Visualizzare batteri nei nematodi usando la microscopia a fluorescenza

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare la simbianza batterica marcata in fluorescenza all'interno del loro ospite nematode. Ciò si ottiene marcando prima i batteri con una proteina fluorescente attraverso la coniugazione. Il secondo passo consiste nell'isolare i nematodi AIC raccogliendo le uova.

Successivamente, i nematodi AIC vengono coltivati in combinazione con il loro simbiante batterico marcato in fluorescenza per consentire l'associazione naturale in ultima analisi la localizzazione del simbiante batterico all'interno del nematode ospite. E la frequenza di questa associazione all'interno della popolazione di nematodi può essere determinata dalla microscopia a fluorescenza. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della simbiosi, ad esempio dove si localizzano i batteri all'interno del loro ospite e qual è la distribuzione del trasporto batterico in una popolazione ospite?

Dopo la crescita notturna dei ceppi batterici, della sottocoltura, del ceppio ricevente e aiutante del donatore in terreni di crescita ricchi di nutrienti privi di antibiotici in un rapporto da uno a 100 tra coltura e terreno, quindi far crescere le colture alla temperatura appropriata per ciascun ceppo fino a raggiungere la fase di crescita a metà logaritmico. Quindi, combinare i ceppi in un'unica provetta da microcentrifuga e centrifugare le colture miste per due minuti a 17, 900 Gs, decantare il surnatante e versare il pellet in 30 microlitri di terreno fresco. Quindi posizionare la sospensione su una piastra ricca di sostanze nutritive senza antibiotici e lasciare asciugare la macchia quando la sospensione si è asciugata.

Incubare la piastra capovolta per una notte a una temperatura ottimale per il batterio ricevente e consentita per il donatore e l'aiutante, se applicabile. Ora, raschiare il punto e la striscia per singole colonie su una piastra antibiotica selettiva per ottenere una coltura pura di strisce batteriche, una singola colonia per l'isolamento. Infine, assicurati che le colonie risultanti siano il simbiante ricevente e non il ceppo donatore.

Mediante screening per la presenza di fenotipi specifici del ricevente. Ad esempio, i batteri cino abdi possono essere distinti dall'e coli eseguendo un test catalizzatore schermato per la presenza del plasmide confermando la fluorescenza sotto la lunghezza d'onda corrispondente alla proteina plasmidico fluorescente. Dopo aver coltivato il simbiante batterico naturale durante la notte, distribuire 600 microlitri di coltura batterica su 8-10, 10 millimetri di aerato lipidico, quindi incubare le piastre al buio senza umidità a 25 gradi Celsius.

Dopo due giorni, aggiungere 5.000 nematodi giovani infettivi in 500 microlitri di terreno ai prati batterici. Dopo aver incubato le piastre a 25 gradi Celsius per altri tre giorni, posizionare 20 microlitri di acqua su un vetrino da microscopio. Quindi usa un bastoncino sterile per raschiare una piccola quantità di nematodi dal prato batterico.

Metti il bastoncino nell'acqua per permettere ai nematodi di nuotare via. Guarda questa diapositiva a basso ingrandimento. Se sono visibili uova e femmine, continuare quando le femmine contengono uova, posizionare qualche millilitro d'acqua sulla superficie dei piatti, agitare delicatamente i piatti e poi versare l'acqua in un tubo conico da 50 millilitri.

I nematodi dovrebbero staccarsi dalle placche e non essere più visibili sulla superficie della piastra. Lasciare che i nematodi si depositino sul fondo del tubo, quindi convogliare l'acqua in eccesso dalla parte superiore del tubo e riempire nuovamente il tubo con acqua pulita. Dopo aver lasciato riposare i nematodi adulti e aver pipettato nuovamente l'acqua in eccesso, riempire i tubi conici con una soluzione di uova.

Quindi mescolare i tubi per inversione delicata per 10 minuti esatti a temperatura ambiente. Dopo aver agitato immediatamente centrifugare le provette coniche per 10 minuti esatti a 1, 250 Gs e temperatura ambiente con la pausa inserita. Quindi decantare rapidamente il surnatante, risospendere il pellet con la soluzione d'uovo pipettando e riempire il tubo conico con una soluzione d'uovo fresco.

Mescolare bene la sospensione dell'uovo capovolgendo il tubo da tre a cinque volte e poi dopo aver immediatamente pellettato gli ovuli e travasato il surnatante come appena mostrato. Risospendere il pellet in misoginia, brodo o LB mediante pipettaggio, quindi trasferire la sospensione di uova in una provetta conica da 15 millilitri. Ora riempi il tubo da 15 millilitri con libbre, lava le uova tre volte nel brodo usando la stessa tecnica del passo rapido appena dimostrata, quindi diluisci le uova di nematode P risospeso ad almeno 10 uova per microlitro.

