Name: RNA-seq Analisi trascrittomi in trombina-trattati e di controllo delluomo polmonari cellule endoteliali microvascolari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 30 s
Description: Impara l'analisi RNA-seq del trascrittoma in cellule endoteliali microvascolari polmonari umane trattate con trombina. Questo metodo include isolamento dell'RNA, costruzione di librerie e sequenziamento.

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Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Stephen Kingsmore e il Pediatric Medicine Center Genome presso Ospedali Mercy bambini e cliniche per l&#39;uso dei loro cluster di calcolo per l&#39;analisi dei dati, il campo Illumina di assistenza tecnica (Elizabeth Boyer, Scott Cook e Mark Cook) e tecnica team di consulenti per le loro risposte rapide e suggerimenti utili sul funzionamento dello strumento di prossima generazione di sequenziamento del DNA, HiScanSQ, e la qualità dei dati di analisi. Questo lavoro è stato in parte finanziato dal National Institutes of Health di Grant HL080042 (a SQY) e start-up fondo di dotazione e degli Ospedali Mercy bambini e Cliniche, Università del Missouri a Kansas City (a SQY).

<html> Un diagramma di flusso che illustra questo protocollo è mostrato in Figura 1. 1. Il trattamento delle cellule con la trombina, l&#39;RNA Isolation, della Qualità e di quantificazione di RNA <ol><li> La cultura umana del polmone cellule endoteliali microvascolari (HMVEC-LBL) al 90-100% confluenza in piastre da 6 pozzetti in EGM-2 media al 5% di FBS, fattori di crescita e gli antibiotici (Lonza, cat # CC-3202). </li><li> Cambiare supporto ai media fame (0% FBS) 30 minuti prima del trattamento con trombina. </li><li> Trattare le cellule con 0,05 U / ml di trombina o lasciato non trattato come un controllo per 6 ore a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Isolare RNA totale dalle cellule trattate e di controllo con il Ambion mir Vana kit secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Valutare la qualità del RNA con un eucariote Experion StdSense chip di RNA in base al protocollo standard Automated Stazione elettroforesi Experion (= &quot;_blank&quot;&gt; Www.bio-rad.com). </li><li> Quantificare l&#39;RNA utilizzando un metodo standard spettrofotometrico. </li></ol> 2. Biblioteca Edilizia e Sequencing <ol><li> Usare 1 pg di RNA di alta qualità totale per campione come materiale di partenza. </li><li> Per costruire la biblioteca, seguire la procedura standard da Illumina (protocollo # 15008136 Rev. A). In questo protocollo, due cicli di poly (A) dell&#39;mRNA contenenti selezioni vengono eseguite per rimuovere rRNA per minimizzare il sequenziamento rRNA. </li><li> Valutare la qualità delle biblioteche utilizzando un chip di DNA 1K Experion secondo il protocollo standard sulla Stazione Experion elettroforesi automatica ( <a href="http://www.bio-rad.com" target="_blank">www.bio-rad.com</a> ). </li><li> Quantificare la libreria utilizzando qPCR: Utilizzare una libreria che è già stato sequenziato da una curva standard e primer specifici per gli adattatori legato. Utilizzare una serie di diluizioni delle biblioteche sconosciute (cioè 1:100, 1:500 e 1:1000). Eseguire l&#39;acco qPCRrding al protocollo SyberGreen MM e calcolare la concentrazione originale stock di ogni libreria. </li><li> Diluire le scorte di libreria a 10 nM e conservare a -20 ° C fino al momento di cluster di una cella di flusso. </li><li> Quando si è pronti a raggrupparsi una cella di flusso, scongelare la piastra CBOT reagente in un bagno d&#39;acqua. CBOT è uno strumento Illumina utilizzato per semplificare il processo di generazione di cluster. </li><li> Lavare lo strumento CBOT. </li><li> Denaturare le librerie: Combinare 13 microlitri 1x TE e 6 microlitri 10 mM biblioteca e, al lato del tubo, aggiungere 1 ml di NaOH 1 N (fornito da Illumina). Vortex, spin down, incubare a temperatura ambiente per 5 minuti e posizionare le librerie denaturati su ghiaccio. </li><li> Diluire le librerie: Diluire le librerie denaturato con pre-raffreddata tampone di ibridazione (HT1, fornito da Illumina) combinando 996 microlitri HT1 e 4 microlitri biblioteca denaturato per una concentrazione finale di 12 pM. Posizionare le librerie denaturati e diluito su ghiaccio. </li><li> Capovolgere ogni fila di tubi della piastra CBOT,assicurare che tutti i reagenti vengono scongelate. Centrifugare la piastra, rimuovere / forare le guarnizioni strisce e caricare sul CBOT. </li><li> Aliquotare 120 ml di diluito, le biblioteche denaturati a un cilindro delle strisce, etichetta 1-8. Aggiungere 1,2 microlitri diluito, denaturati biblioteca controllo PhiX (da Illumina) in ciascuna provetta come un picco-in controllo. Vortex e centrifugare le provette e caricarli sul CBOT con l&#39;orientamento corretto (tubo # 1 verso destra). </li><li> Caricare una cella di flusso e collettore sul CBOT. </li><li> Completate il flusso di controllo e iniziare la corsa di clustering. </li><li> Una volta completata l&#39;analisi, controllare la consegna dei reagenti in tutte le corsie. Prendere nota di eventuali anomalie. O iniziare la corsa di sequenziamento immediatamente o conservare la cella di flusso nel tubo fornito a 4 ° C. </li><li> Scongelare il sequenziamento per sintesi (SBS, Illumina) reagenti. </li><li> Caricare i reagenti ai punti giusti sui vassoi reagenti, facendo attenzione a non toccare gli altri reagenti