Name: Esame di Selezione timica positivi e negativi per Citometria a Flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: Scopri l'esame di selezione timica positiva e negativa mediante citometria a flusso in topi geneticamente modificati. Questo metodo permette di analizzare lo sviluppo dei linfociti T e identificare le popolazioni cellulari specifiche.

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Gli autori desiderano ringraziare Bing Zhang per la sua assistenza tecnica. Questo lavoro è stato finanziato dal Canadian Institutes for Health Research (MOP-86595). TAB è un investigatore CIHR Nuovo e Scholar AHFMR. QH è sostenuto da una borsa di studio CIHR Canada Graduate - Dottorato e un AIHS tempo pieno Studentship. SAN è sostenuto da una borsa di studio Queen Elizabeth II Graduate. AYWS è sostenuto da una borsa di studio post-laurea NSERC - Dottorato.

Fare riferimento alla Figura 1 per uno schema generale del protocollo sperimentale. 1. Dissezione <ol><li> Luogo sterile setaccio a maglia d&#39;acciaio in 60 x 15 millimetri capsula di Petri. Una unità è necessaria per campione di tessuto. </li><li> Aggiungere 5 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) a ogni piatto. Tenere i piatti sul ghiaccio. </li><li> Eutanasia topi con CO 2. </li><li> Del mouse sulla superficie protetta dissezione, lato ventrale rivolto verso l&#39;alto. Mouse spruzzo con 70% etanolo per la sterilizzazione e per assicurare che il pelo è arruffati giù. </li><li> Usando forbici chirurgiche, cominciano dissezione facendo una incisione nella pelle ventrale addominale appena sopra i genitali. Estendere incisione verso l&#39;alto fino al mento. </li><li> Dalla linea mediana, estendere l&#39;incisione giù lungo tutti gli arti. Tirare indietro la pelle flaccida e il pin verso il basso sulla superficie dissezione. </li><li> Raccolto il timo: <ol><li> Sollevare la punta inferiore dello sterno per fare un&#39;incisione.</li><li> Evitare il fegato, tagliare il diaframma per staccare la gabbia toracica e poi tagliare la gabbia toracica per ogni lato. Tagliare i cassa toracica verso l&#39;alto su entrambi i lati, avendo cura di evitare i polmoni e il cuore. </li><li> Estrarre delicatamente il retro cassa toracica con una pinza. Il timo è un bianco, organo bilobato situato sopra il cuore. Utilizzando il bordo piatto della pinza per afferrare la parte inferiore dei lobi, tirare delicatamente il timo e posizionarlo sullo schermo maglia. </li></ol></li><li> Raccogliere la milza: <ol><li> La milza è un rosso, a forma di tavola da surf organo situato sul lato sinistro della cavità addominale del mouse, sotto il fegato. </li><li> Effettuare un&#39;incisione nella cavità addominale. Estrarre delicatamente la milza con un paio di pinze, con la seconda coppia per prendere in giro via del tessuto connettivo. Posizionare la milza su uno schermo a rete separata. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione cellulare <ol><li> Utilizzando uno stantuffo di una siringa da 3 ml, macinareorgani nello schermo maglia fino tessuto connettivo e solo resti di grasso. Sciacquare maglia con HBSS dal piatto tre volte. Utilizzare un pistone nuovo per ogni campione di tessuto. <ol><li> Altre opzioni per omogeneizzare tessuto può essere utilizzato al posto di questo metodo. </li></ol></li><li> Contare le cellule con un emocitometro. </li><li> Pellet di cellule per centrifugazione a 335 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Splenociti Risospendere in 500 pl di tampone di lisi ACK (0,15 M NH 4 Cl, 10 mM KHC0 3, 0,1 mM Na 2 EDTA, pH 7,2) per 10 min a temperatura ambiente. Timociti Risospendere a 20 x 10 6 cellule / ml in FACS tampone (PBS, 1% FCS, sodio azide 0,02%) e mettere da parte su ghiaccio. </li><li> Ritorno splenociti di isotonicità aggiungendo 5 ml di HBSS. Splenociti pellet per centrifugazione e risospendere a 20 x 10 6 cellule / ml in tampone FACS. Se le cellule hanno bisogno di rimanere sterile, è possibile utilizzare sterile RPMI + 10% FCS. </li></ol> 3.Le cellule colorazione per Citometria a Flusso Lo scopo di questo protocollo è quello di delineare strategie per l&#39;analisi di selezione positiva e negativa utilizzando tipo selvatico (WT) e topi CD4 HY. Per considerazioni di carattere generale in materia di citometria a flusso di progettazione sperimentale, l&#39;acquisizione e l&#39;analisi, si rimanda ad un eccellente recensione di Tung et al 11. <ol><li> Aliquotare 4 x 10 6 timociti per campione di citometria a flusso per ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, così come 1 x 10 6 