celle di mittente di5 piatti di diametro 35 mm 27-mm-diametro-vetro-base. Garantire che rapporti di miscelazione e un numero totale di cellule (una densità cellulare) siano regolati correttamente.</li>
	<li>Un giorno dopo il placcaggio, cambio mezzo con 2 mL di supporto di registrazione (rosso fenolo libero DMEM supplementato con 5% FBS, penicillina-streptomicina e luciferina di 1 mM) e impostare il piatto di vetro-base sul microscopio. Se necessario, lavare i detriti di cellule morte con PBS (-). Nota: È preferibile fare questo passaggio in una condizione di buio.</li>
	<li>Impostare un microscopio invertito, dotato di una camera climatica a 37 ° C e 5% CO2.</li>
	<li>Impostare una fotocamera CCD raffreddata. Accertarsi che la temperatura del sensore CCD è raffreddata al valore di destinazione (in genere,-90 ° C).</li>
	<li>
Impostare i parametri per "Multi-dimensional Timelapse" finestra nel software di acquisizione automatica di catturare immagini con intervalli di 5 min e più di 288 volte (più di una registrazione durante la notte).
	<ol>
<li>Aprire "Multi-dimensional Timelapse" finestra, selezionare un canale di luminescenza e una modalità di lettura lenta 50 kHz dal menu pull-down e impostare 4x4 binning con esposizione di 4 min. Accertarsi che la modalità di lettura è impostata la modalità lenta 50 kHz, che è fondamentale per ridurre i rumori di lettura per rilevare debolmente che emettono luce bioluminescente.</li>
		<li>Aprire "Multi-dimensional Timelapse" finestra, selezionare canali di fluorescenza e una modalità di lettura di 1 MHz veloce dal menu pull-down e impostare 2 x 2 binning con esposizione di 400 ms. Assicurarsi che la modalità di lettura è impostata la modalità veloce di 1 MHz per ridurre il tempo necessario per l'imaging di fluorescenza.</li>
		<li>Start Time-lapse di registrazione cliccando su "Acquire".</li>
	</ol>
</li>
	<li>Estrarre tracce unicellulare di canali di luminescenza da filmati time-lapse di software di analisi di immagine, come segue. Prima di tutto la luminescenza e fluorescenza immagini dello stack importando i dati di immagine al software di analisi di immagine. Per le immagini di luminescenza, rimuovere pixel caldi derivata da raggi cosmici confrontando le intensità dei pixel nelle immagini temporaneamente adiacente, sostituendo i valori di pixel per la media temporale dei fotogrammi precedenti e successivi (implementato come filtro"SpikeNoise"), applicare queste immagini elaborate a un filtro spazialmente e sottrarre i valori dei pixel di sfondo di giocatori visite da ogni fotogramma. Quindi, stabilire una "regione di interesse" (ROI) per ogni cella su un'immagine fluorescente in ogni momento, applicare il ROI immagini luminescenti e misurare l'intensità luminescente di ogni ROI.</li>
</ol>

<ol><li>Hubaud, A., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+dynamics+in+vertebrate+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Signalling dynamics in vertebrate segmentation.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).</li>
<li>Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronised+cycling+gene+oscillations+in+presomitic+mesoderm+cells+require+cell-cell+contact%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact.</a> Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).</li>
<li>Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+the+somite+segmentation+clock%3A+revelation+of+unstable+oscillators+in+the+individual+presomitic+mesoderm+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).</li>
<li>Tsiairis, C., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Organization+of+Embryonic+Genetic+Oscillators+into+Spatiotemporal+Wave+Patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns.</a> Cell. 164, 656-667 (2016).</li>
<li>Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signalling+and+the+synchronization+of+the+somite+segmentation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock.</a> Nature. 408, 475-479 (2000).</li>
<li>Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell-resolution+imaging+of+the+impact+of+Notch+signaling+and+mitosis+on+segmentation+clock+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics.</a> Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).</li>
<li>Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourquié, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodic+inhibition+by+Lunatic+Fringe+underlies+the+chick+Segmentation+Clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock.</a> Nature. 421, 275-278 (2003).</li>
<li>Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lfng+regulates+the+synchronized+oscillation+of+the+mouse+segmentation+clock+via+trans-repression+of+Notch+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling.</a> Nat. Commun. 3, 1141(2012).</li>
<li>Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillatory+control+of+Delta-like1+in+cell+interactions+regulates+dynamic+gene+expression+and+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis.</a> Genes Dev. 30, 102-116 (2016).</li>
<li>Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+perturbation+and+bioluminescence+imaging+to+analyze+cell-to-cell+transfer+of+oscillatory+information%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information.</a> Genes Dev. 31, 524-535 (2017).</li>
<li>Wang, X., Chen, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+gene+expression+by+a+light-switchable+transgene+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system.</a> Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).</li>
<li>Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillatory+control+of+factors+determining+multipotency+and+fate+in+mouse+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors.</a> Science. 342, 1203-1208 (2013).</li>
<li>Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2%3A+a+versatile+gene+transfer+vector+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates.</a> Genome Biol. 8, Suppl 1. S7(2007).</li>
<li>Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+circadian+clock+oscillations+in+primary+cultures+of+mammalian+cells+using+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy.</a> BMC Biotechnology. 10, 3(2010).</li>
<li>Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+and+stable+near-infrared+fluorescent+protein+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging.</a> Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).</li>
<li>Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+onset+of+collective+behavior+in+social+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The onset of collective behavior in social amoebae.</a> Science. 328, 1021-1025 (2010).</li>
<li>Kellogg, R. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+facilitates+transcriptional+control+under+dynamic+inputs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs.</a> Cell. 160, 381-392 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Abbiamo mostrato un metodo per controllare le dinamiche di espressione genica con una periodicità di h 2 o 3. Questa scala temporale è molto più breve rispetto a quelle di altri sistemi convenzionali, tra cui il sistema Tet-On e il sistema LightOn originale. Parametri chiave per raggiungere le scale temporali ultradiane sono emivite di prodotti molecolari indotti da foto, mRNA e proteine. Questi parametri cinetici possono dipendere di specie e tipi di cellule. Per la sintonizzazione la cinetica, sostituendo sequenze Hes1...