dopo aver toccato il mix scissione. </li><li> Utilizzando un non-sequenziamento cella di flusso (vale a dire quello che è stato sequenziato in precedenza), le linee dei reagenti prime due volte. </li><li> Pulire accuratamente la cella di flusso di sequenza con il 70% EtOH e Kimwipes, seguito dal 70% EtOH e salviette. Ispezionare la cella di flusso per eventuali aloni. Re-pulirlo se necessario. </li><li> Caricare la cella di flusso sul sequencer ed eseguire un flusso di controllare che la tenuta tra il collettore e la cella di flusso è stretto. </li><li> Avviare la corsa di sequenziamento. </li><li> Valutare le metriche di qualità (ad esempio, la densità di cluster, i cluster di passaggio filtro, Q30, di intensità) che vengono resi disponibili durante la corsa. </li><li> Monitorare l&#39;intensità per tutta la corsa. </li><li> Dopo 101 cicli sono completati, effettuare chimica turnaround per completare la seconda lettura: Scongelare i reagenti terminali accoppiati e il secondo tampone Incorporation lettura (ICB, un componente di reagenti SBS, Illumina) e caricare i reagenti. </li><li> Continua la corsa di sequenziamento, valutazione 2 ° letto intensità, Q30 unmetriche di qualità nd altre i progressi di esecuzione. </li></ol> 3. Analisi dei dati <ol><li> Utilizzare la versione più recente di casava (Illumina, attualmente 1.8.2) per convertire i file di base (chiamate. Bcl) file per file. Fastq, impostando fastq-cluster-count a 0 per garantire la creazione di un file fastq unico per ogni campione . Decomprimere i file fastq per l&#39;analisi a valle. </li><li> Eseguire l&#39;allineamento fine accoppiato con le ultime versioni di TopHat (1.4.1) 5, che allinea l&#39;RNA-seq legge di mammiferi di dimensioni genomi utilizzando l&#39;ultra high-throughput allineatore breve lettura (, Bowtie 0.12.7) 6 e SAMtools (0.1. 17) 7. SAMtools implementa varie utilità per la post-elaborazione allineamenti in formato SAM. Il trascrittoma umano di riferimento può essere scaricato dal iGenomes ( <a href="http://www.illumina.com" target="_blank">www.illumina.com</a> ). In esecuzione TopHat, abbiamo usato tutte le impostazioni di default dei parametri tra cui l&#39;opzione di libreria dei tipi come fr-unstranded (default). </li><li> Noizione del programma CuffDiff, parte dei gemelli (1.3.0) 8 pacchetto software, confronta le cellule trattate con trombina alle cellule controlli per escludere dei trascritti genici differenzialmente espressi nella ex basato sul trascrittoma umano di riferimento. Questo confronto rileva l&#39;espressione differenziale dei trascritti noti. Utilizzare Microsoft Excel per visualizzare il risultato sotto forma di tabella. In esecuzione del programma Gemelli, abbiamo usato tutte le impostazioni di default dei parametri. Le trascrizioni del gene con FPKM &lt;0,05 e p&gt; 0,05 sono filtrati. </li><li> Per rilevare isoforme nuovi, eseguire Gemelli senza un trascrittoma di riferimento. Confronta i file di esempio trascrizione al genoma di riferimento usando Cuffcompare e testare l&#39;espressione differenziale con Cuffdiff utilizzando i file combinati trascrizione della trombina come il genoma di riferimento per una analisi e le file di controllo combinati trascrizione come il genoma di riferimento per una seconda analisi. Utilizzare Microsoft Excel per visualizzare il risultato in formato tabulare. Nuovamente, thostrascrizioni elettroniche gene con FPKM &lt;0,05 e p&gt; 0,05 sono filtrati. Dopo questo passo, gli investigatori possono scegliere di caricare un elenco di trascrizioni segnalate di recente al sito UCSC Genome Browser ( <a href="http://genome.ucsc.edu/" target="_blank">http://genome.ucsc.edu/</a> ) per verificare la validità di un controllo manuale. </li><li> Presentazione delle liste di geni differenzialmente espressi Analisi Ingenuity Pathway (IPA, <a href="www.ingenuity.com" target="_blank">www.ingenuity.com</a> ) per la caratterizzazione dei geni e le vie interessate dal trattamento trombina. In questa fase, gli investigatori possono scegliere di utilizzare cummerbund ( <a href="http://compbio.mit.edu/cummeRbund/" target="_blank">http://compbio.mit.edu/cummeRbund/</a> ), un pacchetto di R che è stato progettato per aiutare e semplificare il compito di analizzare Gemelli RNA-seq uscita, per aiutare a gestire, visualizzare e integrare tutti i dati prodotti da una analisi Cuffdiff. </li></ol> 4. Validazione dei RNA-Seq Risultati della quantitativa in tempo reale-Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) <ol><li> Eseguire isolamento dell&#39;RNA totale di controllo e la trombina trattati HMVEC-LBL cellule, RNA qualità di valutazione e quantificazione RNA descritto nei passi 1,4-1,6. </li><li> Generazione di DNA complementare da 1 mcg RNA totale di ciascun campione con SuperScript III First-Strand Synthesis Kit sistema RT, seguendo le istruzioni del produttore (Invitrogen, 18080-051). </li><li> Eseguire qRT-PCR su Applied Biosystems VIIa 7 Real-Time PCR System utilizzando Taqman Assay-on-Demand oligonucleotidi progettati per l&#39;individuazione di CUGBP, Elav-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor -associated factor 1 (TRAF1, Hs01090170_m1), e β-actina (ACTB, Hs99999903_m1). Ogni campione aveva un modello equivalente a 5 ng di RNA totale. Misurare quantificazione con il metodo DDCT e normalizzare per β-actina. Ogni saggio è stato eseguito in almeno tre repliche biologiche. </li></ol>

