Una descrizione visiva della dissezione del sistema vascolare di superficie cerebrale e Meningi associate, e del plesso coroide da cervello di ratto

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di sezionare in modo efficiente e rapido le porzioni di buccia e aracnoide delle meningi e la vascolarizzazione arteriosa associata, sovrapponendo la superficie della corteccia del proencefalo e del mesencefalo, del talamo e dei calli, nonché di prelevare il plesso coroideo dai ventricoli laterali. Ciò si ottiene rimuovendo prima la ghiandola pineale e separando le meningi e gli alberi arteriosi coccolano il proencefalo. In secondo luogo, le arterie e le arterie sulla superficie corticale vengono accuratamente rimosse, a partire dal circolo ventrale di Willis, e poi procedendo verso le superfici corticali dorsali in modo che la buccia e le restanti membrane aracnoidei rimangano attaccate al sistema vascolare, assicurandosi di ridurre al minimo la raccolta dei tessuti superficiali corticali adiacenti.

Successivamente, la corteccia e le fibre commissurali vengono sezionate lontano dal setto e dall'ippocampo, esponendo i ventricoli laterali per consentire il prelievo del plesso coroideo. Infine, l'ippocampo viene rimosso, esponendo il talamo e i calli del mesencefalo. Le meningi e il sistema vascolare associato sovrastante questa regione vengono quindi sezionati.

In definitiva, l'integrità e la specificità delle meningi sezionate e della vascolarizzazione arteriosa associata, nonché del plesso coroideo, possono essere determinate confrontando i profili di espressione genica di ciascuna di queste regioni. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella ricerca relativa al vascolare che supporta la funzione cerebrale. Include somiglianze, confronti e differenze nella funzione del plesso coroideo rispetto alle meningi e alla sua vascolarizzazione arteriosa associata rispetto al flusso sanguigno, alla funzione del liquido cerebrospinale, agli insulti neurotossici e ai traumi cerebrali.

Per iniziare questo protocollo, posizionare i cervelli appena rimossi dai ratti subito dopo che sono stati soppressi in soluzione salina ghiacciata e normale per cinque minuti. È importante lasciare che il cervello si raffreddi per questo periodo di tempo prima della dissezione, in modo che le quattro meningi cerebrali e la vascolarizzazione arteriosa associata o MAV possano essere separate dalla superficie della corteccia. Quindi posizionare il cervello sul fondo di una capsula di Petri di vetro appoggiata sul ghiaccio con un centimetro di ghiaccio, soluzione salina fredda, normale o soluzione salina tamponata con fosfato di sodio molare 0,1 molare a un pH di 7,4.

Tutte le dissezioni devono essere eseguite con il cervello, per lo più immerso in soluzione salina. Per iniziare la dissezione, posizionare il lato dorsale del cervello verso l'alto nella capsula di Petri e localizzare la ghiandola pineale, che si trova nella regione ventrale più stretta tra i due emisferi. Solo rostrale al cervelletto e appena sotto, o alla superficie delle meningi.

Oltre i colli. Rimuovere la ghiandola pineale utilizzando due piccole pinze a punta piegata. Si noti che la ghiandola pineale è di colore rosa come la corteccia, ma è spesso circondata da resti di sangue residuo e vascolarizzazione dalla rimozione del cervello.

Quindi, capovolgi il cervello nella capsula di Petri. Quindi separare l'arteria vertebrale e le arterie più piccole e le meningi che coprono il ponte dalle meningi e dalla vascolarizzazione del proencefalo. Successivamente, avvia la rimozione del MAV.

È importante iniziare ventralmente il processo di dissezione con le arterie principali del circolo di Willis, le arterie cerebrali medie e le arterie anteriori. Successivamente, partendo da entrambi gli emisferi, utilizzare piccole pinze a punta piegata per recidere l'arteria comunicante posteriore appena dietro la giuntura carotide interna, separando così gli alberi arteriosi più anteriori e posteriori del proencefalo. Quindi ripetere lo stesso processo per l'emisfero controlaterale.

Ora, afferrando l'MCA e l'arteria anteriore con la pinza, tirare delicatamente in direzione dorsale anteriore in modo che il MAV che copre la corteccia anteriore ventrale venga sollevato sopra e intorno al tratto olfattivo. Questo rimuove gran parte del MAV che copre la corteccia anteriore. Ruotare il cervello con un angolo da 45 a 90 gradi rispetto alla capsula di Petri in modo che le regioni laterali più anteriori del MAV che circondano le regioni corticali laterali possano essere liberate dalla corteccia, afferrare l'MCA e le arterie associate e tirare delicatamente dorsalmente lungo la corteccia.

Se necessario, le estremità della pinza possono essere utilizzate per sollevare e liberare le arterie principali dalla corteccia durante la dissezione. Ora, rimuovi le regioni laterali più posteriori del MAV. Si noti che è meglio passare da un emisfero all'altro durante questo processo di raccolta per garantire che il MAV rimanga freddo e idratato, anche cambiare emisfero se si incontra una resistenza nel liberare il MAV dalla corteccia.

Infine, per rimuovere le regioni più dorsali del MAV che circondano la corteccia somatosensoriale e motoria primaria, girare il lato dorsale del cervello verso l'alto per liberare questa sezione dal cervello, utilizzare le estremità delle pinze lungo il seno sagittale. Questa parte del MAV raccolto può essere conservata temporaneamente in soluzione salina ghiacciata fino a quando non è necessaria per il test e l'analisi, oppure congelata per una successiva lavorazione. Spesso il MAV che copre le regioni più posteriori della corteccia rimane attaccato.