Comunicazione della cellula--cellula giocano un ruolo critico nel patterning embrionale in processi di sviluppo. In embrioni vertebrati, le strutture metamerica chiamate somiti si formano lungo l'asse antero-posteriore corpo con una precisione temporale precisa sotto il controllo di un orologio di tempo di mantenimento, chiamato la segmentazione dell'orologio1. Durante questo processo, un gruppo di cellule del mesoderma presomitic (PSM) periodicamente vengono convertiti in somiti in modo sincrono. Questo processo coinvolge l'espressione genica di oscillatori sincronizzati e cellule PSM che oscillano in fase formano dei metameri stessi. Il periodo dell'espressione genica oscillatorio è circa 2-3 h in topi e a circa 30 min in zebrafish. Quando dissociate, PSM cellule perdono la sincronia2,3, ma quando sono ri-aggregati, possono auto-organizzarsi e recuperare la popolazione sincronia4, suggerendo che l'accoppiamento cellula-cellula è una chiave per il sincronizzato oscillazioni.
Gli sforzi profusi hanno rivelato che le molecole di segnalazione nella via del Delta-Notch strettamente collegate alle oscillazioni sincronizzate dei geni orologio segmentazione. O inibitori farmacologici o mutazioni genetiche della tacca di segnalazione desincronizzarsi la popolazione degli oscillatori. In zebrafish, mutanti della tacca di segnalazione componenti, quali DeltaC, DeltaD e Notch1a, visualizzano asincrona oscillazioni5,6. Negli embrioni di pulcino o il mouse, non solo il ligando Notch Delta-like1 (Dll1), ma anche il tacca modulatore Lunatic fringe (Lfng) è richiesto per oscillazioni sincronizzata7,8,9. Tuttavia, è stato difficile testare la funzionalità di tali molecole per il trasferimento di informazioni dinamiche da cella a cella, perché risoluzioni temporali di perturbazione convenzionale della dinamica di regolazione genica non erano sufficienti per indagare il processi di tempistiche di 2 – 3 h (ultradiane).
Recentemente abbiamo sviluppato un metodo integrato per controllare e monitorare pattern di espressione genica in cellule di mammifero10. Questa tecnologia consente ad induzione di impulsi di espressione genica di illuminazione a luce periodici su scale di tempo ultradiane. Questo protocollo rappresenta i metodi per stabilire linee di cellule fotosensibili e osservare le risposte dinamiche delle cellule reporter di luminescenza di cellule vive di monitoraggio nei contesti delle comunicazioni cellula--cellula. Questo metodo è applicabile per l'analisi di molte altre vie di segnalazione.

