Name: Isolamento e caratterizzazione funzionale di Human ventricolare Cardiomyocytes da campioni freschi chirurgici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-21T15:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: Impara a isolare cardiomiociti ventricolari umani da campioni chirurgici freschi per studi elettrofisiologici e test farmacologici. Questo metodo consente di caratterizzare alterazioni funzionali nelle malattie cardiache.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo lavoro è stato sostenuto dall&#39;UE (STREP Progetto 241.577 &quot;GRANDE CUORE,&quot; 7 ° Programma quadro europeo, CP), Menarini internazionale Operations Luxembourg (AM), Telethon GGP07133 (CP) e Gilead Sciences (AM).

I protocolli sperimentali su tessuti umani sono stati approvati dal comitato etico di Careggi University-Hospital (2006/0024713; rinnoverà maggio 2009). Ogni paziente ha dato il consenso informato scritto. 1. Soluzioni agricole per la preparazione Le soluzioni sono descritte nella Tabella 1. Un diagramma di flusso semplificato della procedura di isolamento cellulare è situato nella Figura 1. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Soluzione </td><td> CP </td><td> DB </td><td> KB </td><td> TB </td><td> PS </td><td> EB1 </td><td> EB2 </td></tr><tr><td rowspan="23"> Reattivo (mm) </td><td> KH 2 PO 4 </td><td> 50 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 8 </td><td> 1.2 </td><td> 5 </td><td></td><td></td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 </td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> adenosina </td><td> 5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> glucosio </td><td> 140 </td><td> 10 </td><td> 20 </td><td> 10 </td><td></td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> mannitolo </td><td> 100 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> taurina </td><td> 10 </td><td> 20 </td><td> 5 </td><td></td><td></td><td> 20 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td></td><td> 113 </td><td></td><td> 136 </td><td></td><td> 113 </td><td> 113 </td></tr><tr><td> KCl </td><td></td><td> 4.7 </td><td> 85 </td><td> 5.4 </td><td> 25 </td><td> 4.7 </td><td> 4.7 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td></td><td> &lt;/ Td&gt; <td></td><td> 1.2 </td><td> 5 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td></td><td> 0.6 </td><td> 30 </td><td></td><td></td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td></td><td> 0.6 </td><td></td><td></td><td></td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td></td><td> 12 </td><td></td><td></td><td></td><td> 12 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> KHCO 3 </td><td></td><td> 10 </td><td></td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Na-piruvato </td><td></td><td> 4 </td><td></td><td></td><td></td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> BDM </td><td></td><td> 10 </td><td></td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> BHBA </td><td></td><td></td><td> 5 &lt;/ Td&gt; <td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> acido succinico </td><td></td><td></td><td> 5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td></td><td> 0.5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> K 2-ATP </td><td></td><td></td><td> 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> acido piruvico </td><td></td><td></td><td> 5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> creatina </td><td></td><td></td><td> 5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> KMES </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 115 </td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> Enzimi (U / ml) </td><td> Collagenase tipo V </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 250 &lt;/ Td&gt; <td> 250 </td></tr><tr><td> Protease Tipo XXIV </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 4 </td><td></td></tr><tr><td> pH </td><td></td><td> 7.4 KOH </td><td> 7.3 NaOH </td><td> 7.1 KOH </td><td> 7.35 NaOH </td><td> 7.2 KOH </td><td> 7.3 NaOH </td><td> 7.3 NaOH </td></tr></tbody></table> . Tabella 1 Soluzioni utilizzati per la raccolta dei campioni, l&#39;isolamento delle cellule e caratterizzazione funzionale di miociti CP = soluzione cardioplegica.; DB = buffer di dissociazione; KB = soluzione Kraft-Brühe; TB = tampone Tyrode; PS = soluzione di pipetta; EB1 = tampone enzimatico 1; EB2 = tampone enzima 2. <ol><li> Preparare la soluzione cardioplegica (CP). Soluzione CP può essere conservato a 4 ° C per 1 settimana. </li><li> Preparare Ca 2 + libero-tampone di dissociazione (DB). Questa soluzione deve essere utilizzata entro la giornata. </li><li> Preparare la soluzione Kraft-Brühe (KB). KB soluzione può essere conservato a 4 ° C per un massimo di 1 week. </li><li> Preparare Ca 2 buffer di Tyrode libero + (TB). Questa soluzione deve essere utilizzata entro la giornata. </li><li> Filtrare con usando filtri siringa prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare il dispositivo di digestione (Figura 2), un contenitore raschiatura fatta di due spazzole affacciate di elastomero siliconico, una delle quali in rotazione da un motore elettrico. Il dispositivo di digestione è su misura. Dettagli sul dispositivo digestione sono in Figura 8; immagini del dispositivo sono nelle figure 2 C e 2D. Lavare la camera di tessuto con il 70% di etanolo e acqua. </li></ol> 2. Raccolta ed elaborazione dei Campioni Infarto <ol><li> Versare 40 ml di soluzione cardiplegic (CP) in un tubo da 50 ml e conservare in ghiaccio per trasporto campione dalla sala operatoria al laboratorio di isolamento cellulare. </li><li> Raccogliere il campione del miocardio ventricolare dalla sala operatoria subito dopo l&#39;asportazione, lavarlo con ghiaccio freddoSoluzione CP e memorizzarlo nel tubo. Utilizzare campioni endocardiche asportato dal setto ventricolare tra superiore durante l&#39;intervento chirurgico a cuore aperto, la ponderazione&gt; 100 mg. </li><li> Trasferire rapidamente il campione alla zona di laboratorio; avviare l&#39;elaborazione del campione entro 10 minuti da un campione escissione. </li><li> Pur mantenendo il campione di tampone a freddo ghiaccio CP, rimuovere delicatamente lo strato fibrotico endocardial con le forbici sottili allo stereomicroscopio; poi, tagliare il tessuto miocardico a piccoli pezzi (2-3 mm di lunghezza). A