splenociti WT per il controllo di compensazione. Se si utilizza topi transgenici, è necessario includere un topo WT come un controllo in un esperimento. </li><li> Bloccare i recettori Fc incubando le cellule con anti-CD16/32 (clone 2.4G2) per 10 min in ghiaccio. </li><li> Spin piastra a 335 xg a 4 ° C per 5 min. Togliere il coperchio e dissipare liquido dai pozzetti muovendo la piastra una volta, a faccia in giù in un lavandino. Risospendere ogni pozzetto in 200 pl di tampone FACS. Ripetere il lavaggio. </li><li> Preparare cocktail di anticorpi come di seguito elencati, usando la concentrazione ottimale di ciascun anticorpo base diluizione in 200 pl di tampone FACS per pozzetto. La concentrazione ottimale di ciascun anticorpo è definita come la concentrazione minima necessaria per fornire il più grande separazione di popolazioni positive e negative. Se non c&#39;è popolazione negativa per un determinato anticorpo, un anticorpo isotipo dovrebbero essere inclusi. Il volume totale per pozzetto può essere ridotta (ad esempio a 100 pl per pozzetto), se desiderato. <ol><li> WT timo: anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 o anti-CD5, anti-CD24 </li><li> CD4 HY timo: anti-HY TCR (T3.70), anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 o anti-CD5, anti-CD24 Per ottenere una migliore separazione di CD69 e CD69 lo popolazioni hi in timociti, si raccomanda che un anticorpo biotinilato anti-CD69 primaria essere utilizzato, seguito da una macchia secondaria contenente fluorocromo coniugato streptavidina. Abbiamo use la stessa strategia per CD5 colorazione. </li></ol></li><li> Incubare le cellule con 200 ml di cocktail di anticorpi in tampone FACS per 30 min in ghiaccio, al buio. </li><li> In concomitanza con colorazione anticorpo cocktail, macchia ogni controllo di compensazione con un solo fluorocromo coniugato anticorpo. Idealmente, colorazione compensazione comporta gli stessi anticorpi utilizzati nel cocktail di anticorpi. Tuttavia, colorazione per ciascun antigene specifico non può essere fattibile per grandi esperimenti quando molti antigeni sono stati dosati. Pertanto, sia per colorazione anti-CD4 e anti-CD8 è raccomandato per l&#39;alta espressione di questi antigeni, o l&#39;uso di perline di compensazione. Macchia in tampone FACS per 30 min in ghiaccio, al buio. Lascia un controllo di compensazione senza macchia. </li><li> Lavare le cellule due volte con tampone FACS. </li><li> Risospendere le cellule in tampone FACS e trasferimento tubi FACS. </li><li> Acquisire campioni su citofluorimetro. Include l&#39;acquisizione di FSC-A e FSC-W a unallow di discriminazione doppietto. </li></ol> 4. Analisi dei dati Citometria a flusso - non TCR topi transgenici Usiamo FlowJo per citometria a flusso l&#39;analisi dei dati. Fare riferimento alla Figura 2A per la strategia di gating per i non-TCR topi transgenici. <ol><li> Utilizzo di FSC-A da SSC, cancello elettronico sulla popolazione &quot;linfociti&quot;. </li><li> All&#39;interno della popolazione &quot;linfociti&quot;, utilizzare FSC-A da FSC-W per via elettronica porta del FSC-W popolazione lo escludere doppietti cellulari e aggregrates. Questa è la porta &quot;singoletto&quot;. </li><li> Con gli eventi del cancello &quot;singoletto&quot;, la trama da CD4 CD8. Disegna cancelli per DN, DP sordo, DP luminoso, CD4 + CD8 popolazioni ecco, CD4SP e CD8SP come illustrato nella figura 2B. </li><li> Sotto le porte CD4SP e CD8SP, creare TCRβ da CD24 trame. Utilizzare lo strumento gating quadrante per disegnare cancelli come illustrato in Figura 2C. </li><li> Creare una new trama dal cancello &quot;singoletto&quot;: TCRβ da CD69. Disegnare porte A, B, C, D, come illustrato nella Figura 2D. </li><li> Creare un altro grafico dal cancello &quot;singoletto&quot;: TCRβ da CD5. Disegnare porte I, II, III, IV come illustrato nella Figura 2E. Questa è un&#39;altra strategia per l&#39;esame di selezione positiva. </li><li> Applicare DN, DP sordo, DP luminoso, int CD4, CD4SP e CD8SP porte da sotto &quot;singoletto&quot; ai cancelli i, ii, iii, iv, A, B, C, D (Figura 2D, E). </li><li> Calcolare il numero di cellule in un particolare sottoinsieme moltiplicando cellularità organo per la frequenza di ogni porta successiva fino a raggiungere la popolazione target. Per esempio, il numero di TCRβ hi-CD69 CD8SP timociti sarebbe determinata dal timo cellularità x% TCR BHI-CD69 (frazione D) x CD8SP%. <ol><li> Conteggio tiene già conto delle cellule vive e morte in modo da non includere il &quot;lymphocYTE &quot;porta nei calcoli. </li></ol></li></ol> 5. Analisi