<table><tbody><tr><td>FACS</td><td>Becton, Dickinson e società</td><td>FACSAriaII SORP</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Andor</td><td>iKon M-934</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td>IX-81 ZDC</td><td></td></tr><tr><td>PMT dispositivo</td><td>Churitsu eletric corp.</td><td>CL24B-LIC/B</td><td></td></tr><tr><td>Illuminatore LED Blu</td><td>OptoCode</td><td>LEDB-SBOXH</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Nacalai</td><td>08459-35</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Nacalai</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Sigma</td><td>172012</td><td></td></tr><tr><td>KRYSTAL24 (piastra nera a 24 pozzetti)</td> <td>Hi-tech</td><td>303012</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferina Potassio Sale</td><td>Nacalai</td><td>20028-24</td><td></td></tr><tr><td>Esposimetro</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>LI-250A</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-HA-perossidasi</td><td>Clone Roche</td><td>3F10</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-actina-perossidasi</td><td>Wako</td><td>clone 2F3</td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo di optogenetica per controllare e analizzare il pattern di espressione genica nelle interazioni della cellula--cellula

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cellule devono rispondere correttamente a cambiare temporaneamente gli ambienti, che sono influenzati da vari fattori da cellule circostanti. Il via di segnalazione di Notch è uno di tali macchinari molecolari essenziali per le comunicazioni cellula--cellula, che svolge ruoli chiave nello sviluppo normale degli embrioni. Questa via comporta un trasferimento di cellula--cellula di informazioni oscillatorie con Oscillazioni ultradiane, ma nonostante i progressi nelle tecniche di biologia molecolare, è stato impegnativo per delucidare l'impatto delle interazioni multicellulari sul gene oscillatoria dinamica. Qui, presentiamo un protocollo che consente la gestione di optogenetica e monitoraggio in tempo reale di espressione genica in modo temporale preciso. Questo metodo con successo ha rivelato che intracellulari e intercellulari ingressi periodici della tacca di segnalazione entrain oscillazioni intrinseche di frequenza di sintonizzazione e fase spostando la risoluzione di singole cellule. Questo metodo è applicabile per l'analisi delle caratteristiche dinamiche delle varie vie di segnalazione, fornendo una piattaforma unica per testare un significato funzionale dei programmi di espressione genica dinamici nei sistemi pluricellulari.

Abbiamo adattato il LightOn sistema11,12, che consente l'espressione genica di foto-indotta in cellule di mammifero, allo studio della genetiche oscillatori con periodicità di 2 - 3 h. Questo sistema è composto da due parti: il hGAVPO foto-inducible attivatore trascrizionale e una cassetta di UAS-promotore alla trascrizione di unità di arbitrari geni di interesse. Per accelerare la cinetica pulsatile di espressione genica indotta ...

Qui, presentiamo un protocollo per analizzare la cellula--cellula trasferimento di informazioni oscillatori di optogenetica controllo e monitoraggio dell'espressione genica live. Questo approccio fornisce una piattaforma unica per testare un significato funzionale dei programmi di espressione genica dinamici nei sistemi pluricellulari.

Un metodo di optogenetica per controllare e analizzare il pattern di espressione genica nelle interazioni della cellula--cellula

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di osservare il trasferimento da cellula a cellula di informazioni oscillatorie mediante controllo optogenetico e monitoraggio in tempo reale dell'espressione genica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave su come le cellule comunicano tra loro attraverso la via di segnalazione di Notch, in particolare su come le cellule si trasmettono reciprocamente le informazioni oscillatorie. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo controllare e monitorare la dinamica dell'espressione genica con altissima precisione.A dimostrare la procedura sarà Akihiro Isomura, un ricercatore del mio laboratorio che ha sviluppato questa nuova tecnologia. Per trasfettare vettori plasmidici di moduli optogenetici basati su Tol2 insieme al vettore di espressione della trassposisi in cellule C2C12, contare prima le cellule tripsinizzate con un contatore cellulare. Piastra 50.000 cellule C2C12 per pozzetto in una piastra a 12 pozzetti un giorno prima della trasfezione.Quindi, co-trasfettare 0,375 microgrammi di vettori optogenetici basati su Tol2, 0,125 microgrammi di un vettore di selezione di farmaci e 0,5 microgrammi del vetto

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Il recente sviluppo di strumenti neuroscienza che combinano genetica e ottica, definito "optogenetics", consente il controllo sulle attività del circuito neurale con un livello senza precedenti di risoluzione spaziale e temporale. Qui forniamo un protocollo per l'integrazione nella registrazione vivo con la manipolazione optogenetic di sottoinsiemi geneticamente definiti di neuroni piramidali corticali prefrontali e subicular.

Un metodo per High Fidelity optogenetic controllo dei singoli Piramidale neuroni<em&gt; In vivo</em

L'optogenetica è diventata un potente strumento da utilizzare negli esperimenti di neuroscienze comportamentali. Questo protocollo offre una guida passo passo alla progettazione e all'impostazione di sistemi laser e fornisce un protocollo completo per l'esecuzione di stimolazioni optogenetiche in vivo multiple e simultanee compatibili con la maggior parte dei paradigmi di test comportamentali dei roditori.