seconda delle dimensioni del campione di tessuto, tagliare un importo complessivo di miocardio ventricolare tra 100 mg e 1 g per ogni isolamento. </li><li> Al termine della macinazione tessuto, trasferire i pezzi del miocardio nel dispositivo di digestione, con ghiaccio pulito soluzione CP freddo. Evitare di riempire tutto il volume tra le due spazzole di silicio (3-4 ml) con pezzi del miocardio, utilizzando non più di 1 g di tessuto totale. </li></ol> 3. Lavaggio e Digestione del miocardio Chunks <ol><li> A poppaer i pezzi vengono trasferiti nella camera raschiando il dispositivo di digestione, modificare il buffer CP nella camera con il freddo Ca 2 + buffer di dissociazione-free (DB). </li><li> Posizionare il dispositivo di digestione in un bagno termostatico, in modo che la camera di essere in contatto con l&#39;acqua riscaldata nella vasca (Figura 1). Impostare la vasca di 37,5 ° C e accenderla, al fine di aumentare lentamente la temperatura della camera di tessuto. Accendere il motore del dispositivo di digestione, impostando la velocità di rotazione di 1 giro / secondo. </li><li> Eseguire 3 cicli di lavaggio con DB, cambiando la soluzione nella camera pulita con DB ogni 8 min. Il DB è riscaldata (37 ° C) e ossigeno saturo prima di entrare in contatto con i pezzi del miocardio. </li><li> Preparare tampone enzimatico 1 (EB1) con l&#39;aggiunta di 250 U / ml di collagenasi di tipo V e 4 U / ml Protease Tipo XXIV alla soluzione DB. Preparare tampone enzima 2 (EB2) con l&#39;aggiunta di 250 U / ml collagenasi di tipo V di soluzione DB. Warm up (37 ° C) e oxygenate EB1 ed EB2. </li><li> Eseguire due cicli di 12 min di digestione nel dispositivo digestione rotante con 100% EB1 ossigenato (a 37 ° C). Ad ogni ciclo, utilizzare ~ 3 ml di EB1. Rimuovere la soluzione pipetta aspirazione e scartarla dopo ogni ciclo. </li><li> Preparare 6 provette da 15 ml per la raccolta di cellule e ~ 80 ml di freddo (4 ° C) KB soluzione per eluire i buffer. </li><li> Effettuare un primo ciclo digestione 15 min con 3 ml 100% EB2 ossigenata a 37 ° C. Dopo il ciclo di digestione, raccogliere la soluzione contenente i primi miociti dissociate in una provetta da 15 ml e diluire la sospensione cellulare con 12 ml di soluzione fredda KB. Conservare il piatto tubo a temperatura ambiente. </li><li> Diluire la soluzione EB2 rimanente con una quantità uguale di DB per dimezzare la concentrazione di collagenasi V per i seguenti cicli di digestione. </li><li> Eseguire altri cicli 5 12 min digestione con 3 EB2 ml a 37 ° C; dopo ciascuno di loro raccolta di miociti contenente tampone in un tubo da 15 ml ediluire con 12 ml di soluzione KB. Conservare le provette cella contenente 6 a temperatura ambiente per 30 min. </li></ol> 4. Resuspension cellulare e Ca 2 + riadattamento <ol><li> Aggiungere 1 mg / ml di albumina di siero bovino (BSA) per 20 ml tampone Ca 2 +-Tyrode libero (TB). Filtrare la soluzione. </li><li> Centrifugare le sei tubi conici miociti contenente 100 xg per 5 minuti per forzare miociti per risolvere. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in ciascun tubo con un ammontare variabile (1-3 ml, a seconda della resa) di BSA contenente TB a RT. </li><li> Aumentare gradualmente Ca 2 + concentrazione nella memoria di cella contenente aggiungendo piccole aliquote di 100 mmol / L CaCl 2 soluzione. Nella prima e nella seconda fase di Ca 2 + concentrazione viene aumentata fino a 50 mmol / L e 100 mmol / L, rispettivamente. I seguenti passaggi Ca 2 + addizione vengono eseguiti ogni 5 minuti e la concentrazione viene sollevato da 100 micromol / L ad ogni passo toa concentrazione finale di 0,9 mmol / L. </li><li> Valutare la resa della procedura di isolamento. Trasferire 0,5 ml di soluzione contenente miociti sulla camera inferiore di vetro di un microscopio. Valutare 15 campi di microscopio a 10x obiettivo e calcolare la percentuale di miociti sani (ad esempio cellule a forma di bastoncello, con striature chiare e senza inclusioni significative, Figura 2). Il rendimento atteso è di circa il 20%. </li></ol> 5. Valutazione funzionale dei cardiomiociti isolati. Il protocollo che segue è un esempio di valutazione funzionale dei cardiomiociti umani tra cui registrazioni simultanee di potenziali d&#39;azione e intracellulare Ca 2 + flussi. <ol><li> Preparare la soluzione di pipetta (PS) per esperimenti di patch clamp in configurazione di patch perforato. La soluzione può essere conservata a -20 ° C per 3 mesi. </li><li> Aggiungere 1,8 mmol / L CaCl 2 a Ca 2 + tampone Tyrode-free (TB). Use questa soluzione per superfusione dei cardiomiociti durante esperimenti di patch clamp / fluorescenza. </li><li> Trasferire 1 ml di sospensione cellulare in una provetta da 1,5 ml e aggiungere 10 micromol / L Fluoforte e 10 microlitri Powerload Concentrato. Incubare per 30 minuti a RT. Successivamente, impostare il tubo in posizione verticale e lasciare la cella accontentarsi di 5 min; risospendere le cellule in Ca 2 + contenente TB. </li><li> Trasferire 0,25 ml di sospensione cellulare in un piccolo (0,5 ml), microscopio temperatura controllata montato camera di registrazione, superfuse per gravità con un sistema microperfusor riscaldato a una velocità di flusso di 0,3 ml / min (temperatura: 37 ± 0,5 ° C). </li><li> Con un estrattore micropipetta, preparare pipette di patch clamp con un diametro di punta di 3 a 5 micron e una resistenza da 3 a 4,5 m quando riempita con PS. </li><li> Aggiungere amfotericina B a un lotto di PS (250 mcg / ml) e usarlo per riempire gli elettrodi. </li><li> Selezionare una cella canna a forma di striature chiare, privo di inclusioni, form il sigillo giga e aspettare 5-10 minuti, fino a quando la resistenza accesso scende al di sotto di 20 mW. </li><li> Suscitare potenziali d&#39;azione in modalità pinza corrente utilizzando impulsi brevi (&lt;3 msec) a diverse frequenze di stimolazione (0,2 Hz, 0.5 Hz e 1 Hz, 1 min ciascuna frequenza). Durante la fase di registrazione, accendere l&#39;illuminazione in campo chiaro a 492 ± 3 nm e rilevare Fluoforte fluorescenza a 505-520 nm. Acquisire fluorescenza e membrana segnali di potenziali utilizzando Digidata 1440A e software pClamp 10.0. Ripetere la sequenza di registrazione più volte, se necessario; tuttavia, mantenere il tempo di registrazione totale inferiore a 15 minuti per ogni cella. </li></ol>