dei dati Citometria a flusso - TCR topi transgenici Fare riferimento alla Figura 3A per la strategia di gating per TCR topi transgenici. <ol><li> Seguire i punti 4.1 e 4.2, come nella sezione precedente. </li><li> Sotto il cancello &quot;singoletto&quot;, creare un T3.70 dalla trama SSC e cancello sul T3.70 + popolazione cellulare per analizzare antigene-specifiche cellule T (Figura 3B). In alcune circostanze, può essere interessante confrontare questa popolazione alla non-antigene specifico (T3.70) popolazione delle cellule T. </li><li> All&#39;interno della popolazione T3.70 +, disegnare DN, DP, CD4SP e CD8SP porte (Figura 3C). <ol><li> Per i campioni di controllo WT, disegnare questi cancelli sotto la porta &quot;singoletto&quot; o creare un T3.70-gate come ci saranno pochissimi T3.70 + cellule. </li></ol></li><li> Sotto il cancello CD8SP, creare unT3.70 da CD24 trama. Utilizzare lo strumento di gating quadrante per dividere le celle in quattro popolazioni (Figura 3F). </li><li> Creare un istogramma sovrapposto raffigurante CD69 espressione nel vano DP di topi WT e T3.70 + vano DP di CD4 HY topi (Figura 4A). Ripetere esaminare CD5 espressione (Figura 4B). </li><li> Calcolare il numero assoluto di cellule in ciascun sottoinsieme di interesse come in 4,8. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il protocollo qui presentato può essere utilizzato per esaminare selezione positiva e negativa in non-transgenici TCR e TCR topi transgenici. Questo protocollo descrive la colorazione degli antigeni di superficie. Per un&#39;ulteriore analisi dei meccanismi molecolari, è spesso necessario eseguire la colorazione intracellulare. Usiamo il BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kit per la maggior parte delle proteine ​​intracellulari e la Foxp3 BD Biosciences Kit di colorazione per fattori di trascrizione. Noi di solito acquis...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Sale HyClone Hank soluzione equilibrata </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30030.02 </td><td></td></tr><tr><td> Rete metallica schermi </td><td> Cedarlane </td><td> CX-0080-E-01 </td><td></td></tr><tr><td> Piastre di Petri (60 x 15 mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 877221 </td><td></td></tr><tr><td> Siringhe (3 ml) </td><td> BD Biosciences </td><td> 309657 </td><td></td></tr><tr><td> Provette coniche (15 ml) </td><td> Sarstedt </td><td> 62.554.205 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio </td><td> Zeiss - Primo Star </td><td> 415500-00XX-000 </td><td></td></tr><tr><td> Emocitometro </td><td> HausserScientifico </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> Piastra a 96 pozzetti </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetta multicanale </td><td> FISHERBRAND </td><td> 21-377-829 </td><td></td></tr><tr><td> Siero fetale di vitello </td><td> PAA </td><td> A15-701 </td><td></td></tr><tr><td> Tampone fosfato salino </td><td> Fisher Scientific </td><td> SH3025802 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio azide </td><td> IT Baker Chemical Co. </td><td> V015-05 </td><td></td></tr><tr><td> FcR reagente bloccante </td><td></td><td></td><td> Clone 2.4G2 </td></tr><tr><td> Anti-mouse HY TCR </td><td> eBioscience </td><td> XX-9930-AA * </td><td> Clone T3.70 </td></tr><tr><td> Anti-topo CD4 </td><td> eBioscience </td><td> XX-0042-AA * </td><td> Clone RM4-5 </td></tr><tr><td> Lanti-mouse CD8α </td><td> eBioscience </td><td> XX-0081-AA * </td><td> Clone 53-6,7 </td></tr><tr><td> Anti-topo CD24 </td><td> eBioscience </td><td> XX-0242-AA * </td><td> Clone M1/69 </td></tr><tr><td> Anti-mouse TCRβ </td><td> eBioscience </td><td> XX-5961-AA * </td><td> Clone H57-597 </td></tr><tr><td> Anti-topo CD69 Biotinylated </td><td> eBioscience </td><td> 13-0691-AA * </td><td> Clone H1.2F3 </td></tr><tr><td> Anti-mouse CD5 Biotinylated </td><td> eBioscience </td><td> 13-0051-AA * </td><td> Clone 53-7,3 </td></tr><tr><td> Streptavidina </td><td> eBioscience </td><td> XX-4217-AA * </td><td></td></tr><tr><td> Citometro di flusso </td><td> BD Biosciences - FACS Canto </td><td> 338962 </td><td></td></tr><tr><td> FACS tubi </td><td> BD Biosciences </td><td> 352052 </td><td></td></tr><tr><td> Citometria di flusso software di analisi </td><td> TreeStar - Flowjo </td><td> FlowJo v7 / 9 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone RPMI - 1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30027.01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * Varia da XX e YY fluorocromo varia per grandezza flaconcino. </td></tr></tbody></table>