In vivo optogenetic stimolazione del sistema nervoso centrale Roditore

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro su come combinare artificiale microRNA-mediata RNA interference con optogenetica per stimolare specificamente i boutons presinaptici con ridotta espressione dei geni selettivi all'interno di circuiti neuronali intatti.

Combinando optogenetica con microRNA artificiali per caratterizzare gli effetti del Gene atterramento su funzione presinaptica all'interno di circuiti neuronali intatto

Con la manipolazione optogenetica di specifiche popolazioni neuronali o regioni cerebrali, il comportamento può essere modificato con alta risoluzione temporale e spaziale in animali in movimento libero. Utilizzando diversi strumenti optogenetici in combinazione con fibre ottiche cronicamente impiantate, è possibile eseguire una varietà di modulazioni neuronali e test comportamentali.

Manipolazione optogenetica dell'attività neuronale per modulare il comportamento nei topi in movimento libero

Il controllo affidabile delle cellule di mammifero sensibili alla luce richiede la standardizzazione dei metodi optogenetici. Verso questo obiettivo, questo studio delinea una pipeline di costruzione di circuiti genici, ingegneria cellulare, funzionamento di apparecchiature optogenetiche e saggi di verifica per standardizzare lo studio dell'espressione genica indotta dalla luce utilizzando un circuito genico optogenetico a feedback negativo come caso di studio.

Ingegnerizzazione e controllo affidabili di circuiti genetici optogenetici stabili nelle cellule di mammifero

La bioluminescenza - la luce emessa da un enzima luciferasi che ossida un substrato di piccole molecole, una luciferina - può essere sfruttata per attivare le proteine fotosensoriali, aggiungendo così un'altra dimensione alla stimolazione della luce e consentendo la manipolazione di una moltitudine di funzioni mediate dalla luce nelle cellule attraverso scale temporali e spaziali.

Optogenetica bioluminescente 2.0: sfruttare la bioluminescenza per attivare proteine fotosensoriali in vitro e in vivo

Il controllo optogenetico del metabolismo microbico offre un controllo dinamico flessibile sui processi di fermentazione. Il protocollo qui mostra come impostare fermentazioni regolate dalla luce blu per la produzione chimica e proteica a diverse scale volumetriche.

Fermentazioni a controllo leggero per la produzione chimica microbica e proteica

Questo protocollo prevede la trasfezione di sensori cAMP e bPAC-nLuc, una proteina optogenetica, per tracciare accuratamente la sua distribuzione cellulare e la risposta alla stimolazione luminosa. L'approccio innovativo di creare una mappa di risposta cAMP utilizzando un sistema di scansione puntuale ha il potenziale per far progredire la ricerca con le proteine optogenetiche in diversi campi.

Mappatura della distribuzione cellulare di una proteina optogenetica utilizzando una griglia di stimolazione luminosa

La manipolazione optogenetica delle vie di segnalazione può essere una potente strategia per studiare come la segnalazione viene decodificata nello sviluppo, nella rigenerazione, nell'omeostasi e nella malattia. Questo protocollo fornisce linee guida pratiche per l'utilizzo di attivatori di segnalazione della proteina morfogenica (BMP) nodale e della proteina morfogenica ossea (BMP) basati sul dominio di rilevamento della luce-ossigeno-voltaggio nell'embrione precoce di zebrafish.

Attivazione della segnalazione optogenetica negli embrioni di zebrafish

Questo protocollo descrive l'applicazione di un dominio di commutazione allosterica attivato dalla luce blu (LightR) ingegnerizzato per il controllo spaziotemporale reversibile dell'attività proteica. Utilizzando la tirosin-chinasi Src come modello, questo studio offre un protocollo elaborato per lo sviluppo e la caratterizzazione di Src regolata dalla luce (LightR-Src). Dimostra la versatilità di questo approccio in tutte le classi di enzimi.

Controllo spazio-temporale dell'attività proteica attraverso la regolazione allosterica optogenetica

Questo studio descrive un metodo per esperimenti ad alto rendimento che utilizzano un array di LED stampato in 3D per ottimizzare l'espressione genica inducibile dalla luce nelle cellule HEK293T.

Rapida ottimizzazione di un sistema inducibile dalla luce per controllare l'espressione genica nei mammiferi

Scopri un metodo di optogenetica per controllare e analizzare il trasferimento di informazioni oscillanti tra cellule C2C12. Questa tecnica consente di monitorare la dinamica dell'espressione genica con alta precisione.

Un metodo di optogenetica per controllare e analizzare il pattern di espressione genica nelle interazioni della cellula--cellula (Video) | JoVE Journal

Un metodo di optogenetica per controllare e analizzare il pattern di espressione genica nelle interazioni della cellula--cellula

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