<ol><li>Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+cardiac+myocytes.+I.+Preparation+of+adult+myocytes+and+their+homology+with+the+intact+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Isolated cardiac myocytes. I. Preparation of adult myocytes and their homology with the intact tissue.</a> Cardiovascular Research. 15, 483-514 (1981).</li>
<li>Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+cardiac+myocytes.+II.+Functional+aspects+of+mature+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Isolated cardiac myocytes. II. Functional aspects of mature cells.</a> Cardiovascular Research. 15, 549-579 (1981).</li>
<li>Harding, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+dependence+of+contraction+velocity+in+single+isolated+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardioscience%22%5BJournal%5D)">Species dependence of contraction velocity in single isolated cardiac myocytes.</a> Cardioscience. 1, 49-53 (1990).</li>
<li>Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+single+atrial+and+ventricular+cells+from+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Medical+Association+Journal%22%5BJournal%5D)">Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart.</a> Canadian Medical Association Journal. 126, 791-793 (1982).</li>
<li>Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+calcium-current+in+isolated+human+ventricular+myocytes+from+patients+with+terminal+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Characteristics of calcium-current in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 23, 929-937 (1991).</li>
<li>Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+handling+in+isolated+ventricular+myocytes+from+patients+with+terminal+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure.</a> Circulation. 85, 1046-1055 (1992).</li>
<li>Cohen, N. M., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+current+in+single+human+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Calcium current in single human cardiac myocytes.</a> Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 4, 422-437 (1993).</li>
<li>Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+K%2B+currents+in+isolated+human+ventricular+myocytes+from+patients+with+terminal+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Alterations of K+ currents in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure.</a> Circulation Research. 73, 379-385 (1993).</li>
<li>Virag, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slow+component+of+the+delayed+rectifier+potassium+current+in+undiseased+human+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">The slow component of the delayed rectifier potassium current in undiseased human ventricular myocytes.</a> Cardiovascular Research. 49, 790-797 (2001).</li>
<li>Nanasi, P. P., Varro, A., Lathrop, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+ventricular+and+atrial+cardiomyocytes%3A+technical+note%5BTitle%5D)+AND+%22Cardioscience%22%5BJournal%5D)">Isolation of human ventricular and atrial cardiomyocytes: technical note.</a> Cardioscience. 4, 111-116 (1993).</li>
<li>Benitah, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+inward+current+in+single+cells+isolated+from+adult+human+ventricles.+Pflugers+Archiv%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Slow inward current in single cells isolated from adult human ventricles. Pflugers Archiv.</a> European Journal of Physiology. 421, 176-187 (1992).</li>
<li>Verkerk, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+mechanism+of+delayed+afterdepolarizations+in+ventricular+cells+isolated+from+human+end-stage+failing+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ionic mechanism of delayed afterdepolarizations in ventricular cells isolated from human end-stage failing hearts.</a> Circulation. 104, 2728-2733 (2001).</li>
<li>Cerbai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+hyperpolarization-activated+current%2C+I%28f%29%2C+in+ventricular+myocytes+from+human+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Characterization of the hyperpolarization-activated current, I(f), in ventricular myocytes from human failing heart.</a> Circulation. 95, 568-571 (1997).</li>
<li>Kohncke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+kv+channel+recordings+in+murine+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).</li>
<li>Tomaselli, G. F., Marban, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+remodeling+in+hypertrophy+and+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological remodeling in hypertrophy and heart failure.</a> Cardiovascular Research. 42, 270-283 (1999).</li>
<li>Maron, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+cardiomyopathy%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%3A+The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic cardiomyopathy: a systematic review.</a> JAMA: The Journal of the American Medical Association. 287, 1308-1320 (2002).</li>
<li>Olivotto, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+faces+of+hypertrophic+cardiomyopathy%3A+from+developmental+biology+to+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">The many faces of hypertrophic cardiomyopathy: from developmental biology to clinical practice.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 349-367 (2009).</li>
