Isolamento e caratterizzazione funzionale di Human ventricolare Cardiomyocytes da campioni freschi chirurgici

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare cardiomiociti vitali da campioni ventricolari umani malati e caratterizzare le loro alterazioni funzionali. Ciò si ottiene raccogliendo e tritando rapidamente campioni ventricolari freschi in una soluzione cardioplegica ghiacciata al fine di evitare un'eccessiva degradazione dei tessuti e danni cellulari. Il secondo passo consiste nell'eseguire una digestione graduale dei pezzi miocardici utilizzando un dispositivo di digestione personalizzato e soluzioni enzimatiche.

In sei cicli, la cella contenente il tampone viene raccolta in una provetta ad ogni ciclo e diluita con una soluzione di conservazione cellulare. Il passaggio finale consiste nel risospendere le cellule contenute nelle sei provette in un volume inferiore di soluzione fisiologica standard con concentrazioni di calcio normali per eseguire la caratterizzazione funzionale. In definitiva, la registrazione con patch clamp dei potenziali d'azione e la valutazione simultanea del calcio intercellulare utilizzando coloranti fluorescenti vengono utilizzate per mostrare le alterazioni dell'azione, della durata del potenziale e del ciclo intracellulare del calcio nei cardiomiociti di pazienti con cardiomiopatia ipertrofica.

Il vantaggio principale di DYS, unico nel suo genere, rispetto a un metodo a 16 metodi, come il metodo standard di deiezione a pezzi, è che in associazione con la soluzione enzimatica, utilizziamo un dispositivo di digestione su misura, che consente un'associazione congiunta di citi variabili grazie ai suoi raschietti di silicio. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della cardiologia, come ad esempio come il noto rimodellamento molecolare e strutturale associato alle malattie cardiache si rifletta nell'alterazione di singoli cardiomiociti che possono essere analizzati con il nostro metodo e bersagliati da farmaci specifici. Quindi le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia di malattie cardiache genetiche come la cardiomiopatia ipertrofica.

Infatti, questo metodo può essere utilizzato per testare nuovi approcci neuropatici su cardiomiociti ventricolari di pazienti con cardiopatie ipertrofiche o ischemiche che hanno subito un intervento chirurgico al cuore. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta confrontando l'analogia tra campioni di arteria umana e biopsie ventricolari ottenute durante la cardiochirurgia. Iniziare questa procedura versando 40 millilitri di soluzione cardioplegica in una provetta da 50 millilitri e conservarla nel ghiaccio per il trasporto del campione dalla sala operatoria al laboratorio di isolamento cellulare, trasferire rapidamente il campione nell'area del laboratorio e avviare l'elaborazione del campione entro 10 minuti dall'escissione del campione.

Successivo campione miocardico ventricolare collettivo dalla sala operatoria subito dopo l'escissione. Lavarlo con una soluzione CP ghiacciata e conservarlo nella provetta mantenendo il campione in un tampone CP ghiacciato. Rimuovere con cautela lo strato fibrotico endocardico utilizzando le forbici sottili.

Tagliare il tessuto miocardico in piccoli pezzi lunghi due o tre millimetri con la quantità totale di miocardio ventricolare compresa tra 100 milligrammi e un grammo per ogni isolamento. Dopo che i pezzi sono stati trasferiti nella camera raschiante del dispositivo di digestione, sostituire il tampone CP nella camera con un tampone di dissociazione freddo privo di calcio. Quindi posizionare il dispositivo di digestione in un bagno termostatico.

Imposta il bagno a 37,5 gradi Celsius e accendilo. Quindi accendere il motore del dispositivo di digestione e impostare la velocità di rotazione su un giro al secondo. Eseguire tre cicli di lavaggio con DB e cambiare la soluzione nella camera con DB pulito saturo di ossigeno a 37 gradi Celsius ogni otto minuti.

