Una descrizione visiva della dissezione del sistema vascolare di superficie cerebrale e Meningi associate, e del plesso coroide da cervello di ratto

L'obiettivo generale di questa procedura è dissezionare in modo efficiente e rapido la porzione di meningi costituita dalla pie e dall'aracnoide e dalla relativa vascolarizzazione arteriosa, sovrapposta alla superficie della corteccia telencefalica e del mesencefalo, talamo e corpi callosi, nonché isolare il plesso coroideo dai ventricoli laterali. Questo risultato si ottiene innanzitutto rimuovendo la ghiandola pineale e separando le meningi e gli alberi arteriosi adiacenti al telencefalo. In secondo luogo, si rimuovono con attenzione le arterie e le arteriole presenti sulla superficie corticale, partendo dal circolo arterioso ventrale di Willis e procedendo quindi verso le superfici corticali dorsali, in modo che la pie e le membrane aracnoidee residue rimangano attaccate alla vascolarizzazione, avendo cura di minimizzare il prelievo di tessuti corticali superficiali adiacenti.

Successivamente, la corteccia e le fibre commissurali vengono dissezionate dal setto e dall'ippocampo, esponendo i ventricoli laterali per consentire il prelievo del plesso coroideo. Infine, l'ippocampo viene rimosso, esponendo il talamo e i collicoli del mesencefalo. Le meningi e la vascolarizzazione associata sovrastanti questa regione vengono quindi dissezionate.

Alla fine, l'integrità e la specificità delle meningi dissezionate e della relativa vascolarizzazione arteriosa, nonché del plesso coroideo, possono essere determinate confrontando i profili di espressione genica di ciascuna di queste regioni. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nella ricerca relativa alla vascolarizzazione che sostiene la funzione cerebrale. Include similitudini, confronti e differenze nella funzione del plesso coroideo rispetto alle meningi e alla relativa vascolarizzazione arteriosa in relazione al flusso ematico, alla funzione del liquido cerebrospinale, agli insulti neurotossici e al trauma cerebrale.

Per iniziare questo protocollo, posizionare i cervelli appena rimossi da ratti immediatamente dopo l'eutanasia in soluzione salina normale fredda di ghiaccio per cinque minuti. È importante permettere al cervello di raffreddarsi per questo periodo di tempo prima della dissezione, in modo che le quattro meningi cerebrali e la vascolarizzazione arteriosa associata o MAV possano essere separate dalla superficie della corteccia. Successivamente, posizionare il cervello sul fondo di una piastra di Petri di vetro appoggiata sul ghiaccio con un centimetro di soluzione salina normale fredda di ghiaccio o soluzione salina tampone fosfato di sodio 0,1 molare a un pH di 7,4.

Tutta la dissezione deve essere eseguita con il cervello, per la maggior parte immerso in soluzione salina. Per iniziare la dissezione, posizionare il cervello con il lato dorsale rivolto verso l'alto nella piastra di Petri e individuare la ghiandola pineale, situata nella regione ventrale più caudale tra i due emisferi, appena rostrale rispetto al cervelletto e appena al di sotto, o in superficie, alle meningi.

Oltre i colli. Rimuovere la ghiandola pineale utilizzando due pinzette con punta leggermente ricurva. Si noti che la ghiandola pineale è di colore rosa, simile alla corteccia, ma è spesso circondata da residui di sangue e vascolarizzazione derivanti dall'asportazione del cervello.

Successivamente, capovolgere il cervello a testa in giù nella piastra di Petri. Poi separare l'arteria vertebrale e le arterie più piccole e le meningi che ricoprono il ponte dalle meningi e dalla vascolarizzazione del proencefalo. Successivamente, iniziare la rimozione del MAV.

È importante iniziare ventralmente il processo di dissezione con le principali arterie del circolo di Willis, le arterie cerebrali medie e le arterie anteriori. Successivamente, partendo da uno qualsiasi dei due emisferi, utilizzare pinze con punta leggermente ricurva per recidere l'arteria comunicante posteriore appena posteriormente alla giunzione con l'arteria carotide interna, separando così gli alberi arteriosi più anteriori da quelli posteriori del proencefalo. Ripetere quindi lo stesso procedimento per l'emisfero controlaterale.

Ora, afferrando l'arteria cerebrale media (MCA) e l'arteria anteriore con la pinzetta, tirare delicatamente in direzione anteriore dorsale in modo che la membrana aracnoidea ventrale (MAV) che ricopre la corteccia anteriore ventrale venga sollevata sopra e intorno al tratto olfattivo. Questo permette di rimuovere gran parte della MAV che ricopre la corteccia anteriore. Ruotare il cervello ad un angolo compreso tra 45 e 90 gradi rispetto alla piastra di Petri in modo che le regioni laterali più anteriori della MAV che circondano le aree corticali laterali possano essere liberate dalla corteccia; afferrare quindi la MCA e le arterie associate e tirare delicatamente in direzione dorsale lungo la corteccia.

Se necessario, le estremità della pinzetta possono essere utilizzate per sollevare e liberare le arterie principali dalla corteccia durante la dissezione. A questo punto, rimuovere le regioni laterali più posteriori del MAV. Si noti che è preferibile passare da un emisfero all'altro durante questa procedura di raccolta per garantire che il MAV rimanga freddo e idratato; cambiare emisfero anche se si incontra resistenza nel liberare il MAV dalla corteccia.

