Isolamento e caratterizzazione funzionale di Human ventricolare Cardiomyocytes da campioni freschi chirurgici

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare cardiomiociti vitali da campioni ventricolari umani patologici e caratterizzare le loro alterazioni funzionali. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo e trinciando rapidamente campioni ventricolari freschi in una soluzione cardioplegica ghiacciata, al fine di evitare un'eccessiva degradazione del tessuto e danni cellulari. Il secondo passaggio consiste nell'eseguire una digestione progressiva dei frammenti miocardici utilizzando un dispositivo di digestione su misura e soluzioni enzimatiche.

In sei cicli, la cellula contenente il tampone viene raccolta in un tubo ad ogni ciclo e diluita con una soluzione di conservazione cellulare. L'ultimo passaggio consiste nel risospendere le cellule contenute nei sei tubi in un volume minore di soluzione fisiologica standard con concentrazioni normali di calcio, al fine di eseguire la caratterizzazione funzionale. Infine, la registrazione mediante patch clamp dei potenziali d'azione e la valutazione simultanea del calcio intracellulare mediante coloranti fluorescenti vengono utilizzate per mostrare le alterazioni della durata del potenziale d'azione e del ciclo del calcio intracellulare nei cardiomiociti di pazienti affetti da cardiomiopatia ipertrofica.

Il principale vantaggio del metodo DYS unico rispetto a un approccio da 16 passaggi, come il metodo standard di espulsione dei frammenti, è che in associazione con una soluzione enzimatica, utilizziamo un dispositivo personalizzato per la digestione, che permette una dissociazione congiunta di citi variabili grazie alle sue spatole in silicone. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della cardiologia, ad esempio in che modo il noto rimodellamento molecolare e strutturale associato alle malattie cardiache si traduce in alterazioni di singoli cardiomiociti, analizzabili tramite il nostro metodo e bersagliabili con farmaci specifici. Le implicazioni di questa tecnica si estendono quindi alla terapia delle malattie cardiache genetiche, come la cardiomiopatia ipertrofica.

In effetti, questo metodo può essere utilizzato per testare nuovi approcci neuro-patologici su cardiomiociti ventricolari provenienti da pazienti affetti da patologie cardiache ipertrofiche o ischemiche che hanno subito un intervento chirurgico al cuore. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo confrontando l'analogia tra campioni di arteria umana e biopsie ventricolari ottenute durante un intervento cardiochirurgico. Iniziare questa procedura versando 40 millilitri di soluzione cardioplegica in un tubo da 50 millilitri e conservarla in ghiaccio per il trasporto del campione dalla sala operatoria al laboratorio di isolamento cellulare; trasferire rapidamente il campione nell'area del laboratorio e iniziare l'elaborazione del campione entro 10 minuti dall'escissione.

Prelevare successivamente il campione collettivo di miocardio ventricolare dalla sala operatoria immediatamente dopo l'escissione. Lavarlo con soluzione CP fredda di ghiaccio e conservarlo nel tubo mantenendo il campione in tampone CP freddo di ghiaccio. Rimuovere con attenzione lo strato fibrotico endocardico utilizzando forbici fini in un secondo momento.

Tagliare il tessuto miocardico in piccoli pezzi lunghi due-tre millimetri, con una quantità totale di miocardio ventricolare compresa tra 100 milligrammi e un grammo per ogni isolamento. Dopo aver trasferito i frammenti nella camera di raschiatura del dispositivo di digestione, sostituire il buffer CP nella camera con buffer di dissociazione privo di calcio e freddo. Successivamente, posizionare il dispositivo di digestione in un bagno termostatico.

Impostare il bagno a 37,5 gradi Celsius e accenderlo. Successivamente, accendere il motore del dispositivo di digestione e impostare la velocità di rotazione a un giro al secondo. Eseguire tre cicli di lavaggio con DB e sostituire la soluzione nella camera con DB pulito saturato di ossigeno a 37 gradi Celsius ogni otto minuti.