esame di selezione timica positivi e negativi per citometria a flusso

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

Un sistema immunitario sano è necessario che le cellule T rispondono agli antigeni estranei, pur rimanendo tolleranza di auto-antigeni. Riarrangiamento casuale del recettore delle cellule T (TCR) α e β loci genera un repertorio T cella con grande diversità nella specificità antigenica, sia per sé ed esteri. Selezione del repertorio durante lo sviluppo nel timo è critica per generare le cellule T sicuro e utile. Difetti di selezione timica contribuire allo sviluppo di malattie autoimmuni e immunodeficienza 1-4. Progenitori delle cellule T inserire il timo come doppi negativi (DN) timociti che non esprimono CD4 o CD8 co-recettori. Espressione del αβTCR ed entrambi co-recettori avviene a doppio positivo (DP) stadio. Interazione del αβTCR con auto-peptide-MHC (pMHC) presentata da parte delle cellule del timo determina il destino del timociti DP. Interazioni ad alta affinità portare alla selezione negativa e di eliminazionezione di auto-reattivi timociti. Bassa affinità risultato interazioni in selezione positiva e sviluppo di CD4 o CD8 singoli positivi (SP) cellule T capaci di riconoscere antigeni estranei presentati da auto-MHC 5. Selezione positiva può essere studiata in topi con un anticorpo (tipo selvatico) repertorio TCR osservando la generazione di cellule T mature. Tuttavia, essi non sono ideali per lo studio di selezione negativa, che comporta l&#39;eliminazione di piccoli antigene-specifiche popolazioni. Molti sistemi modello sono stati utilizzati per studiare selezione negativa, ma variano nella loro capacità di ricapitolare eventi fisiologici 6. Per esempio, stimolazione in vitro dei timociti manca dell&#39;ambiente timica che è intimamente coinvolto nella selezione, mentre la somministrazione di antigene esogeno può portare a non-specifico delezione di timociti 7-9. Attualmente, i migliori strumenti per lo studio in vivo selezione negativa sono topi che esprimono una transgENIC specifico TCR per endogena auto-antigene. Tuttavia, molti classici modelli transgenici TCR sono caratterizzati dalla prematura espressione della catena transgenico TCRα nella fase DN, con conseguente prematuro selezione negativa. Il nostro laboratorio ha sviluppato il modello HY cd4, in cui il transgenico HY TCRα condizionatamente espressa nella fase DP, consentendo la selezione negativa a verificarsi durante il DP di transizione SP come avviene nei topi di tipo selvatico 10. Qui, si descrive un protocollo basato citometria di flusso per esaminare timica selezione positiva e negativa nel topo HY modello CD4. Mentre la selezione negativa in topi CD4 HY è altamente fisiologica, questi metodi possono essere applicati anche ad altri modelli transgenici TCR. Ci sarà anche la presentazione delle strategie generali per l&#39;analisi di selezione positiva in un repertorio policlonale applicabile a tutti i topi geneticamente manipolati.