Successivamente, preparare il tampone enzimatico uno aggiungendo 250 unità per millilitro di collagenasi di tipo cinque e quattro unità per millilitro di proteasi. Digitare 24 per la soluzione DB. Quindi preparare il tampone enzimatico due aggiungendo 250 unità per millilitro di collagenasi.

Digitare cinque alla soluzione DB ossigenare EB uno e riscaldarlo fino a 37 gradi Celsius. Quindi eseguire due cicli di digestione di 12 minuti nel dispositivo di digestione rotante con tre millilitri di EB ossigenato al 100%, uno a 37 gradi Celsius. Rimuovere la soluzione mediante aspirazione con pipetta ed eliminarla dopo ogni ciclo.

Successivamente, prepara sei provette da 15 millilitri per la raccolta delle cellule e 80 millilitri di soluzione artigianale a quattro gradi Celsius per eludere i tamponi ossigenare EB due e lavorarlo fino a 37 gradi Celsius. Successivamente, eseguire un primo ciclo di digestione di 15 minuti con tre millilitri di EB ossigenato al 100% due a 37 gradi Celsius. Dopo il ciclo di digestione, raccogliere la soluzione contenente i primi miociti associati in una provetta da 15 millilitri e diluire la sospensione cellulare con 12 millilitri di soluzione fredda di KB.

Conservare la provetta in piano a temperatura ambiente, eseguire altri cinque cicli di digestione di 12 minuti con tre millilitri di EB, due a 37 gradi Celsius, e raccogliere il tampone contenente il miocita ad ogni ciclo in una provetta conica da 15 millilitri. Ricordarsi di diluire anche il tampone raccolto da tre millilitri con 12 millilitri di soluzione KB ad ogni ciclo. Al termine, conservare le sei celle contenenti le provette a temperatura ambiente.

In questa fase, aggiungere un milligrammo per millilitro di albumina sierica bovina a 20 millilitri di tampone tirochimico libero dal calcio. Quindi filtrare la soluzione, quindi centrifugare i sei miociti contenenti provette coniche a 100 formaggio per cinque minuti. Per forzare i miociti a depositarsi, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in ciascuna provetta con una quantità variabile di BSA contenente TB a temperatura ambiente.

Aumentare gradualmente la concentrazione di calcio nella cellula contenente tampone aggiungendo piccoli OTT di 100 millimolari per litro di soluzione di cloruro di calcio nella prima e nella seconda fase. La concentrazione di calcio è aumentata rispettivamente a 50 micro molari per litro e 100 micro molari per litro. Le seguenti fasi di aggiunta di calcio vengono eseguite ogni cinque minuti e la concentrazione viene aumentata di 100 micromolari per litro ad ogni passaggio fino a una concentrazione finale di 0,9 millimolari per litro.

Per valutare la resa della procedura di isolamento, trasferire 0,5 millilitri di soluzione contenente miociti sulla camera inferiore in vetro di un microscopio. Valuta 15 campi del microscopio con un ingrandimento dell'obiettivo di 10 volte e calcola la percentuale di miociti sani, come le cellule a forma di bastoncello, con striature chiare e senza inclusioni significative. Le rese attese dovrebbero essere di circa il 20% per dimostrare la valutazione funzionale dei cardiomiociti umani, comprese le registrazioni simultanee dei potenziali d'azione e dei flussi intracellulari di calcio.

Innanzitutto, preparare la soluzione della pipetta per gli esperimenti di patch clamp in configurazione patch perforata. Quindi aggiungere 1,8 millimolari di cloruro di calcio alla tubercolosi libera da calcio. Utilizzare la soluzione per la superfusione dei cardiomiociti durante gli esperimenti di fluorescenza con patch clamp.

Quindi, trasferire un millilitro di sospensione cellulare in una provetta da 1,5 millilitri e aggiungere 10 micromolari per litro di influenza e 10 microlitri di carico di potenza. Concentrato, incubato per 30 minuti a temperatura ambiente in posizione orizzontale. Successivamente, impostare la provetta in posizione verticale e lasciare riposare le cellule per cinque minuti.