<li>Maron, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+cardiomyopathy+is+predominantly+a+disease+of+left+ventricular+outflow+tract+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic cardiomyopathy is predominantly a disease of left ventricular outflow tract obstruction.</a> Circulation. 114, 2232-2239 (2006).</li>
<li>Peeters, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+human+ventricular+myocytes+from+single+endocardial+and+epicardial+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies.</a> The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).</li>
<li>Lippiat, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+recording+using+the+perforated+patch+clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Whole-cell recording using the perforated patch clamp technique.</a> Methods Mol Biol. 491, 141-149 (2008).</li>
<li>Coppini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+sodium+current+inhibition+reverses+electromechanical+dysfunction+in+human+hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy.</a> Circulation. 127, 575-584 (2013).</li>
<li>Kuusisto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-grade+inflammation+and+the+phenotypic+expression+of+myocardial+fibrosis+in+hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Heart%22%5BJournal%5D)">Low-grade inflammation and the phenotypic expression of myocardial fibrosis in hypertrophic cardiomyopathy.</a> Heart. 98, 1007-1013 (2012).</li>
<li>Yan, G. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+2+early+afterdepolarization+as+a+trigger+of+polymorphic+ventricular+tachycardia+in+acquired+long-QT+syndrome+%3A+direct+evidence+from+intracellular+recordings+in+the+intact+left+ventricular+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Phase 2 early afterdepolarization as a trigger of polymorphic ventricular tachycardia in acquired long-QT syndrome : direct evidence from intracellular recordings in the intact left ventricular wall.</a> Circulation. 103, 2851-2856 (2001).</li>
<li>Yue, L., Feng, J., Li, G. R., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+outward+and+delayed+rectifier+currents+in+canine+atrium%3A+properties+and+role+of+isolation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transient outward and delayed rectifier currents in canine atrium: properties and role of isolation methods.</a> The American Journal of Physiology. 270, 2157-2168 (1996).</li>
<li>Li, G. R., Feng, J., Yue, L., Carrier, M., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+two+components+of+delayed+rectifier+K%2B+current+in+human+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Evidence for two components of delayed rectifier K+ current in human ventricular myocytes.</a> Circulation research. 78, 689-696 (1996).</li>
<li>Viswanathan, P. C., Shaw, R. M., Rudy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+IKr+and+IKs+heterogeneity+on+action+potential+duration+and+its+rate+dependence%3A+a+simulation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Effects of IKr and IKs heterogeneity on action potential duration and its rate dependence: a simulation study.</a> Circulation. 99, 2466-2474 (1999).</li>
<li>Volders, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+contribution+of+IKs+to+canine+ventricular+repolarization%3A+key+role+for+beta-adrenergic+receptor+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Probing the contribution of IKs to canine ventricular repolarization: key role for beta-adrenergic receptor stimulation.</a> Circulation. 107, 2753-2760 (2003).</li>
<li>Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K., Scott, A., Siegl, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoproterenol+antagonizes+prolongation+of+refractory+period+by+the+class+III+antiarrhythmic+agent+E-4031+in+guinea+pig+myocytes.+Mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Isoproterenol antagonizes prolongation of refractory period by the class III antiarrhythmic agent E-4031 in guinea pig myocytes. Mechanism of action.</a> Circulation Research. 68, 77-84 (1991).</li>
<li>Coppini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translational+approach+to+treatment+of+hypertrophic+cardiomyopathy%3A+pre-clinical+rationale+and+design+of+a+prospective+randomized+pilot+trial+with+ranolazine%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A translational approach to treatment of hypertrophic cardiomyopathy: pre-clinical rationale and design of a prospective randomized pilot trial with ranolazine.</a> Circulation. 125, 1(2012).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Abbiamo descritto e validato un metodo per isolare miociti vitali da campioni chirurgici di miocardio ventricolare umano. Partendo da protocolli precedentemente descritti che erano stati utilizzati con successo per cellule isolate da campioni chirurgici atriali, la tecnica per consentire la separazione dei miociti vitali singoli da malato miocardio ventricolare è stato sviluppato e perfezionato. I primi rapporti hanno mostrato che l&#39;isolamento dei singoli cardiomiociti da pezzi di atriale e ventricolare tessuto sele...