In fisiologiche TCR modelli transgenici e topi WT, selezione positiva inizia nella fase DP luminoso prima di passare alla fase di DP opaca dopo l&#39;incontro di antigene. Timociti DP opaco quindi inserire una transizione CD4 + CD8 lo stadio prima di diventare CD4SP o timociti CD8SP (Figura 2B). Timociti maturi SP sono caratterizzati da elevata espressione TCR e perdita di CD24 (Figura 2C). Mentre il CD8 da CD4 profilo può rivelare ...

Vi presentiamo un metodo basato citometria di flusso per esaminare lo sviluppo delle cellule T<em&gt; In vivo</em&gt; Utilizzando topi geneticamente manipolati su un tipo selvatico o T sfondo recettore delle cellule transgeniche.

Esame di Selezione timica positivi e negativi per Citometria a Flusso

Un sistema immunitario sano richiede che le cellule T rispondano agli antigeni estranei rimanendo al contempo tolleranti agli autoantigeni. Il riarrangiamento casuale delle cellule T...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è esaminare lo sviluppo timico nei topi mediante citometria a flusso. Questo viene ottenuto preparando sospensioni di singole cellule da timo e milza del topo. Come secondo passaggio, i timociti e le cellule sono marcati con un cocktail di anticorpi per l'identificazione di specifiche popolazioni timiche.In definitiva, la frequenza e il numero delle diverse popolazioni di linfociti possono essere valutati mediante analisi citofluorimetrica. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nello sviluppo dei linfociti T, come ad esempio quali geni e vie metaboliche siano importanti per generare un repertorio di cellule T funzionale ma tollerante verso le cellule dell'organismo. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sullo sviluppo delle cellule T nel timo, può essere applicato anche nello studio dello sviluppo di altre cellule immunitarie.Generalmente, chi si approccia per la prima volta a questo metodo incontra difficoltà nella progettazione dei propri cocktail anticorpali per la citometria a flusso. Prima di iniziare la dissezione, posizionare una griglia sterile in acciaio inossidabile in una piastra di Petri di 60 per 15 millimetri. Quindi aggiungere cinque millilitri di HBSS alla piastra e conservarla sul ghiaccio per l'isolamento del timo.Per prima cosa, utilizzare una pinzetta per sollevare l'estremit&agrave; inferiore dello sterno e visualizzare il diaframma. Successivamente, evitando il fegato, tagliare il diaframma per staccare la gabbia toracica e quindi tagliare la gabbia toracica in senso ascendente su ciascun lato. Facendo attenzione a non danneggiare polmoni e cuore.Ora utilizzare la pinzetta per tirare delicatamente indietro la gabbia toracica. Il timo è un organo bianco bilobato situato sopra il cuore. Utilizzare il bordo piatto della pinzetta per afferrare la parte inferiore dei lobi.Quindi estrarre delicatamente il timo e posizionarlo su una delle griglie precedentemente preparate. Per isolare la milza, praticare un'incisione attraverso il peritoneo per esporre la cavità addominale. La milza è un organo di forma allungata e rossa, situato sul lato sinistro della cavità addominale del topo, al di sotto del fegato.Quindi utilizzare una coppia di pinze per estrarre la milza e un'altra coppia per separare delicatamente il tessuto connettivo. Successivamente, posizionare la milza dissezionata su un’apposita griglia metallica. Ora usare lo stantuffo di una siringa da tre millilitri per macerare ogni organo sulla propria griglia fino a quando rimangono soltanto tessuto connettivo e grasso; quindi pipettare le cellule e l’HBSS in un tubo conico da 15 millilitri.Quindi risciacquare ogni filtro con HBS fresco per 3 volte. Successivamente, centrifugare le cellule per cinque minuti a 335 ×g e a 4 gradi Celsius. Dopo aver aspirato il soprannatante, sospendere le cellule in 500 microlitri di un buffer di lisi CK per 10 minuti a temperatura ambiente, mentre i globuli rossi splenici vengono lisati.Sospendere i timociti a 20 × 10⁶ cellule/mL in tampone FAX e porre in ghiaccio. Aggiungere ora 5 mL di HBSS per ripristinare l'isotonicità dopo la centrifugazione; quindi risospendere il pellet privo di globuli rossi a 20 × 10⁶ cellule/mL in tampone