La sua rimozione è mostrata in una sezione successiva di questo video. Per rimuovere il plesso coroideo in prima posizione, il cervello con il lato dorsale rivolto verso l'alto e tenerlo in posizione con la pinza più grande. Quindi spingi le pinze più piccole verso il basso attraverso la linea mediana tra gli emisferi e usa le estremità per perforare la corteccia e il corpo calloso nella parte superiore della linea mediana dell'ippocampo.

Quindi, usa il forcipe per allontanare la corteccia con il calloso dall'ippocampo dorsale e dal setto esponendo la maggior parte del ventricolo laterale. Il plesso coroideo può essere localizzato e identificato dalla linea rossa ondulata che delimita l'arteria principale che corre per la sua lunghezza. Usa le due estremità della pinza per fare leva sulle pareti laterali del terzo ventricolo e allargarlo alla sua estremità più coccolata.

Quindi, usando la piccola pinza, libera questa estremità del plesso coroideo. Successivamente, usa la pinza per allargare la regione anteriore tra il setto e la regione del putamen caudato e libera anche il plesso coroideo a questa estremità. Eseguire la stessa procedura anche sull'emisfero controlaterale per ottenere il secondo plesso coroideo rimasto.

Anche in questo caso, questo tessuto può essere conservato temporaneamente in ghiaccio, freddo, soluzione salina o congelato per una successiva lavorazione. Per rimuovere il MAV rimanente che copre le regioni più posteriori della corteccia, in primo luogo, rimuovere l'intero ippocampo da entrambi gli emisferi esponendo il MAV sul talamo e sui collicoli. Si noti che la rimozione di questa porzione del MAV sarà molto meno difficile della sua rimozione dalla corteccia per il MAV rimanente.

Afferrando la vascolarizzazione più grande che sovrasta la porzione anteriore del talamo e tirando delicatamente con delicatezza, questa vascolarizzazione è collegata alla rete cocurriculare Supra e fornisce sangue all'ippocampo dorsale e alla rete del talamo dorsale. Allontana con cautela e alla fine la rete sopraelevante verrà liberata e le ultime porzioni del circolo arterioso di coccola potranno essere raggiunte. A questo punto, è necessario prestare maggiore attenzione per rimuovere qualsiasi MAV rimanente sulla superficie delle cortecce primarie lineari, uditive e visive retrolineari granulari.

Qualsiasi MAV corticale ventrale posteriore rimanente prelevato con questa seconda sezione di MAV talamica e callica deve essere rimosso e aggiunto alla prima sezione di MAV corticale sezionato se deve essere analizzato separatamente. Successivamente, per confrontare i profili di espressione genica tra la corteccia parietale dello striato e le regioni MAV in condizioni di controllo, l'analisi dell'espressione genica può essere eseguita utilizzando l'intero genoma di ratto Agilent 0 1 4 8 7 9, quattro per 44, 060 array di oligonucleotidi mer. Ulteriori dettagli sull'elaborazione, la scansione e l'archiviazione iniziale dei dati sono disponibili in Thomas et al.

Quando la dissezione viene eseguita correttamente. I tessuti MAV risultanti dovrebbero essere in due entità intatte del peso di circa 35-45 milligrammi in totale. Il MAV inizialmente sezionato che circonda la maggior parte della corteccia dovrebbe pesare circa 25 milligrammi e quello che copre il talamo, i calli e la corteccia occipitale dovrebbe pesare circa 15 milligrammi.

Il tessuto deve essere leggermente di colore rosato a causa del sangue residuo nel sistema vascolare. Il plesso coroideo bilaterale prelevato deve essere raccolto in due campioni di tessuto intatti, ciascuno del peso di uno o due milligrammi, come si vede qui. Qui vediamo un confronto dei profili di espressione genica nella corteccia parietale striata e MAV in condizioni di controllo.

Il grafico in alto mostra l'espressione nello striato rispetto alla corteccia parietale. Mentre il grafico inferiore mostra l'espressione nel MAV rispetto alla corteccia parietale, si può vedere che lo striato e la corteccia parietale sono molto più strettamente correlati tra loro rispetto al MAV. Qui vediamo l'espressione genica differenziale nel MAV in risposta all'ipertermia rispetto al controllo, in risposta all'anfetamina rispetto al controllo e nell'ipertermia rispetto all'anfetamina.

Infine, qui vediamo geni con un'espressione maggiore di 15 volte nel MAV rispetto alla corteccia parietale e allo striato caratterizzati da funzione. Molti di questi geni sono correlati al sistema vascolare e/o al sistema immunitario. Altri geni con cambiamenti di piega molto grandi sono le proteine della matrice extracellulare, i trasportatori del sauto e il metabolismo dei lipidi e dell'acido retinoico.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di essere pazienti durante la dissezione del MAV. È anche importante che il cervello rimanga immerso in soluzione salina isotonica o soluzione salina tamponata con fosfato durante l'intera dissezione. Inoltre, si consiglia di esercitarsi con la sezione del MAV su quattro o cinque ratti prima di ottenere tessuti per la generazione di dati sperimentali.