Esame di Selezione timica positivi e negativi per Citometria a Flusso

L'obiettivo generale del seguente esperimento è esaminare il tuo sviluppo nei topi mediante citometria a flusso. Ciò si ottiene preparando sospensioni di singole cellule dal topo, dal timo e dalla milza. Come secondo passo, i timociti e i citi vengono colorati con un cocktail di anticorpi per l'identificazione di specifiche popolazioni di thy.

In definitiva, la frequenza e il numero di varie popolazioni di linfociti possono essere valutati mediante analisi citofluorimetrica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nello sviluppo delle cellule T, come ad esempio quali geni e percorsi sono importanti per generare un repertorio di cellule T funzionale ma tollerante alle cellule. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sullo sviluppo delle cellule T nel timo, può anche essere applicato nell'esame dello sviluppo di altre cellule immunitarie.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà nella progettazione dei loro cocktail di anticorpi per la citometria a flusso. Prima di iniziare la dissezione, posizionare un retino sterile in rete d'acciaio in una piastra di Petri da 60 x 15 millimetri. Quindi aggiungere cinque millilitri di HBSS al piatto e conservare il piatto sul ghiaccio per raccogliere il timo.

Per prima cosa, usa un paio di pinze per sollevare la punta inferiore dello sterno e rivelare il diaframma. Successivamente, evitando il fegato, tagliare il diaframma per staccare la gabbia toracica e poi tagliare la gabbia toracica verso l'alto su ciascun lato. Facendo attenzione a evitare i polmoni e il cuore.

Ora usa la pinza per tirare delicatamente indietro la gabbia toracica. Il timo è un organo bilobato bianco situato sopra il cuore. Usa il bordo piatto della pinza per afferrare la parte inferiore dei lobi.

Quindi estrarre delicatamente il timo e posizionarlo su uno dei retini precedentemente preparati. Per prelevare la milza, praticare un'incisione attraverso il peritoneo per esporre la cavità addominale. La milza è un organo rosso a forma di tavola da surf situato sul lato sinistro della cavità addominale del topo sotto il fegato.

Quindi usa un paio di pinze per estrarre la milza e un altro per stuzzicare il tessuto connettivo. Quindi posizionare la milza sezionata su uno schermo a rete separato. Ora usa lo stantuffo di una siringa da tre millilitri per macinare ogni organo nel suo schermo a rete fino a quando rimangono solo il tessuto connettivo e il grasso, pipettare le cellule e l'HBSS in un tubo conico da 15 millilitri.

Quindi risciacquare ogni rete con HBS S3 fresco volte. Quindi, pellettare le celle per cinque minuti a 335 volte G e quattro gradi Celsius. Dopo aver aspirato il surnatante resus, sospendere i citi in 500 microlitri di tampone di lisi CK per 10 minuti a temperatura ambiente mentre i globuli rossi splenici vengono lievitati Resus.

Sospendi i timociti a 20 volte 10 per sei cellule per millilitro nel tampone fax e mettili da parte con ghiaccio. Ora aggiungi cinque millilitri di HBSS per riportare i citi all'isotonicità dopo aver fatto girare nuovamente le cellule, sospendi nuovamente il pellet libero da globuli rossi a 20 volte 10 alla sesta cellula per millilitro in tampone fax. Inizia questo passaggio di Ali Watting.

Quattro volte da 10 a un sesto dei timociti riservati per campione di citometria a flusso in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Quindi, aggiungere i citi ai pozzetti di una piastra da 96 pozzetti per i controlli di compensazione. Quindi bloccare i recettori FC in ciascuno dei campioni cellulari mediante incubazione con anti CD 1632 per 10 minuti su ghiaccio.

Ora gira la piastra verso il basso e poi espelle il liquido dai pozzetti sbattendo la piastra una volta a faccia in giù in un lavandino, quindi sospendi nuovamente ogni pozzetto in 200 microlitri di tampone fax e ripeti il lavaggio. Successivamente, incubare i campioni sperimentali con 200 microlitri di cocktail di anticorpi o singoli anticorpi coniugati con fluorocromo per i controlli di compensazione. Tutto nel buffer fax sul ghiaccio al buio.

Dopo 30 minuti, lavare le cellule due volte con il tampone fax e poi, dopo aver sospeso nuovamente le cellule nel tampone fax, trasferire i campioni in provette fax in modelli transgenici TCR fisiologici e topi wild type. La selezione positiva inizia nella fase di doppio positivo luminoso prima di passare allo stadio di doppio positivo opaco. Dopo l'incontro con l'antigene, i timociti opachi doppi positivi, quindi entrano in un CD di transizione quattro CD positivi otto stadio basso prima di diventare CD quattro.

I timociti singoli positivi o CD otto singoli positivi sono caratterizzati da un'elevata espressione di TCR e dalla perdita di CD 24. Mentre il profilo CD otto per CD quattro può rivelare difetti nella selezione positiva, l'esame del TCR beta con CD 69 o CD 5 può fornire ulteriori informazioni su dove si trova il difetto. Sia la CD 69 che la CD 5 sono sovraregolate dopo la stimolazione del TCR, con interazioni più forti che guidano una maggiore espressione di questi marcatori.