La dissezione delle proprietà elettrofisiologiche del miocardio è progredita notevolmente dopo lo sviluppo di tecniche per l&#39;isolamento singolo dei miociti cardiaci. Recenti progressi nella comprensione dei cardiaco eccitazione contrazione Coupling (CE-Coupling), sono stati resi possibili dalla capacità di isolare vitali singoli cardiomiociti che conservano tutte le proprietà fisiologiche del tessuto intatto. Metodi di patch clamp sono abitualmente impiegati per studiare la funzione e la modulazione farmacologica di correnti ioniche sarcolemma cardiaco. Registrazioni di dinamica del calcio intracellulare con Ca 2 + coloranti sensibili sono regolarmente eseguite su miociti cardiaci singoli da una varietà di modelli sani e malati, fornendo dati vitali sulla fisiologia del CE-Coupling nonché sulle alterazioni patologiche intracellulare Ca 2 + omeostasi che porta a danni meccanici ed aumento degli oneri aritmogena nelle malattie cardiache. Informazione da questi studi è fondamentale per la comprensione degli effetti elettrofisiologici e meccanici di farmaci in ambito clinico. Tuttavia, ci sono specie specifiche differenze nelle correnti transmembrana e nelle proteine ​​CE-coupling che rappresentano caratteristiche specifiche di potenziale cardiaco e meccanica cardiaca. Così, mentre gli studi di miociti isolati da mammiferi non umani hanno chiarito le proprietà biofisiche e ruoli fisiologici di specifici canali ionici transmembrana e proteine ​​EC-Coupling, non necessariamente forniscono modelli provvisti di miociti cardiaci umani. Isolamento dei miociti vitali di miocardio umano è quindi essenziale per comprendere appieno la fisiopatologia delle malattie cardiache e validare nuovi approcci terapeutici. Tessuto atriale umano è facilmente disponibile come appendici atriali sono spesso scartati durante le procedure chirurgiche. Studi quantitativi iniziali di adulti potenziali d&#39;azione cardiaci umani e cu ionicarrents impiegate cellule atriali enzimatica isolate 1-4. Registrazioni di potenziali d&#39;azione o correnti di isolate cellule ventricolari umane adulte sono stati successivamente segnalati 3,5-10. La maggior parte di questi studi hanno utilizzato cellule ottenute da cuori espiantati e utilizzati sia perfusione con collagenasi di un segmento di arteria coronaria o l&#39;esposizione di una rilevante quantità di tessuto asportato alla collagenasi per ottenere cellule isolate. Questi studi hanno permesso una caratterizzazione dettagliata di un numero di correnti ioniche transmembrana di cardiomiociti ventricolari umani da cuori sani e da pazienti con insufficienza cardiaca terminale. Registrazioni di tipo L Ca 2 + corrente (I Ca-L) 5-7, corrente di potassio verso l&#39;esterno transitoria (I) 8, corrente entrante potassio raddrizzatore (I κ1) 8, le varie componenti della corrente di potassio delayed rectifier (I κ ) 9 sono stati segnalati. Anticipi e raffinazione dila procedura di isolamento 10, ha consentito una chiara caratterizzazione della base ionica del potenziale aumento aritmogenico nello scompenso cardiaco terminale, che comprende l&#39;azione potenziale prolungamento 11, ritardato dopo depolarizzazioni 12 e aumentato divertente attuali 13 che porta alla depolarizzazione diastolica e battiti prematuri. Miociti cardiaci adulti sono normalmente isolati da piccoli animali da perfusione retrograda di tutto cuore con varie miscele enzimatiche, una tecnica che produce rendimenti elevati di Ca 2 + cellule-tolleranti 14. Isolamento di miociti cardiaci da frammenti di tessuto è intrinsecamente meno successo probabilmente a causa del limitato accesso di enzimi per singoli miociti rispetto a quella ottenuta mediante perfusione delle arterie coronarie. A causa della limitata disponibilità di cuori erogatori non utilizzati, l&#39;unico modo pratico per ottenere cellule ventricolari umane normali su base regolare è da digestio enzimatican dei piccolissimi frammenti di tessuto spesso asportati durante le procedure chirurgiche elettive. L&#39;unico modello di malattia umana che è stato ampiamente caratterizzato a livello cellulare è insufficienza cardiaca terminale, a causa della accessibilità ai cuori trapiantati. Tuttavia, insufficienza cardiaca terminale si verifica in una minoranza di pazienti e spesso comporta un percorso comune di grave rimodellamento delle cellule del miocardio, che è relativamente indipendente dalla causa sottostante 15. La capacità di valutare la funzione di singoli cardiomiociti di pazienti in una fase precedente non avendo della malattia è fondamentale per capire la fisiopatologia specifica delle diverse condizioni ereditarie o acquisite. La cardiomiopatia ipertrofica (HCM) è un esempio eloquente. HCM è un comune (1/500 persone) condizione cardiaca ereditaria caratterizzata da ipertrofia cardiaca, aumento alterazioni rischio e contrattili aritmogenici a causa di ostruzione del tratto di efflusso e disfunzione diastolica 16. Cardiomiociti da cuori HCM undergo un complesso di processi di rimodellamento che comportano cambiamenti nella struttura delle cellule (ipertrofia, allo sbando miofibrillare) e EC-Coupling 17. Tuttavia, la maggior informazioni di miociti erettile in HCM è venuto da modelli animali transgenici. Dal momento che solo una minoranza di pazienti HCM evolve verso l&#39;insufficienza cardiaca terminale e necessita di trapianto cardiaco, il cuore HCM sono molto raramente disponibili per l&#39;isolamento delle cellule con metodi standard. Tuttavia, almeno il 30% dei pazienti HCM sviluppano sintomi ostruttivi dovuti alla enorme flusso di sangue tratto ipertrofia settale alterazione deflusso durante la sistole (HCM) 18. Il più efficace opzione terapeutica disponibile per il sollievo di ostruzione in HCM è chirurgica del setto miectomia: durante questa procedura chirurgica, una porzione di dimensioni variabile del setto superiore viene rimosso approccio aortica trans. Questa porzione di setto ipertrofico è quindi disponibile per l&#39;isolamento delle cellule dal tessuto fresco. Un metodo per l&#39;isolamento di ventricula umanar miociti dai singoli, piccoli transvenous campioni di biopsia endomiocardica è stato precedentemente sviluppato e pubblicato 19. Abbiamo implementato un metodo per isolare singoli miociti del setto da campioni di miocardio ventricolare da pazienti sottoposti a chirurgia cardiaca, inclusi i pazienti con HCM sottoposti miectomia settale e pazienti sottoposti a procedure di sostituzione della valvola. Oltre a una descrizione dettagliata del protocollo di isolamento, elettrofisiologico rappresentante e Ca 2 + fluorescenza misurazioni sono presentati, dimostrando la vitalità dei miociti ventricolari isolati umani e la fattibilità di patch clamp e Ca2 + intracellulare studi.