Quindi pipettare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in calcio contenente tb. Punto di trasferimento 25 millilitri di sospensione cellulare in una piccola camera di registrazione montata su microscopio a temperatura controllata. Super fuso per gravità con un sistema micro fuer riscaldato a una portata di 0,3 millilitri al minuto a 37 gradi Celsius.

Utilizzando un estrattore per micropipette, preparare pipette patch clamp con un diametro del puntale da tre a cinque micrometri e una resistenza da tre a 4,5 mega ohm quando riempite con ps. Successivamente, aggiungere l'amfotericina B al PS a 250 microgrammi per millilitro e utilizzarla per riempire gli elettrodi, quindi montare l'elettrodo sul supporto della pipetta. Quindi, seleziona la cella a forma di Ron con striature chiare e priva di inclusioni.

Formare il sigillo giga e attendere da cinque a 10 minuti fino a quando la resistenza di accesso scende al di sotto di 20 ohm. Successivamente suscita potenziali d'azione in modalità current clamp utilizzando impulsi brevi a diverse frequenze di stimolazione. Durante la fase di registrazione, attivare l'illuminazione a campo chiaro a 492 nanometri e rilevare la fluorescenza del fluoro a 505-520 nanometri.

Quindi acquisire i segnali di fluorescenza e potenziale di membrana. Questa figura mostra le alterazioni dei potenziali d'azione nei cardiomiociti ventricolari dai campioni di HCM. Ecco i potenziali d'azione sovrapposti rappresentativi elisi a 0,2 hertz, 0,5 hertz e un hertz da un miocita di controllo e da un miocita HCM.

I potenziali d'azione sovrapposti a 0,5 hertz da un miocita di controllo. Nell'assenza e nella presenza di 10-sette molari viene mostrato l'isoproterenolo, ed ecco la traccia rappresentativa del potenziale di membrana di un cardiomiocita da un paziente con HCM, che ha mostrato diverse depolarizzazioni spontanee subito dopo le depolarizzazioni. La figura mostra le alterazioni del transitorio di calcio nei cardiomiociti ventricolari dai campioni di HCM.

Ecco il transitorio di calcio sovrapposto rappresentativo suscitato durante la stimolazione a 0,2 hertz tramite la pipetta patch in un miocita di controllo e una cellula HCM. Viene mostrata la cinetica dei transitori di calcio nell'HCM e nei cardiomiociti di controllo in tempi diversi, e qui sono riportate le lunghe tracce rappresentative che mostrano il calcio intracellulare durante la stimolazione a tre diverse frequenze, il che evidenzia l'aumento del calcio diastolico ad alte velocità di stimolazione nel miocita HCM. Questa figura mostra le ulteriori applicazioni sperimentali utilizzando miociti ventricolari umani.

Le tracce sovrapposte rappresentative che mostrano la corrente di calcio di tipo L registrata a diverse tensioni di membrana sono mostrate a sinistra, e la densità media di picco della corrente di calcio di tipo L da 18 cellule isolate da campioni HCM a diverse tensioni di membrana è mostrata a destra e qui è mostrata la traccia intracellulare di calcio registrata da un miocita ventricolare durante la stimolazione del campo elettrico a un hertz. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di iniziare la procedura poco dopo il prelievo del campione dalla sala operatoria al fine di garantire che dopo questa procedura si isoli i cardiomiociti ventricolari umani. Altri metodi possono essere eseguiti come la microscopia confocale dello stile di vita o l'immunochimica, e questo sarà fondamentale per rispondere a domande fondamentali come, ad esempio, come la localizzazione subcellulare delle strutture di membrana e delle unità di rilascio del calcio viene alterata nelle malattie cardiache dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada alla cardiologia cellulare per studiare le anomalie funzionali nei cardiomiociti ventricolari e per testare la potenziale utilità di nuove opzioni terapeutiche. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare singoli cardiomiociti vitali da campioni umani e come caratterizzare la funzione cellulare in diverse condizioni.