In questo grafico TCR beta by CD 69 in un topo wild type, l'andatura negativa TCR R beta low CD 69 rappresenta una popolazione di timociti doppi positivi di preselezione. Mentre questa andatura positiva TCR beta intermedia CD 69 rappresenta una popolazione di transizione direttamente dopo l'impegno del TCR ed è composta da doppio positivo luminoso con alcuni doppi positivi opachi e CD quattro positivi CD otto cellule basse. Qui l'andatura TCR R beta alta CD 69 positiva illustra la popolazione di cellule direttamente post selezione positiva, che consistono in doppia positività opaca CD quattro positive, CD otto basse e CD quattro singole positive.

Infine, questa andatura negativa TCR beta ad alto CD 69 mostra una popolazione di cellule più matura che consiste principalmente di cellule singole CD quattro e CD otto singole positive. L'assenza delle popolazioni TCR R beta intermedie CD 69 positive e TCR R beta beta positive CD 69 può essere indicativa di alterati cambiamenti di selezione positiva nel rapporto tra CD quattro singoli positivi e CD otto. Singole cellule positive all'interno della popolazione TCR beta high CD 69 negative possono suggerire alterazioni nell'impegno del lignaggio.

La perdita delle popolazioni TCR beta high CD 69 positive e TCR beta high CD 69 negative può riflettere problemi di sopravvivenza a seguito di selezione positiva. L'esame del TCR beta per CD 5 è un'altra strategia per identificare le popolazioni di selezione pre e post positive. Queste prime due popolazioni sono costituite principalmente da timociti luminosi doppi positivi.

La popolazione TCR beta low CD five low rappresenta i timociti doppi positivi di preselezione, mentre la popolazione TCR beta intermediate CD five intermediate è costituita dalle cellule che avviano la selezione positiva. La generazione alterata di questa o della popolazione precedente suggerisce una selezione positiva difettosa. Il TCR R beta intermedio CD cinque popolazione alta, tuttavia, rappresenta i timociti in fase di selezione positiva ed è costituito principalmente da doppi positivi opachi e CD quattro positivi.

CD otto timociti bassi. La popolazione TCR beta high CD five high consiste principalmente di selezione post positiva. I timociti singoli positivi cambiano nel rapporto di CD quattro, singolo positivo a CD otto.

Singole cellule positive all'interno di questa popolazione, nonostante le normali popolazioni precedenti, possono suggerire alterazioni nell'impegno del lignaggio. Inoltre, l'assenza di questa popolazione può indicare una ridotta sopravvivenza dei timociti a seguito di selezione positiva, poiché la selezione negativa comporta la delezione di piccole popolazioni specifiche per l'antigene. I difetti in questo processo sono meglio osservati utilizzando topi transgenici TCR in HY CD: quattro timociti di topi che esprimono il transgenico H-Y-T-C-R possono essere rilevati con l'anticorpo monoclonale T 3.7.

L'H-Y-T-C-R riconosce l'antigene HY specifico maschile presentato all'interno di MHC Class one db. Pertanto, HY CD quattro topi maschi subiscono una selezione negativa di timociti H-Y-T-C-R positivi, come indicato da una riduzione del numero di timociti doppi positivi T tre virgola 70 positivi e una diminuzione più drammatica del numero di T 3,7 CD positivi otto, singoli numeri di citi positivi. Al contrario, HY CD quattro topi femmina subiscono una selezione positiva per generare T 3,7 CD positivi otto cellule T singole positive.

Mentre una riduzione del numero di thy doppi positivi è indicativa di selezione negativa, l'assenza di timociti singoli positivi antigene-specifici è la misura più accurata. Un ulteriore esame dei pochi timociti T tre virgola 70 CD positivi otto singoli positivi nei topi maschi HY CD quattro rivela che la maggior parte sono cellule immature CD 24 alte. Mentre la maggior parte dei timociti T tre virgola 70 positivi CD otto singoli positivi nel CD HY quattro femmine hanno raggiunto la maturità e sono CD 24 bassi, fornendo ulteriore supporto, che la selezione negativa si verifica nei topi maschi HY CD quattro.

Un avvertimento dei modelli transgenici TCR è che è difficile caratterizzare ulteriormente la selezione positiva identificando le popolazioni basate sul TCR e sull'espressione di CD 69 o CD 5 a causa dell'elevata espressione di TCR durante lo sviluppo di CYTE, HY CD quattro topi femmina hanno una grande popolazione di T tre virgola 70 timociti doppi positivi che subiscono una selezione positiva. Come indicato da un aumento della popolazione positiva per il CD 69 rispetto al wild type, la selezione negativa comporta uno stimolo TCR di affinità più elevato rispetto alla selezione positiva. Ciò è indicato da una maggiore espressione di CD 69 su timociti doppi positivi T tre virgola 70 doppi positivi in topi maschi HY CD quattro con conseguente spostamento del picco dell'istogramma verso destra.

Tendenze simili si osservano con l'espressione del quinto CD quando si analizza la selezione timica nei topi geneticamente manipolati. L'esame dell'espressione di CD 69 o CD 5 può determinare se il difetto risiede nella segnalazione del TCR o in un esito a valle della stimolazione del TCR. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore e mezza per la preparazione e la colorazione delle cellule, più un'ora aggiuntiva per la raccolta dei dati sul citometro a flusso.

Se eseguito correttamente, ogni mouse aggiuntivo aggiungerà circa 30 minuti. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di maneggiare delicatamente i timociti e assicurarsi di aver pianificato in anticipo la strategia di colorazione. Seguendo questa procedura.

Altri saggi, come i saggi di uccisione o i saggi di produzione di citochine, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come il corretto funzionamento dei timociti esportati. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare lo sviluppo del sito timico utilizzando la citometria a flusso.