<table><tbody><tr><td>Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p9791?lang=it&amp; region=IT">P9791 </a></td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio eptaidrato(MgSO4*7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/m1880?lang=it&amp; region=IT">M1880 </a></td>HEPES Sigma-Aldrich<<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h3375?lang=it&amp; region=IT">H3375 </a></td><td></td></tr><tr><td>Adenosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9251?lang=it&amp; region=IT">A9251 </a></td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8270?lang=it&amp; region=IT">G8270 </a></td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/m4125?lang=it&amp; region=IT">M4125 </a></td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di potassio (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s7653?lang=it&amp; region=IT">S7653</a></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p9333?lang=it&amp; region=IT">P9333 </a></td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s7907?lang=it&amp; region=IT">S7907 </a></td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s6297?lang=it&amp; region=IT">S6297 </a></td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di potassio (KHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/237205?lang=it&amp; region=IT">237205</a></td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p2256?lang=it&amp; region=IT">P2256 </a></td><td></td></tr><tr><td>2,3-Butanedione monoxime</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b0753?lang=it&amp; region=IT">B0753 </a></td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio(NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s8045?lang=it&amp; region=IT">S8045 </a></td><td></td></tr><tr><td>L-Acido glutammico sale monopotassico monoidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/49601?lang=it&amp; region=IT">49601</a></td><td></td></tr><tr><td>Acido piruvico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/107360?lang=it&amp; region=IT">107360</a></td><td></td></tr><tr><td>3-Acido idrossibutirrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/166898?lang=it&amp; region=IT">166898</a></td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&prime;-trifosfato sale dipotassico diidrato (K2-ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8937?lang=it&amp; region=IT">A8937</a></td><td></td></tr><tr><td>Creatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c0780?lang=it&amp; region=IT">C0780 </a></td><td></td></tr><tr><td>Acido Succinico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s3674?lang=it&amp; region=IT">S3674 </a></td><td></td></tr><tr><td>Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N&prime;,N&primo;-acido tetraacetico (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/e0396?lang=it&amp; region=IT">E0396 </a></td><td></td></tr><tr><td>Albumina da siero bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a0281?lang=it&amp; region=IT">A0281</a></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8266?lang=it&amp; region=IT">M8266 </a></td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi da Clostridium histolyticum, Tipo V</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c9263?lang=it&amp; region=IT">C9263 </a></td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi, Batterico, Tipo XXIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8038</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di cloruro di calcio, ~1 M in H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/21115?lang=it&amp; region=IT">21115</a></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di cloruro di calcio 0,1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/53704?lang=it&amp; region=IT">53704</a></td><td></td></tr><tr><td>Metanosolfonato di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/83000?lang=it&amp; region=IT">83000</a></td><td></td></tr><tr><td>Reagente FluoForte</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ENZ-52015</td><td></td></tr><tr><td>Concentrato Powerload, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>P10020</td><td></td></tr><tr><td>Sistema a passo rapido di perfusione</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-77SP</td><td></td></tr><tr><td>Amfotericina B solubilizzata</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9528?lang=it&amp; region=IT">A9528 </a></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B amplificatore patch-clamp</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440A</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pClamp10.0&nbsp;</td><td>Il</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>dispositivo è realizzato su misura nel nostro laboratorio utilizzando tubi di plastica, Sylgard fuso e un motore; è descritto in dettaglio nella Figura 1C-1D e nella Figura 7. Possiamo fornire ulteriori dettagli se richiesto.</td></tr><tr><td>Elastomero siliconico per spazzole del dispositivo di digestione</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD&reg; 184</td><td></td></tr><tr><td>Motore rotante a velocità variabile per dispositivo di digestione</td><td>Crouzet</td><td>Crouzet 178-4765</td><td></td></tr><tr><td>Stampo per colata spazzole</td><td>N.A.</td><td>N.A.</td><td>Lo stampo è realizzato su misura con aste standard in PTFE da 2,5 cm di diametro.</td></tr></tbody></table>