Trasferisci le uova in una capsula di Petri di sei centimetri contenente cinque millilitri di LB e antibiotici contro i batteri colonizzatori. La piastra può essere conservata avvolta in perfil per un massimo di quattro giorni dopo la crescita notturna e la selezione dei batteri fluorescenti. Utilizzare uno stick sterile per distribuire 600 microlitri di coltura batterica su aerati lipidici da 10 millimetri e incubare la coltura a 25 gradi Celsius.

Dopo due giorni, erogare da 500 a 5.000 uova di nematode su ciascuna piastra lipidica. Se il piatto è stato conservato, lavare le uova in 15 millilitri di LB come appena dimostrato almeno una volta prima di inoculare le uova sui prati batterici precedentemente preparati. Quindi incubare le colture di batteri nematodi al buio senza umidità a 25 gradi Celsius fino a quando i giovani infettivi appaiono come un anello bianco sfocato sul bordo della piastra.

Quando sono stati osservati i giovani infettivi. Rimuovere il coperchio della piastra di agar lipidico e posizionare il fondo della piastra sul fondo di una piastra di Petri vuota da 100 millimetri per 20 millimetri. Quindi riempi la capsula di Petri con acqua sufficiente per arrivare a circa la metà dell'altezza della piastra più piccola e incuba la trappola d'acqua fino a quando i giovani infettivi della progenie non sono emersi nell'acqua.

Dopo aver raccolto i nematodi dall'acqua o nella fase di vita desiderata dal prato batterico appropriato, sciogliere alcuni grani di ole in 30 microlitri di acqua e a uno o due microlitri di questo agente paralizzante per ogni 50 microlitri di campione di nematodi. Quindi trasferire circa 20-30 microlitri del campione di nematode paralizzato su un vetrino da microscopio e posizionare un vetrino coprioggetti sopra il campione. Osserva i nematodi utilizzando la microscopia ottica per assicurarti che i nematodi siano nel campo visivo.

Identificare la localizzazione batterica. Fotografare i nematodi al microscopio a fluorescenza oltre all'impostazione della microscopia ottica, quindi sovrapporre le immagini. Potrebbe essere necessario provare diversi ingrandimenti e viste del nematode per trovare i batteri.

Una popolazione di nematodi provenienti da due terreni è stata contata e valutata per la colonizzazione da parte del simbiante batterico. Per ottenere statistiche affidabili, è meglio contare almeno 100 nematodi per campione, di cui almeno 30 che rientrano in ciascuna categoria, come si vede nella tabella. Questi nematodi sono colonizzati a un livello di circa il 14,6% se coltivati su agar lipidico e del 68,6% se coltivati su fegato, agar renale.

È stato dimostrato che altre specie di nematodi e batteri hanno diversi livelli di colonizzazione. Questo schema illustra l'aspetto generale delle femmine Steiner NEMA. L'inserto mostra l'immagine di contrasto interferenziale differenziale di una femmina grafica S con ingrandimento 20x.

La freccia nera nel riquadro indica la vulva, mentre le frecce bianche indicano le uova visibili. Questa immagine mostra un uovo di nematode volt sviluppato ma non schiuso con un ingrandimento di 40x, e queste uova isolate dai nematodi di Volta sono state riprodotte con un ingrandimento di 10x. Qui, in questa prima immagine, sono mostrate immagini rappresentative al microscopio dei nematodi Steiner Nima associati ai batteri Xeno aptus.

I nematodi di Alvin sono stati associati al loro expo batterico simbiante che esprime GFP per creare questa immagine composita. Un'immagine a contrasto di fase è stata sovrapposta a un'immagine fluorescente. La freccia indica i batteri presenti all'interno del nematode giovane infettivo.

Questa immagine mostra un nematode giovanile S carpa capsi con GFP che esprime X nla. L'immagine è stata costruita in modo simile all'immagine precedente e raffigura il giovane nematode con batteri marcati con proteine fluorescenti verdi visualizzate come i bastoncelli verdi localizzati in tutto il lume intestinale del nematode. Oltre alla procedura descritta, altri metodi come la manipolazione genetica del simbiante batterico prima dell'associazione con l'ospite nematode possono essere incorporati per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quali sono i meccanismi molecolari necessari per l'associazione del microbo ospite.