Etichettatura selettiva di proteine ​​della superficie cellulare utilizzando CyDye DIGE Coloranti Fluor Minimal

Mi chiamo Maria e lavoro presso Y Healthcare a NOS in Svezia. Le proteine della superficie cellulare sono spesso coinvolte nella comunicazione tra le cellule e il loro ambiente e sono quindi di particolare interesse nella ricerca, con l'obiettivo di ottenere maggiori informazioni sulle malattie e su altre variazioni biologiche indotte dai cambiamenti nell'ambiente cellulare. In questo video ti mostrerò un semplice protocollo di marcatura della superficie cellulare con schivata laterale e sarai in grado di arricchire visivamente queste proteine a bassa abbondanza senza miglioramento fisico e studiare le differenze di queste proteine della superficie cellulare con la tecnologia.

Se trovi interessante questa tecnologia, puoi trovare maggiori informazioni nel manuale 2D. Inoltre, abbiamo una nota applicativa su questo particolare argomento che puoi scaricare da job Nel protocollo di etichettatura della superficie cellulare visto in alto, si etichettano le cellule mentre sono ancora intatte. Durante il processo di etichettatura, il colorante avrà accesso solo alle proteine della superficie cellulare.

Dopo la fase di etichettatura, le cellule vengono analizzate per verificare l'etichettatura specifica della superficie cellulare. Il campione marcato è stato frazionato in proteine di membrana e citosoliche. In parallelo è stato preparato un campione non frazionato.

Per confronto, questa analisi di frazionamento non è necessaria, ma è stata eseguita qui solo per dimostrare che il protocollo della superficie cellulare è specifico per le punte pro della superficie cellulare. Abbiamo anche eseguito il protocollo standard di etichettatura ETH non dietetica visto sotto le cellule sono bugie prima della marcatura, e in questo modo tutte le proteine cellulari sono accessibili per la marcatura. Dopo la fase di etichettatura, i campioni vengono sottoposti a elettroforesi 2D.

Le cellule aderenti vengono staccate utilizzando una procedura non enzimatica per evitare la digestione delle proteine della superficie cellulare bersaglio. In questo protocollo, usiamo il poliziotto di gomma, ma l'uso di mezzi di dissociazione enzimatica a tre cellule è anche un'opzione per contare e dividere le sospensioni cellulari in quas da cinque a 10 milioni di cellule per provetta. Le cellule vengono quindi pellettate e lavate in H-P-S-S-P-H 7.4 per rimuovere le tracce di coltura cellulare.

La contaminazione dei terreni da proteine del siero e componenti fluorescenti può interferire con l'etichettatura e il rilevamento. Le cellule che crescono in sospensione vengono pellettate e lavate direttamente prima della fase di marcatura dopo il lavaggio. La tavolozza cellulare viene risospesa in 200 microlitri di tampone per marcatura a freddo contenente HPSS pH 8,5 e un molare di uria.

Per condizioni ottimali di marcatura delle proteine della superficie cellulare, controllare sempre il pH. Prima dell'etichettatura, abbiamo utilizzato 600 picchetti per 10 milioni di celle CHO. Il rapporto ottimale tra l'occhio laterale e il numero di cellule varia a seconda del tipo di cellula.

Dal momento che non conosciamo le esatte concentrazioni di proteine sulla superficie cellulare. Come determinare le condizioni ottimali per l'etichettatura laterale delle proteine è descritto nel manuale sui principi e i metodi dell'elettroforesi 2D. Le celle vengono incubate con l'occhio laterale D sul pavimento, dadi minimi per 20 minuti su ghiaccio al buio.

Dopo la reazione di marcatura, il colorante non reattivo viene spento aggiungendo 20 microlitri di lisina 10 millimolare. Le celle di marcatura vengono ora lavate due volte in tampone freddo HPSS pH 7.4 per rimuovere l'occhio laterale in eccesso. Non ci sarà quindi più colorante libero per la marcatura intracellulare o le proteine indesiderate nella fase successiva, che è la lisi cellulare.

Le proteine sulla superficie cellulare vengono ora marcate e le cellule vengono lavate e pronte per essere luccicate. Il pellet della fase di lavaggio persa viene risospeso in un tampone di lisi a freddo da 150 microlitri contenente sette molari di uria, due molari di tiuria, 4% di alberi da 30 millimolari, cinque millimolari di acetato di magnesio a pH 8,5 e lasciato in ghiaccio per almeno un'ora con occasionale vortice che si affatica. I campioni sono ora pronti per la separazione 2D.

Il primo passo verso l'elettrolisi consiste nel preparare le strisce IPD per la reidratazione. Preparare la soluzione di reidratazione distrettuale aggiungendo un tampone IPG corrispondente all'intervallo di pH delle strisce utilizzate e aggiungere la soluzione nella lente del vassoio di reidratazione. Rimuovere la pellicola protettiva della striscia IPG e posizionare le strisce con cura con un gel essiccato rivolto verso il basso nella vaschetta di reidratazione contenente la soluzione reidratante.

Chiudere il coperchio della confezione IPG e reidratare le strisce durante la notte. Nella prima dimensione, focalizzazione isoelettrica, le proteine sono separate in base al loro pi greco. Questa operazione viene eseguita utilizzando l'IPG quattro tre.