isolamento e caratterizzazione funzionale di human ventricolare cardiomyocytes da campioni freschi chirurgici

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomiociti da cuori malati sono sottoposti a processi di rimodellamento complessi che coinvolgono cambiamenti nella struttura cellulare, accoppiamento eccitazione contrazione e correnti ioniche di membrana. Tali modifiche sono suscettibili di essere responsabile per l&#39;aumento del rischio aritmogena e le alterazioni contrattili che portano alla disfunzione sistolica e diastolica nei pazienti cardiopatici. Tuttavia, la maggior informazioni sulle alterazioni della funzione miociti nelle malattie cardiache proviene da modelli animali. Qui descriviamo e validare un protocollo per isolare miociti vitali da piccoli campioni chirurgici di miocardio ventricolare da pazienti sottoposti a interventi di chirurgia cardiaca. Il protocollo è descritto in dettaglio. Misure elettrofisiologiche e calcio intracellulare sono segnalati per dimostrare la fattibilità di un numero di misurazioni singola cellula in cardiomiociti ventricolari umane ottenute con questo metodo. Il protocollo ha riferito chere possono essere utili per le future ricerche di base cellulare e molecolare delle alterazioni funzionali del cuore umano in presenza di differenti malattie cardiache. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per identificare nuovi bersagli terapeutici a livello cellulare e per testare l&#39;efficacia di nuovi composti in cardiomiociti umani, con valore traslazionale diretta.

Il metodo sopra descritto è stato impiegato per caratterizzare le alterazioni funzionali di cardiomiociti isolati dal setto interventricolare di pazienti con cardiomiopatia ipertrofica (HCM) che hanno subito un&#39;operazione miectomia, rispetto ai pazienti non in mancanza non ipertrofiche chirurgici 21. I risultati contenuti in questa sezione provengono da quel lavoro 21 e sono mostrati qui come un esempio di come questa tecnica può essere utilizzata per caratterizzare le alterazioni della funzion...

Le attuali conoscenze sulla base cellulare di malattie cardiache si basa principalmente su studi su modelli animali. Qui descriviamo e validare un nuovo metodo per ottenere singoli cardiomiociti vitali da piccoli campioni chirurgici di miocardio ventricolare umana. Miociti ventricolari umani possono essere utilizzati per studi elettrofisiologici e test della droga.

Isolamento e caratterizzazione funzionale di Human ventricolare Cardiomyocytes da campioni freschi chirurgici

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare cardiomiociti vitali da campioni ventricolari umani patologici e caratterizzare le loro alterazioni funzionali. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo e trinciando rapidamente campioni ventricolari freschi in una soluzione cardioplegica ghiacciata, al fine di evitare un'eccessiva degradazione del tessuto e danni cellulari. Il secondo passaggio consiste nell'eseguire una digestione progressiva dei frammenti miocardici utilizzando un dispositivo di digestione su misura e soluzioni enzimatiche.In sei cicli, la cellula contenente il tampone viene raccolta in un tubo ad ogni ciclo e diluita con una soluzione di conservazione cellulare. L'ultimo passaggio consiste nel risospendere le cellule contenute nei sei tubi in un volume minore di soluzione fisiologica standard con concentrazioni normali di calcio, al fine di eseguire la caratterizzazione funzionale. Infine, la registrazione mediante patch clamp dei potenziali d'azione e la valutazione simultanea del calcio intracellulare mediante coloranti fluorescenti vengono utilizzate per mostrare le alterazioni della durata del potenziale d'azione e del ciclo del calcio intracellulare

isolation-functional-characterization-human-ventricular

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Descriviamo l'isolamento di miociti atriali umani, che possono essere utilizzati per Ca...