<ol><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li>
<li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq%3A+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).</li>
<li>Zhang, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+Reveals+Novel+Transcriptome+of+Genes+and+Their+Isoforms+in+Human+Pulmonary+Microvascular+Endothelial+Cells+Treated+with+Thrombin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin.</a> PLoS One. 7, e31229(2012).</li>
<li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat%3A+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).</li>
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<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).</li>
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<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).</li>
<li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+assembly+and+analysis+of+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">De novo assembly and analysis of RNA-seq data.</a> Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).</li>
<li>Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+methods+for+transcriptome+annotation+and+quantification+using+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq.</a> Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).</li>
<li>Martin, J. A., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+transcriptome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Next-generation transcriptome assembly.</a> Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Passaggi chiave Manipolazione di RNA: RNasi peggiora anche i più di alta qualità RNA, pertanto è necessario prestare attenzione durante l&#39;isolamento, lo stoccaggio e l&#39;uso di RNA 10. I guanti sono sempre indossati per prevenire la contaminazione da RNasi presenti sulle mani umane. I guanti devono essere cambiati spesso, in particolare dopo la pelle toccare, maniglie delle porte o altre superfici comuni. Una serie di pipette deve essere dedicato esclusivamente...

<table border="1"><tbody><tr><td width="183"> Reagenti o Attrezzature </td><td width="85"> Azienda </td><td width="185"> Numero di catalogo </td><td width="359"> Commenti </td></tr><tr><td> Umani del polmone cellule endoteliali microvascolari </td><td> Lonza </td><td> CC-2815 </td><td></td></tr><tr><td> Lonza, Kit proiettile </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td> Contiene EGM-2, FBS, fattori di crescita e antibiotici </td></tr><tr><td> Trombina </td><td> Sigma </td><td> T4393 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion mir Vana Kit </td><td> Life Technologies </td><td> AM 1560 </td><td></td></tr><tr><td> RNase-Zap </td><td> Life Technologies </td><td> AM9782 </td><td></td></tr><tr><td> Experion StdSens RNA </td><td> Bio-Rad </td><td> 700-7103 </td><td></td></tr><tr><td> TruSeq RNA PreparazioneKit </td><td> Illumina </td><td> FC-122-1001 </td><td></td></tr><tr><td> AMPureXP Perline </td><td> Beckman Coulter </td><td> A63881 </td><td></td></tr><tr><td> Superscript Reverse Transcriptase II </td><td> Life Technologies </td><td> 18064-014 </td><td></td></tr><tr><td> Experion DNA 1K </td><td> Bio-Rad </td><td> 700-7107 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiTect SyberGreen </td><td> Qiagen </td><td> 204163 </td><td></td></tr><tr><td> PE Cluster Generation Kit </td><td> Illumina </td><td> PE-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> PhiX Kit di controllo </td><td> Illumina </td><td> FC110-301 </td><td></td></tr><tr><td> 200 Ciclo di SBS Kit </td><td> Illumina </td><td> FC-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> HiScanSQ * </td><td> Illumina </td><td> SY-103-2001 </td><td></td></tr><tr><td> CBOT </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td></td></tr><tr><td> qPCR macchina - Viia7 </td><td> Life Technologies </td><td> Model # VIIA7 / Accessori # 10631261 </td><td> O equivalente </td></tr><tr><td> Experion