Le strisce reidratate vengono posizionate nel collettore e l'elettrodo viene montato sulla parte superiore. 50 microgrammi da ciascun campione sono stati applicati utilizzando i tappi di applicazione del campione. Abbiamo applicato direttamente campioni non frazionati senza frazionamento preliminare o frazionato i campioni in frazioni di membrana e citosoliche prima di essere applicati.

L'elettrocatetere è chiuso per proteggere i campioni fluorescenti dalla luce. Lo strumento è stato programmato secondo le raccomandazioni e fatto funzionare durante la notte. I gel lamby grandi al 12% erano costati utilizzando il gel 12 per adulti.

È stata aggiunta la soluzione di spostamento Coster per evitare la polimerizzazione di gel acry nei tubi. I gel sono stati lasciati polimerizzare per una notte a temperatura ambiente prima dell'uso. Dopo la focalizzazione isoelettrica, le strisce vengono rimosse e bilanciate in SDS contenente tampone in due fasi utilizzando DTT per ridurre i legami di solfuro dei residui di cisteina seguiti da alchilazione con acetamide per evitare modifiche da parte dell'acrilammide.

Le strisce IPG sono immerse nel tampone di scorrimento e posizionate con cura sopra i due grandi gel di scavo. Evitare di intrappolare l'aria tra le strisce e il gel sigillato aggiungendo una soluzione agro fusa al 2% con blu di bromo anolo sulla parte superiore. I gel sono ora pronti per la separazione delle pagine SDS di seconda dimensione Nella pagina SDS di seconda dimensione.

Le proteine saranno separate in base al peso molecolare e questo viene eseguito con il sistema a sei tonali. Riempire la camera di elettroforesi con il tampone di corsa anodico, inserire i gel e riempire lo scomparto superiore con il programma del tampone di corsa catodico. L'alimentazione secondo le raccomandazioni e far funzionare la seconda dimensione protetta dalla luce per circa quattro o cinque ore o fino a quando il fronte del colorante raggiunge il fondo del gel.

Dopo l'elettroforesi di seconda dimensione, le cassette di gel vengono posizionate utilizzando le pinze nell'imager fluorescente del tifone. È possibile eseguire la scansione simultanea di due gel e tre canali. Il risultato di questi due DL mostra un'alta risoluzione delle proteine di membrana nel campione, anche se ci sono alcune restrizioni note per le proteine idrofobiche da rilevare in A due DL. I risultati mostrano molte nuove macchie di etichetta sulla superficie cellulare mostrate qui in rosso che non vengono rilevate utilizzando il protocollo di marcatura standard mostrato qui in verde.

Questi risultati mostrano che il protocollo di marcatura della superficie cellulare è altamente specifico per la marcatura delle proteine della superficie cellulare. Poiché le proteine della superficie cellulare sono marcate esclusivamente, sono più facilmente visualizzabili e si evita l'attenuazione da parte di abbondanti proteine citosoliche. L'immagine fluorescente dei gel con frazione di membrana non frazionata o frazione citosolica è mostrata in alto.

Di seguito è riportata un'immagine della stessa colorazione post gel con argento. I risultati non mostrano alcuna marcatura fluorescente delle proteine citosoliche, ma la colorazione con argento mostra che ci sono proteine nei gel. I risultati mostrano anche modelli di mappe spot simili da frazioni non frazionate e di membrana, dimostrando che non è necessario il frazionamento prima dell'elettroforesi 2D, il che rende questo protocollo semplice e conveniente.

SI due, SI tre e SCI cinque mostrano modelli di etichettatura simili e sono tutti compatibili con il protocollo di superficie delle cellule. È stato eseguito un esperimento dietetico utilizzando tutti e tre i lati dell'occhio DI floor minimum dy per studiare l'espressione differenziale delle proteine della superficie cellulare nelle cellule CHO della carenza di siero per diversi periodi di tempo. CY, due campioni di superficie cellulare da tutti i campioni dell'esperimento sono stati raggruppati e utilizzati come standard interno.

I cambiamenti differenziali di diverse proteine della superficie cellulare potrebbero essere seguiti durante il periodo di fame. Oltre 18 nuove proteine di membrana sono state rilevate utilizzando il protocollo della superficie cellulare che non sono state rilevate con il protocollo standard per trovare l'identità delle proteine nel gel preparativo. È stato necessario eseguire il picco con il campione di superficie cellulare per facilitare la corrispondenza con i punti sul set di dati analitico.

Ci sono risultati. I risultati mostrano un'alta risoluzione di un gran numero di proteine della superficie cellulare. Questo protocollo è molto specifico per le proteine della superficie cellulare e non è stata osservata alcuna marcatura delle proteine intracellulari.

Con questo metodo, sei in grado di rilevare più proteine della superficie cellulare rispetto a un protocollo standard e, come hai già visto, è un protocollo molto semplice da eseguire. È sufficiente etichettare le proteine della superficie cellulare mentre sono ancora intatte ed eseguirle direttamente sull'elettroforesi 2D senza frazionamento della membrana. Quindi questo è un ottimo protocollo per studiare le proteine della superficie cellulare e le differenze di quelle con la tecnologia D.