FAX. Iniziare questo passaggio con Ali Watting.Quattro volte 10 alla sesta dei TIMOCITI riservati per campione di citometria a flusso in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Successivamente, aggiungere cellule nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti per i controlli di compensazione. Quindi bloccare i recettori FC in ciascun campione cellulare mediante incubazione con anti CD 1632 per 10 minuti sul ghiaccio.Ora centrifugare la piastra e quindi rimuovere il liquido dalle pozzette rovesciando la piastra una volta verso il basso in un lavandino; successivamente risospendere ogni pozzetta in 200 microlitri di buffer fax e ripetere il lavaggio. Successivamente, incubare i campioni sperimentali con 200 microlitri di cocktail di anticorpi o con singoli anticorpi coniugati a fluorocromo per i controlli di compensazione. Tutto in buffer fax, su ghiaccio e al buio.Dopo 30 minuti, lavare le cellule due volte con tampone fax, quindi, dopo aver risospeso le cellule in tampone fax, trasferire i campioni in provette fax in modelli fisiologici transgenici per il TCR e in topi di tipo selvatico. La selezione positiva inizia allo stadio doppio positivo brillante, prima di passare allo stadio doppio positivo opaco. Dopo l'incontro con l'antigene, i timociti doppio positivi opachi entrano quindi in uno stadio transitorio CD4 positivo CD8 basso, prima di diventare CD4.I timociti singoli positivi per CD8 o i timociti maturi singoli positivi sono caratterizzati dall'elevata espressione del TCR e dalla perdita di CD24. Mentre il profilo CD8 rispetto a CD4 può rivelare difetti nella selezione positiva, l'analisi di TCR beta in funzione di CD69 o CD5 può fornire ulteriori informazioni sulla localizzazione del difetto. Sia CD69 che CD5 vengono infatti upregolati dopo la stimolazione del TCR, con interazioni più forti che inducono un'espressione maggiore di questi marcatori.In questo grafico TCR beta rispetto a CD69 in un topo wild type, il compartimento TCR beta low CD69 negativo rappresenta una popolazione di timociti doppi positivi pre-selezione. Mentre il compartimento TCR beta intermedio CD69 positivo rappresenta una popolazione transitoria immediatamente successiva all'interazione del TCR e comprende cellule doppi positivi brillanti, alcune doppi positivi deboli e cellule CD4 positivo CD8 basso. Qui, il compartimento TCR beta alto CD69 positivo illustra la popolazione cellulare immediatamente successiva alla selezione positiva, costituita da cellule doppi positivi deboli, CD4 positivo, CD8 basso e cellule singoli positivi per CD4.Infine, questo profilo con TCR beta alta e CD69 negativo mostra una popolazione cellulare più matura, costituita principalmente da cellule singole positive per CD4 e CD8. L'assenza delle popolazioni con TCR beta intermedia CD69 positivo e TCR beta alta CD69 positivo può indicare un alterato processo di selezione positiva. Variazioni nel rapporto tra cellule singole positive per CD4 e singole positive per CD8 all'interno della popolazione TCR beta alta CD69 negativa possono suggerire alterazioni nell'impegno di linea.La perdita delle popolazioni TCR beta alta CD69 positiva e TCR beta alta CD69 negativa potrebbe riflettere problemi di sopravvivenza successivi alla selezione positiva. L'analisi del TCR beta mediante CD5 è un'altra strategia per identificare popolazioni pre e post selezione positiva. Queste prime due popolazioni consistono principalmente in timociti doppi positivi brillanti.La popolazione con TCR beta basso e CD5 basso rappresenta i timociti doppi positivi pre-selezione, mentre la popolazione con TCR beta intermedio e CD5 intermedio è composta dalle cellule che avviano la selezione positiva. Un'alterata generazione di questa o della popolazione precedente suggerisce un difetto nella selezione positiva. La popolazione con TCR beta intermedio e CD5 alto, tuttavia, rappresenta i timociti in corso di selezione positiva e consiste principalmente di doppi positivi deboli e CD4 positivi.Timociti CD8 low. La popolazione TCR beta high CD5 high consiste principalmente di timociti post selezione positiva. Timociti singoli positivi: variazioni nel rapporto tra CD4 singolo positivo e CD8.La