sistema </td><td> Bio Rad </td><td> 7007001 </td><td> Bioanalyzer è un sistema alternativo </td></tr><tr><td> Spettrofotometro </td><td> Bio-Tek </td><td> Spettrofotometro per micropiastre Epoch </td><td> O equivalente </td></tr><tr><td> Centrifuga - Sorvall Legenda XTR </td><td> Thermo Scientific </td><td> 75004521 </td><td> O equivalente </td></tr><tr><td> Supporto magnetico </td><td> Life Technologies </td><td> AM10027 </td><td></td></tr><tr><td> 96 pozzetti termociclatore </td><td> Generale Lab Fornitore </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 3. Elenco dei reagenti chiave e mi maggiorequipment. *, Nel video, invece di HiSeq1000 HiScanSQ è stata dimostrata. </td></tr></tbody></table>

rna-seq analisi trascrittomi in trombina-trattati e di controllo dell&#39;uomo polmonari cellule endoteliali microvascolari

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

La caratterizzazione di espressione genica in cellule attraverso la misurazione dei livelli di mRNA è uno strumento utile nel determinare come la macchina di trascrizione della cellula è influenzata da segnali esterni (per esempio trattamento di droga), o come cellule differiscono tra uno stato di salute e di uno stato di malattia. Con l&#39;avvento e il perfezionamento continuo della prossima generazione di tecnologia di sequenziamento del DNA, RNA-sequenziamento (RNA-seq) è diventato un metodo sempre più popolare di analisi del trascrittoma di catalogare tutte le specie di trascrizioni, per determinare la struttura della trascrizione di tutti i geni espressi e di quantificare i livelli di espressione di cambiamento del set totale di trascritti in un dato 1,2 cellula, tessuto o organismo. RNA-seq sostituisce progressivamente DNA microarrays come metodo preferito per l&#39;analisi del trascrittoma perché ha i vantaggi di una profilatura transcriptome completa, fornendo un tipo di dato digitale (numero di copie di ogni trascrizione) e non basandosi su qualsiasi sequen genomica notace 3. Qui vi presentiamo un protocollo completo e dettagliato di applicare RNA-seq per trascrittomi profilo in umano cellule endoteliali microvascolari polmonari con o senza trattamento trombina. Questo protocollo si basa sul nostro recente studio pubblicato dal titolo &quot;RNA-Seq rivela trascrittoma Romanzo di geni e loro isoforme umane in cellule endoteliali microvascolari polmonari trattati con trombina,&quot; 4 in cui abbiamo effettuato con successo la prima analisi completa del trascrittoma umane polmonari cellule endoteliali microvascolari trattate con trombina utilizzando RNA-seq. Ha prodotto le risorse senza precedenti per la sperimentazione ulteriore di acquisire conoscenze sui meccanismi molecolari alla base di trombina-mediata disfunzione endoteliale nella patogenesi di condizioni infiammatorie, il cancro, il diabete e le malattie cardiache coronariche, e fornisce nuovi indizi per potenziali bersagli terapeutici per queste malattie. Il testo descrittivo di questo protocolloè diviso in quattro parti. La prima parte descrive il trattamento di polmonari umane cellule endoteliali microvascolari con trombina e isolamento dell&#39;RNA, analisi della qualità e quantificazione. La seconda parte descrive la costruzione della libreria e sequenziamento. La terza parte descrive l&#39;analisi dei dati. La quarta parte descrive una RT-PCR convalida. I risultati rappresentativi di diversi passaggi chiave vengono visualizzati. Consigli utili o precauzioni per aumentare il successo in passaggi chiave sono forniti nella sezione di discussione. Sebbene questo protocollo utilizza polmonari umane cellule endoteliali microvascolari trattate con trombina, può essere generalizzato a trascrittomi profilo sia nelle cellule di mammiferi e non mammiferi e nei tessuti trattati con differenti stimoli o inibitori, o per confrontare trascrittomi in cellule o tessuti tra uno stato di salute e uno stato di malattia.