Successivamente, preparare il buffer enzimatico uno aggiungendo 250 unità per millilitro di collaghenasi di tipo cinque e quattro unità per millilitro di proteasi. Tipo 24 alla soluzione DB. Quindi preparare il buffer enzimatico due aggiungendo 250 unità per millilitro di collaghenasi.

Aggiungere cinque alla soluzione DB di EB uno ossigenato e riscaldare a 37 gradi Celsius. Quindi eseguire due cicli di digestione di 12 minuti ciascuno nel dispositivo di digestione rotante, utilizzando tre millilitri di EB uno al 100% ossigenato a 37 gradi Celsius. Rimuovere la soluzione mediante aspirazione con pipetta e scartarla dopo ogni ciclo.

Successivamente, preparare sei provette da 15 millilitri per la raccolta delle cellule e 80 millilitri di soluzione craft brew a quattro gradi Celsius per eliminare i tamponi ossigenati EB2 e portarla a 37 gradi Celsius. In seguito, eseguire un primo ciclo di digestione di 15 minuti con tre millilitri di EB2 al 100% ossigenato a 37 gradi Celsius. Al termine del ciclo di digestione, raccogliere la soluzione contenente i primi miociti associati in una provetta da 15 millilitri e diluire la sospensione cellulare con 12 millilitri di soluzione KB fredda.

Conservare il tubo in posizione orizzontale a temperatura ambiente, eseguire altri cinque cicli di digestione di 12 minuti ciascuno con tre millilitri di EB due a 37 gradi Celsius e raccogliere il tampone contenente i miociti ad ogni ciclo in un tubo conico da 15 millilitri. Ricordare di diluire anche il tampone raccolto da tre millilitri con 12 millilitri di soluzione KB ad ogni ciclo. Alla fine, conservare i sei tubi contenenti le cellule a temperatura ambiente.

In questo passaggio, aggiungere un milligrammo per millilitro di albumina sierica bovina a 20 millilitri di tampone Tyro senza calcio. Quindi filtrare la soluzione e centrifugare successivamente i sei tubi conici contenenti miociti a 100 ×g per cinque minuti. Per favorire l'insediamento dei miociti, rimuovere il soprannatante e risospendere le cellule in ciascun tubo con una quantità variabile di TB contenente BSA a temperatura ambiente.

Aumentare gradualmente la concentrazione di calcio nel contenitore con tampone aggiungendo piccole OTT di soluzione di cloruro di calcio 100 millimolare per litro al primo e al secondo passaggio. La concentrazione di calcio viene innalzata rispettivamente a 50 micromolari per litro e a 100 micromolari per litro. I successivi passaggi di aggiunta di calcio vengono eseguiti ogni cinque minuti, e la concentrazione viene aumentata di 100 micromolare per litro a ogni passaggio, fino a una concentrazione finale di 0,9 millimolare per litro.

Per valutare il rendimento della procedura di isolamento, trasferire 0,5 millilitri di soluzione contenente miociti sulla camera con fondo in vetro del microscopio. Valutare 15 campi microscopici con un obiettivo di ingrandimento 10x e calcolare la percentuale di miociti sani, come le cellule a forma di bastoncello con striature evidenti e senza inclusioni significative. I rendimenti attesi dovrebbero essere intorno al 20% per dimostrare la valutazione funzionale dei cardiomiociti umani, inclusa la registrazione simultanea dei potenziali d'azione e dei flussi intracellulari di calcio.

Preparare innanzitutto la soluzione per pipetta per esperimenti di patch clamp in configurazione con perforazione della membrana. Quindi aggiungere 1,8 millimolare di cloruro di calcio al tb senza calcio. Utilizzare la soluzione per la superfusione dei cardiomiociti durante gli esperimenti di fluorescenza in patch clamp.

Successivamente, trasferire un millilitro di sospensione cellulare in una provetta da 1,5 millilitri e aggiungere flu fort a 10 micromolare per litro e 10 microlitri di power load. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente in posizione orizzontale. Successivamente, posizionare la provetta in posizione verticale e lasciare sedimentare le cellule per cinque minuti.