presenza di cellule singole positive all'interno di questa popolazione, nonostante popolazioni precedenti normali, può suggerire alterazioni nell'impegno della linea cellulare. Inoltre, l'assenza di questa popolazione può indicare una ridotta sopravvivenza dei timociti dopo la selezione positiva, poiché la selezione negativa comporta l'eliminazione di piccole popolazioni specifiche per l'antigene. I difetti in questo processo sono meglio osservabili utilizzando topi transgenici per il TCR; nei timociti di topi CD4 transgenici per HY, i timociti che esprimono il TCR transgenico H-Y-TCR possono essere rilevati con l'anticorpo monoclonale T3.7.L'H-Y-T-C-R riconosce l'antigene specifico maschile HY presentato all'interno della molecola MHC di Classe I db. Di conseguenza, nei topi CD4 HY maschi avviene una selezione negativa dei timociti positivi per H-Y-T-C-R, come indicato dalla riduzione del numero di timociti doppi positivi positivi per T3.70 e da una diminuzione ancora più marcata del numero di timociti singoli positivi CD8 positivi per T3.7. Al contrario, nei topi CD4 HY femmine avviene una selezione positiva che porta alla generazione di linfociti T singoli positivi CD8 positivi per T3.7.Sebbene una riduzione del numero di timociti doppi positivi sia indicativa di una selezione negativa, l'assenza di timociti singoli positivi specifici per l'antigene rappresenta la misura più accurata. Un'ulteriore analisi degli scarsi timociti singoli positivi per T3.70 e CD8 nei topi maschi HY CD4 rivela che la maggior parte sono cellule immature CD24 ad alto livello. Mentre la maggior parte dei timociti singoli positivi per T3.70 e CD8 nei topi femmine HY CD4 ha raggiunto la maturità ed è CD24 a basso livello, fornendo ulteriore supporto all'ipotesi che la selezione negativa avvenga nei topi maschi HY CD4.Un limite dei modelli transgenici per il TCR è che risulta difficile caratterizzare ulteriormente la selezione positiva identificando popolazioni in base all'espressione di TCR e CD 69 o CD 5, a causa dell'elevata espressione di TCR durante tutto lo sviluppo dei timociti. I topi HY CD 4 femmine presentano una vasta popolazione di timociti doppi positivi T 3,70 positivi che subiscono selezione positiva, come indicato dall'aumento della popolazione positiva per CD 69 rispetto al tipo selvaggio. La selezione negativa comporta uno stimolo del TCR con affinità maggiore rispetto alla selezione positiva. Questo fenomeno è indicato dall'espressione più elevata di CD 69 sui timociti doppi positivi T 3,70 positivi nei topi maschi HY CD 4, con conseguente spostamento verso destra del picco dell'istogramma.Trend simili si osservano con l'espressione di CD5 nell'analisi della selezione timica in topi geneticamente modificati. L'esame dell'espressione di CD69 o CD5 permette di determinare se il difetto riguardi il segnale proveniente dal TCR o un evento a valle della sua stimolazione. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in due ore e mezza per la preparazione e la colorazione delle cellule, più un'ora aggiuntiva per l'acquisizione dei dati al citometro a flusso.Se eseguito correttamente, ogni topo aggiuntivo richiederà circa 30 minuti. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di manipolare i timociti con delicatezza e di aver pianificato in anticipo la strategia di marcatura. Seguire questa procedura.Altri saggi, come i saggi di uccisione o i saggi di produzione di citochine, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive, ad esempio se i timociti esportati funzionano correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare lo sviluppo del sito timico mediante citometria a flusso.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo video mostra una tecnica basata sulla citometria a flusso che utilizza due fluorocromi per identificare le cellule T CD4+ e CD8+, le cellule T γδ, le cellule B, le cellule natural killer (NK) e i monociti nelle cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC). Dopo l'incubazione delle cellule con anticorpi coniugati con fluorocromo contro i marcatori di superficie, i sottogruppi cellulari vengono identificati utilizzando una strategia di gating citofluorimetrico ottimale.