Per Fase 1: Il 28s: 18s rapporto è tradizionalmente utilizzato come indicatore di degradazione dell&#39;RNA. Idealmente, il picco 28s dovrebbe avere circa due volte l&#39;area della banda 18s (un rapporto di 2), tuttavia questo rapporto ideale spesso non viene osservata nella pratica. Inoltre, 28s: 18s rapporti ottenuti da metodi spettrofotometrici può sottovalutare la quantità di degradazione dell&#39;RNA. Per quantificare più accuratamente la degradazione, e quindi la qualità del campione RNA, il sist...

Questo protocollo presenta una procedura completa e dettagliata di applicare RNA-seq, una potente tecnologia di nuova generazione di sequenziamento del DNA, per trascrittomi profilo in umano cellule endoteliali microvascolari polmonari con o senza trattamento trombina. Questo protocollo è generalizzabile a varie cellule o tessuti colpiti da diversi reagenti o stati di malattia.

RNA-seq Analisi trascrittomi in trombina-trattati e di controllo dell&#39;uomo polmonari cellule endoteliali microvascolari

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di presentare un processo completo e dettagliato per applicare l'RNA-Seq, una potente tecnologia di sequenziamento del DNA di nuova generazione, per profilare i trascrittomi. Ciò si ottiene isolando prima l'RNA totale dalle cellule endoteliali microvascolari polmonari umane con o senza trattamento con trombina e controllando la qualità dell'RNA. Il secondo passo è quello di costruire librerie di DNA da quei campioni di RNA.Semplifica la generazione dei cluster utilizzando lo strumento cbot ed esegui l'attività di sequenziamento del DNA su HighSeq 1000. Successivamente viene eseguita l'analisi dei dati per identificare e visualizzare i trascritti genici differenzialmente espressi. Il passaggio finale consiste nel convalidare i risultati dell'aeq RN mediante RT TP CR. Il vantaggio principale dell'IC rispetto ai metodi esistenti come un micro array di DNA per l'analisi del trascrittoma è che l'IC può profilare un trascrittoma completo, fornire dati di tipo digitale e non fare affidamento su alcuna genomica nota dell'espressione genica nelle cellule.Mentre la misurazione del livello di MRA è uno strumento utile per determinare come la t

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RNA-sequenziamento e bioinformatica analisi sono stati utilizzati per identificare i fattori di trascrizione espressi in maniera significativa e differenziale in Lin-CD34 + e CD34- Lin-sottopopolazioni di EMLcells mouse. Questi fattori di trascrizione potrebbero svolgere un ruolo importante nel determinare lo switch tra le cellule Lin-CD34- auto-rinnovamento Lin-CD34 + e parzialmente differenziato.

Identificazione dei fattori chiave di regolazione auto-rinnovamento e differenziazione in cellule ematopoietiche precursori EML da Analysis RNA-sequencing

Endotelio vascolare controlla strettamente reclutamento leucocitario. Diapedesi inadeguata contribuiscono a malattie infiammatorie umane. Di conseguenza, alla ricerca di nuovi elementi regolatori dell'attivazione endoteliale è necessaria ideare terapie migliori per disordini infiammatori. Qui, descriviamo una metodologia globale per caratterizzare nuovi regolatori endoteliale che possono modificare del leucocita traffico durante l'infiammazione.