Quindi pipettare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in un tampone contenente calcio. Trasferire 0,25 millilitri di sospensione cellulare in una piccola camera di registrazione montata su microscopio e a temperatura controllata. Superfondere per gravità con un sistema microfuso riscaldato a un flusso di 0,3 millilitri al minuto a 37 gradi Celsius.

Utilizzando un estrattore per micropipette, preparare pipette per patch clamp con un diametro della punta compreso tra tre e cinque micrometri e una resistenza compresa tra tre e 4,5 megaohm quando riempite con ps. Successivamente, aggiungere l'amfotericina B al PS alla concentrazione di 250 microgrammi per millilitro e utilizzarla per riempire le elettrodi, quindi montare l'elettrodo sul supporto per pipetta. In seguito, selezionare la cellula di forma Ron con striature evidenti e priva di inclusioni.

Formare il sigillo giga e attendere da cinque a dieci minuti fino a quando la resistenza di accesso scende al di sotto di 20 ohm. Successivamente, evocare potenziali d'azione in modalità clamp di corrente utilizzando brevi impulsi a diverse frequenze di stimolazione. Durante la fase di registrazione, accendere l'illuminazione in campo chiaro a 492 nanometri e rilevare la fluorescenza di Fluor fort a 505-520 nanometri.

Quindi acquisire i segnali di fluorescenza e potenziale di membrana. Questa figura mostra le alterazioni dei potenziali d'azione nei cardiomiociti ventricolari provenienti dai campioni di MCH. Di seguito sono riportati i potenziali d'azione rappresentativi sovrapposti, eliciti a 0,2 hertz, 0,5 hertz e un hertz, provenienti da un miocita di controllo e da un miocita MCH.

I potenziali d'azione sovrapposti a 0,5 hertz di un miocita di controllo. Sono mostrati in assenza e in presenza di isoproterenolo 10 alla meno sette moli. Qui è riportata la traccia rappresentativa del potenziale di membrana di un cardiomiocita proveniente da un paziente con miocardiopatia ipertrofica (HCM), che ha mostrato diverse depolarizzazioni spontanee precoci dopo la depolarizzazione. La figura mostra le alterazioni del transitorio del calcio nei cardiomiociti ventricolari provenienti dai campioni di HCM.

Ecco i transitori rappresentativi del calcio sovrapposti, eliciti mediante stimolazione a 0,2 hertz attraverso la pipetta per patch in un miocita di controllo e in una cellula con MCH. Vengono mostrate la cinetica dei transitori del calcio in miociti cardioci con MCH e di controllo in diversi momenti temporali, e di seguito tracce rappresentative prolungate che mostrano il calcio intracellulare durante stimolazione a tre diverse frequenze, evidenziando l'aumento del calcio diastolico a frequenze di stimolazione elevate nel miocita con MCH. Questa figura mostra ulteriori applicazioni sperimentali mediante l'uso di miociti ventricolari umani.

I tracciati sovrapposti rappresentativi che mostrano la corrente calcica di tipo L registrata a diverse tensioni di membrana sono mostrati a sinistra, mentre a destra è riportata la densità media del picco della corrente calcica di tipo L da 18 cellule isolate da campioni di MCH a diverse tensioni di membrana ed è mostrato qui il tracciato del calcio intracellulare registrato da un miocita ventricolare durante stimolazione elettrica a campo a un hertz. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di iniziare il procedimento subito dopo il prelievo del campione dalla sala operatoria al fine di garantire ses Seguendo questa procedura per isolare i cardiomiociti ventricolari umani. Possono essere eseguiti altri metodi come microscopia confocale a scansione laser o immunoistochimica, e ciò sarà cruciale per rispondere a domande fondamentali come, ad esempio, come la localizzazione subcellulare delle strutture di membrana e delle unità di rilascio del calcio venga alterata nelle malattie cardiache Dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada nella cardiologia cellulare per lo studio delle anomalie funzionali nei cardiomiociti ventricolari e per testare l'utilità potenziale di nuove opzioni terapeutiche. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare singoli cardiomiociti vitali da campioni umani e di come caratterizzare la funzione cellulare in diverse condizioni.