Un test di citometria a flusso per identificare sottogruppi di cellule immunitarie nelle cellule mononucleate del sangue periferico

Qui si descrive un metodo efficace per l'isolamento, l'identificazione e la purificazione delle cellule epiteliali del timo topo (TEC). Il protocollo può essere utilizzato per gli studi di funzione del timo per il normale sviluppo delle cellule T, la disfunzione del timo, e la ricostituzione delle cellule T.

Isolamento, identificazione e purificazione di cellule murine timica epiteliali

Descriviamo la preparazione di fette timici che, in combinazione con la citometria di flusso, possono essere utilizzate per modellare selezione positiva e negativa di sviluppare cellule T. Fette timo possono anche essere adattati per l'analisi in situ della migrazione thymocyte, localizzazione, e la segnalazione tramite immunofluorescenza e microscopia a due fotoni.

Preparazione e applicazioni di colture organotipiche timica Slice

La superficie oculare normale esposta è costituita da cornea e congiuntiva. Le cellule epiteliali, le cellule calde e le cellule immunitarie sono presenti nella congiuntiva. Qui viene descritta una tecnica non invasiva di citologia di impronta usando un dispositivo di citologia di impressione e una citometria a flusso per analizzare le cellule immunitarie nella congiuntiva.

Un modo non invasivo per isolare e fenotipo le cellule della Conjunctiva

Qui, un protocollo per l'isolamento e la caratterizzazione di CD4+ cellula T sottoinsiemi da sangue periferico umano è descritto. Purificato CD4+ T-cellule sono analizzate tramite flusso cytometry per determinare le proporzioni dei sottoinsiemi delle cellule helper T-follicolare.

Isolamento di CD4+ T-cellule e analisi della circolazione follicolare T Helper (cTfh) sottoinsiemi di cellule da sangue periferico mediante citometria a flusso di 6 colori

Qui, presentiamo un protocollo per preparare singole cellule da timo murino, pancreatico drenante linfonodi e milza per studiare ulteriormente queste cellule mediante citometria a flusso. Inoltre, questo protocollo è stato utilizzato per determinare le sottopopolazioni di cellule T regolatorie mediante citometria a flusso.

Determinazione dei sottoinsiemi di regolamentazione delle cellule T nel timo murino, pancreatico drenante linfonodi e milza mediante citometria a flusso

Qui, presentiamo un protocollo di cytometric di flusso per identificare CD4+ e CD8+ T cellule, γδ T, cellule B, cellule NK e monociti nel sangue periferico umano utilizzando solo due fluorocromi anziché sette. Con questo approccio, cinque ulteriori marcatori possono essere registrati sulla maggior parte dei citometri a flusso.

Discriminazione dei sette sottoinsiemi delle cellule immuni di due-fluorocromo flusso Cytometry

Descriviamo qui una semplice analisi dell'eterogeneità del compartimento delle cellule B immunitarie murine nel peritoneo, nella milza e nei tessuti del midollo osseo mediante citometria a flusso. Il protocollo può essere adattato ed esteso ad altri tessuti di topo.

Caratterizzazione citometrica a flusso dello sviluppo delle cellule B murine

Questo protocollo descrive l'isolamento dei timociti doppi negativi dal timo di topo seguito da trasduzione retrovirale e co-coltura sul sistema di co-coltura della linea cellulare stromale del midollo osseo a 4 esprimenti delta (OP9-DL4) per ulteriori analisi funzionali.

Co-coltura e trasduzione di timociti murini su cellule stromali esprimenti delta-like 4 per studiare oncogeni nella leucemia a cellule T

Descriviamo i protocolli per la preparazione di sospensioni a singola cellula di cellule epiteliali timiche-di topo e la colorazione di molecole intracellulari per l'analisi citofluorimetrica.

Preparazione di sospensioni unicellulari di cellule epiteliali timiche di topo e colorazione di molecole intracellulari per analisi citofluorimetrica

Scopri l'esame di selezione timica positiva e negativa mediante citometria a flusso in topi geneticamente modificati. Questo metodo permette di analizzare lo sviluppo dei linfociti T e identificare le popolazioni cellulari specifiche.

Esame di Selezione timica positivi e negativi per Citometria a Flusso

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