Infine, per rimuovere le regioni più dorsali della MAV circostante la corteccia somatosensoriale primaria e la corteccia motoria, posizionare il cervello con il lato dorsale rivolto verso l'alto per staccare questa sezione dal cervello, utilizzando le punte della pinzetta lungo il seno sagittale. Questa porzione della MAV raccolta può essere temporaneamente conservata in soluzione salina ghiacciata fino al momento dell'uso per analisi e test, oppure congelata per un successivo processamento. Spesso la MAV che ricopre le regioni corticali più posteriori rimane attaccata.

La sua rimozione è mostrata in una sezione successiva di questo video. Per rimuovere il plesso coroideo, posizionare innanzitutto il cervello con il lato dorsale rivolto verso l'alto e tenerlo fermo con le pinzette più grandi. Quindi spingere le pinzette più piccole attraverso la linea mediana tra gli emisferi e utilizzarne le estremità per perforare la corteccia e il corpo calloso fino a raggiungere la parte superiore della linea mediana dell'ippocampo.

Successivamente, utilizzare la pinzetta per staccare la corteccia con il corpo calloso dall'ippocampo dorsale e dal setto, esponendo la maggior parte del ventricolo laterale. Il plesso coroideo può essere localizzato e identificato dalla linea rossa ondulata che delimita l'arteria principale che si estende lungo il suo asse. Utilizzare le due estremità della pinzetta per sollevare le pareti laterali del terzo ventricolo e allargarlo all'estremità più profonda.

Quindi, utilizzando la pinzetta piccola, staccare questo estremo del plesso coroideo. Successivamente, usare la pinzetta per allargare la regione anteriore tra il setto e la regione del putamen caudato e staccare anche l'estremo del plesso coroideo. Eseguire lo stesso procedimento sull'emisfero controlaterale per ottenere il secondo plesso coroideo rimanente.

Anche in questo caso, il tessuto può essere temporaneamente conservato in ghiaccio, soluzione salina fredda o congelato per un successivo trattamento. Per rimuovere il MAV residuo che ricopre le regioni coddle più posteriori della corteccia, rimuovere innanzitutto l'intero ippocampo da entrambi gli emisferi, esponendo così il MAV sopra il talamo e i collicoli. Si noti che la rimozione di questa porzione del MAV sarà molto meno difficoltosa rispetto alla rimozione del MAV residuo dalla corteccia.

Afferrando la vascolarizzazione più ampia che sovrappone la porzione anteriore del talamo e tirando delicatamente verso il basso, si nota che questa vascolarizzazione è connessa alla rete sopracorticale e fornisce sangue alla rete dell'ippocampo dorsale e del talamo dorsale. Tirare con delicatezza allontanando la struttura fino a quando la rete sopracorticale non sarà liberata, permettendo poi di raggiungere le ultime porzioni del circolo arterioso coddle. A questo punto, è necessario prestare maggiore attenzione per rimuovere qualsiasi MAV residuo sulla superficie delle cortici primarie granulari retrolineari, uditive e visive.

Qualsiasi restante MAV corticale ventrale posteriore raccolto con questa seconda sezione di MAV talamico e del corpo calloso deve essere rimosso e aggiunto alla prima sezione di MAV corticale dissezionata, se si intende analizzarli separatamente. Successivamente, per confrontare i profili di espressione genica tra lo striato, la corteccia parietale e le regioni di MAV in condizioni di controllo, è possibile eseguire un'analisi dell'espressione genica utilizzando matrici oligonucleotidiche Agilent 0 1 4 8 7 9 per l'intero genoma del ratto, quattro per 44.060 mer. Ulteriori dettagli riguardo alla lavorazione, scansione e archiviazione iniziale dei dati sono disponibili in Thomas et al.

Quando la dissezione viene eseguita correttamente, i tessuti MAV risultanti dovrebbero presentarsi come due entità integre dal peso totale compreso tra 35 e 45 milligrammi. La porzione MAV inizialmente dissezionata, che circonda la maggior parte della corteccia, dovrebbe pesare circa 25 milligrammi, mentre quella che ricopre il talamo, i corpi callosi e la corteccia occipitale dovrebbe pesare circa 15 milligrammi.

Il tessuto dovrebbe avere un colore leggermente rosato a causa del sangue residuo nei vasi. Il plesso coroideo bilaterale raccolto dovrebbe essere costituito da due campioni di tessuto integri, ciascuno del peso di uno o due milligrammi come mostrato qui. Qui osserviamo un confronto tra i profili di espressione genica nello striato, nella corteccia parietale e nel MAV in condizioni di controllo.

Il grafico superiore mostra l'espressione nello striato rispetto alla corteccia parietale. Mentre il grafico inferiore mostra l'espressione nel MAV rispetto alla corteccia parietale, si può osservare che lo striato e la corteccia parietale sono molto più strettamente correlati tra loro rispetto al MAV. Qui vediamo l'espressione genica differenziale nel MAV in risposta all'ipertermia rispetto al controllo, in risposta all'anfetamina rispetto al controllo e nell'ipertermia rispetto all'anfetamina.

Infine, qui osserviamo geni con un'espressione superiore a 15 volte nel MAV rispetto alla corteccia parietale e al corpo striato, caratterizzati in base alla funzione. Molti di questi geni sono associati al sistema vascolare e/o al sistema immunitario. Altri geni con variazioni molto elevate sono proteine della matrice extracellulare, trasportatori di sali, e geni coinvolti nel metabolismo dei lipidi e dell'acido retinoico.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di essere pazienti durante la dissezione del MAV. È inoltre fondamentale mantenere il cervello immerso in soluzione salina isotonica o in soluzione salina tamponata al fosfato per tutta la durata della dissezione. Si consiglia anche di esercitarsi nel sezionamento del MAV su quattro o cinque ratti prima di ottenere i tessuti per la generazione di dati sperimentali.