Isolamento dei miociti atriali umane per misure simultanee di Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transitori e correnti di membrana

Qui si descrive l'isolamento di cardiomyoctyes adulte di topo mediante un sistema di perfusione Langendorff. Le cellule risultanti sono Ca2 +-tolerant, elettricamente quiescente e può essere colta e trasfettate con-adeno o lentivirus per manipolare l'espressione genica. La loro funzionalità può anche essere analizzato con il sistema MMSYS e tecniche di patch clamp.

Isolamento, Cultura e caratterizzazione funzionale di topo adulto Cardiomyoctyes

tessuto cardiaco umano alberga popolazioni di cellule precursore perivascolari multipotenti che possono essere adatti per la rigenerazione del miocardio. La tecnica qui descritta permette l'isolamento e la purificazione simultanea di due popolazioni di cellule stromali multipotenti associati con i vasi sanguigni nativi, cioè CD146 + CD34 - periciti e CD34 + CD146 - cellule avventiziale, dal miocardio umano.

Isolamento di perivascolare Multipotent precursori delle cellule popolazioni dal cardiache umane Tissue

Sono stati sviluppati e descritti diversi protocolli per l'isolamento di diversi tipi di cellule cardiache da un cuore del topo. Qui viene descritto un protocollo ottimizzato che consente l'isolamento di tipi di cellule cardiache di elevata qualità (cardiomiociti, cellule endoteliali e fibroblasti) da una singola preparazione, riducendo i costi sperimentali.

Isolamento simultaneo di cardiomiociti di alta qualità, cellule endoteliali e fibroblasti da un cuore di ratto adulto

In questo articolo viene fornito un metodo per isolare cellule stromale mesenchymal cardiache da endomyocardial campioni bioptici di pazienti cardiomiopatia aritmogena. Loro caratterizzazione e il protocollo per aumentare la loro differenziazione adipogenico sono descritti.

Isolamento e caratterizzazione di cellule Stromal Mesenchymal cardiache da Endomyocardial campioni bioptici di pazienti cardiomiopatia aritmogena

Questo protocollo mira a descrivere passo dopo passo la tecnica di estrazione e valutazione della funzione cardiaca utilizzando cardiomiociti scuoiati. Questa metodologia consente la misurazione e la modifica acuta della funzione di miofilamento utilizzando piccole biopsie congelate che possono essere raccolte da diverse posizioni cardiache, dai topi agli uomini.

Valutazione in vitro della funzione cardiaca con cardiomiociti scuoiati

Presentato è un protocollo per l'isolamento dei cardiomiociti ventricolari umani e animali da fette miocardici tagliate con vibratome. È possibile ottenere rese elevate di cellule tolleranti al calcio (fino a 200 cellule/mg) da piccole quantità di tessuto (&lt;50 mg). Il protocollo è applicabile al miocardio esposto all'ischemia fredda fino a 36 h.

Isolamento dei cardiomiociti ventricolari umani dalle fette miocardici Vibratome-Cut

Un metodo è descritto per l'isolamento simultaneo di miociti e non miociti sia dagli atri che dai ventricoli di un singolo cuore adulto di topo. Questo protocollo si traduce in rese costanti di miociti cardiaci altamente vitali e non miociti e descrive in dettaglio le condizioni ottimali di coltura specifica delle cellule per la fenotipizzazione e l'analisi in vitro.

Isolamento simultaneo e cultura di miociti atriali, miociti ventricolari e non miociti da un cuore di topo adulto

Abbiamo sviluppato un metodo semplicie per isolare le singole cellule cardiache del topo di alta qualità con la tecnica della perfusione antegrada. Questo metodo è privo di Langendorff e utile per isolare miociti ventricolari e atriali o cellule interstiziali, come fibroblasti cardiaci o progenitori.

Un metodo di perfusione antegrada per l'isolamento dei cardiomiociti dai topi

I modelli murini consentono di studiare i meccanismi chiave dell'aritmogenesi. A tale scopo, sono necessari cardiomiociti di alta qualità per eseguire misurazioni patch-clamp. Qui viene descritto un metodo per isolare i miociti atriali e ventricolari murini tramite perfusione Langendorff a base di enzimi retrogradi, che consente misurazioni simultanee di transitori di calcio e corrente di calcio di tipo L.

Isolamento di miociti atriali e ventricolari murini di alta qualità per misurazioni simultanee di transitori Ca2+ e corrente di calcio di tipo L

Impara a isolare cardiomiociti ventricolari umani da campioni chirurgici freschi per studi elettrofisiologici e test farmacologici. Questo metodo consente di caratterizzare alterazioni funzionali nelle malattie cardiache.

Isolamento e caratterizzazione funzionale di Human ventricolare Cardiomyocytes da campioni freschi chirurgici

Esplora altri video