Saggi per caratterizzare nuovi endoteliale regolatori coinvolti nella risposta infiammatoria di screening

Un protocollo per l'induzione in vitro di transizione endoteliali mesenchimali (EndMT), che è utile per investigare le vie di segnalazione cellulare coinvolti nella EndMT, è descritto. In questo modello sperimentale, EndMT è indotta dal trattamento con TGF-β in cellule endoteliali MS-1.

Analisi molecolare di transizione endoteliali mesenchimali indotta dalla trasformazione di segnalazione di fattore di crescita-β

terapeutica di miRNA hanno un potenziale significativo nella regolazione della progressione del cancro. Ha dimostrato qui approcci analitici utilizzati per l'identificazione dell'attività di un trattamento di combinatoria miRNA nell'arrestare il ciclo cellulare e l'angiogenesi.

Analisi di miRNA combinatoria trattamenti per regolare il ciclo cellulare e l'angiogenesi

Presentiamo un approccio per purificare l'mRNA legato al ribosoma dalle cellule endoteliali vascolari (EC) direttamente nel cervello del topo, nei polmoni e nei tessuti cardiaci attraverso il tag genetico specifico della Proteina di fluorescenza verde avanzata (EGFP) nei ribosomi in combinazione con la purificazione dell'RNA .

Traduzione della purificazione dell'affinità del ribosoma (TRAP) per l'isolamento dell'RNA dalle cellule endoteliali In vivo

Presentiamo un modello di malattia vascolare in vitro per studiare le interazioni del sangue intero con l'endotelio derivato dal paziente. Questo sistema permette lo studio delle proprietà trombogeniche delle cellule endoteliali primarie in varie circostanze. Il metodo è particolarmente adatto per valutare in situ trombogenicità e terapia anticoagulante durante diverse fasi della coagulazione.

Modello di malattia microfluidico in vitro per studiare le interazioni sangue-endoteliali intere e le dinamiche del coagulo di sangue in tempo reale

Il protocollo descrive l'isolamento, la coltura e la profilazione delle cellule endoteliali dall'arteria mesenterica umana. Inoltre, viene fornito un metodo per preparare l'arteria umana per la trascrittomica spaziale. Proteomica, trascrittomica e saggi funzionali possono essere eseguiti su cellule isolate. Questo protocollo può essere riproposto per qualsiasi arteria di medie o grandi dimensioni.

Isolamento e profilazione delle cellule endoteliali arteriose mesenteriche primarie umane a livello di trascrittoma

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro che va dalle colture cellulari ex vivo o in vitro alla pre-elaborazione dei dati trascrittomici per uno screening farmacologico basato sul trascrittoma economicamente vantaggioso.

Screening farmacologico basato sulla trascrittomica efficiente in termini di costi

Questo protocollo include un flusso di lavoro passo dopo passo per campioni vascolari calcificati: gestione dei tessuti, decalcificazione, validazione dell'RNA, rilevamento dei livelli di calcificazione e strategie di selezione della regione di interesse sul Nanostring GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). L'obiettivo è presentare un metodo completo per preservare la morfologia del tessuto vascolare e l'RNA per un'analisi trascriromica spaziale affidabile.

Preparazione e elaborazione delle arterie calcificate con morfologia e RNA preservati per la profilazione spaziale digitale

Questo lavoro descrive un saggio microfluidico che utilizza lo stress di taglio per innescare la formazione di trombo nel sangue e caratterizza il trombo tramite molteplici dimensioni di lettura. Il test può misurare la tendenza protrombotica dei campioni di sangue ed è quindi utile nella diagnosi di malattie, nella scoperta di farmaci e in studi meccanicistici di base relativi alla trombosi.

Saggio di profilazione trombonica: una piattaforma basata sulla microfluidica per caratterizzare in modo completo la trombogenesi biomeccanica

Impara l'analisi RNA-seq del trascrittoma in cellule endoteliali microvascolari polmonari umane trattate con trombina. Questo metodo include isolamento dell'RNA, costruzione di librerie e sequenziamento.

RNA-seq Analisi trascrittomi in trombina-trattati e di controllo dell'uomo polmonari cellule endoteliali microvascolari

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