Un metodo di optogenetica per controllare e analizzare il pattern di espressione genica nelle interazioni della cellula--cellula

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di osservare il trasferimento da cellula a cellula di informazioni oscillatorie mediante controllo optogenetico e monitoraggio in tempo reale dell'espressione genica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave su come le cellule comunicano tra loro attraverso la via di segnalazione di Notch, in particolare su come le cellule si trasmettono reciprocamente le informazioni oscillatorie. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo controllare e monitorare la dinamica dell'espressione genica con altissima precisione.

A dimostrare la procedura sarà Akihiro Isomura, un ricercatore del mio laboratorio che ha sviluppato questa nuova tecnologia. Per trasfettare vettori plasmidici di moduli optogenetici basati su Tol2 insieme al vettore di espressione della trassposisi in cellule C2C12, contare prima le cellule tripsinizzate con un contatore cellulare. Piastra 50.000 cellule C2C12 per pozzetto in una piastra a 12 pozzetti un giorno prima della trasfezione.

Quindi, co-trasfettare 0,375 microgrammi di vettori optogenetici basati su Tol2, 0,125 microgrammi di un vettore di selezione di farmaci e 0,5 microgrammi del vettore di espressione della trasposasi utilizzando il reagente di lipofezione. Tripsinizzare le cellule trasfettate e piastrelarle in piastre di coltura da 100 millimetri un giorno dopo la trasfezione. Sostituire il terreno di coltura per le cellule trasfettate con un terreno di coltura integrato con 100 milligrammi per millilitro di igromicina.

Coltivare le cellule per tre giorni per eliminare le cellule non trasfettate. Si noti che non è necessario un cambio medio. Successivamente, tripsinizzare le cellule trasfettate e purificare una popolazione di cellule che esprimono proteine fluorescenti per la selezione ordinando le cellule riceventi e fotosensibili, come dettagliato nel protocollo di testo.

Installa due tipi di incubatrici con o senza sorgenti luminose per una condizione indotta dalla luce o una condizione di buio. Utilizzare un esposimetro per impostare l'intensità luminosa di un transilluminatore a LED blu. Misurare l'intensità della luce dopo aver chiuso la porta.

Programmare i tempi e la durata dell'illuminazione della luce caricando uno script di controllo su un microcontrollore a scheda singola che consente programmi programmabili per l'illuminazione. Contare le cellule tripsinizzate con un contatore di cellule e piastrare 100.000 cellule trasmittenti fotosensibili contenenti pAI218 e pAI170 su piastre di coltura in plastica di 35 millimetri di diametro. Posizionare le piastre in incubatrici separate per condizioni di buio e luce.

Dopo aver preparato le stoviglie, tenere chiuse le porte delle incubatrici fino alla raccolta dei lisati cellulari. Un giorno e mezzo dopo la placcatura, avviare l'illuminazione della luce. Non esporre le cellule alla luce incontrollata per evitare fotostimolazioni indesiderate.

Quindi, fai questo passaggio senza aprire la porta. Si noti che l'apertura della porta qui è solo a scopo dimostrativo. Circa due giorni dopo la piastratura, spostare le piastre dei campioni dagli incubatori al ghiaccio a intervalli di 30 minuti e iniziare la preparazione dei lisati cellulari per ulteriori analisi.

Per monitorare le risposte cellulari dopo la stimolazione ottica mediante PMT in tempo reale, tripsinizzare e contare il numero di cellule trasmittenti e riceventi con metodi standard. Preparare una sospensione di volume totale di un millilitro di 25.000 cellule del ricevitore e 125.000 celle trasmittenti. Piastra le cellule miste in ciascun pozzetto di piastre nere a 24 pozzetti con terreno di coltura contenente luciferina millimolare.

Analizzare le cellule su un lettore di piastre per il test della luciferasi per confermare che i segnali di uscita non siano troppo alti per il sistema di registrazione. Quindi, posizionare la piastra sul sistema di registrazione e avviare un programma di registrazione. Ad esempio, avviare l'illuminazione della luce 18 ore dopo l'impostazione della registrazione.

Per l'imaging in tempo reale delle risposte di singole cellule sotto il controllo della perturbazione optogenetica, prima piastra 50.000 cellule del ricevitore e 250.000 cellule trasmittenti su piastre di 27 millimetri di diametro con base di vetro e 35 millimetri di diametro. Assicurarsi che i rapporti di miscelazione e il numero totale di celle siano regolati correttamente. Un giorno dopo la placcatura, sostituire il mezzo con due millilitri di supporto di registrazione.

Posizionare la capsula con base in vetro su un microscopio invertito dotato di una camera ambientale a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Configura una telecamera CCD raffreddata. Assicurarsi che la temperatura del sensore CCD si sia raffreddata fino al valore di destinazione.

Imposta i parametri per la finestra time-lapse multidimensionale nel software di acquisizione automatica per acquisire immagini con intervalli di cinque minuti e più di 288 volte. Nella finestra time-lapse multidimensionale, selezionate un canale di luminescenza. Assicurarsi che la modalità di lettura sia impostata sulla modalità di lettura lenta a 50 kilohertz, che è fondamentale per ridurre i rumori di lettura per rilevare la luce bioluminescente che emette debolmente.

Nella finestra time-lapse multidimensionale, selezionare i canali di fluorescenza. Assicurarsi che la modalità di lettura sia impostata sulla modalità veloce di un megahertz per ridurre il tempo necessario per l'imaging a fluorescenza. Infine, imposta il binning due a due con un'esposizione di 400 millisecondi.

Quindi, seleziona una scheda del diario per impostare programmi per stimolare le celle con un'illuminazione periodica a luce blu. Fare clic sul pulsante più per aggiungere una nuova configurazione del giornale di registrazione. Seleziona un file di diario da una casella di diario, scegli più punti temporali e imposta i valori nelle caselle dei punti iniziali e degli intervalli per programmare la stimolazione.

Assicurarsi che il file journal specificato includa protocolli sequenziali per la selezione dell'illuminazione, dell'apertura dell'otturatore, del ritardo, della chiusura dell'otturatore e del ritardo. Successivamente, imposta programmi per stimolare le cellule con un'illuminazione periodica a luce blu. Infine, avvia la registrazione time-lapse facendo clic sul pulsante Acquisisci.

Infine, estrai le tracce di una singola cellula dei canali di luminescenza dai filmati time-lapse, come descritto nel protocollo di testo. I risultati rappresentativi dei saggi optogenetici mittente-destinatario sono mostrati qui. Le cellule trasmittenti foto-inducibili hanno prodotto pattern oscillatori dell'espressione del ligando Delta in presenza di illuminazione periodica a luce blu, come previsto.

Quando le cellule riceventi vengono co-coltivate con le cellule trasmittenti fotosensibili ed esposte a un'illuminazione a luce ripetitiva, un sistema di registrazione della bioluminescenza in tempo reale rileva le risposte cicliche delle cellule riceventi in varie condizioni di rapporti di miscelazione. Inoltre, la microscopia time-lapse con illuminazione a luce ripetitiva rivela anche le risposte sincronizzate delle cellule riceventi a livello di singola cellula. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare per esplorare come le informazioni dinamiche dell'espressione genica vengono trasferite nelle interazioni cellula-cellula.