RNA-seq Analisi trascrittomi in trombina-trattati e di controllo dell'uomo polmonari cellule endoteliali microvascolari

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di presentare un processo completo e dettagliato per applicare l'RNA-Seq, una potente tecnologia di sequenziamento del DNA di nuova generazione, per profilare i trascrittomi. Ciò si ottiene isolando prima l'RNA totale dalle cellule endoteliali microvascolari polmonari umane con o senza trattamento con trombina e controllando la qualità dell'RNA. Il secondo passo è quello di costruire librerie di DNA da quei campioni di RNA.

Semplifica la generazione dei cluster utilizzando lo strumento cbot ed esegui l'attività di sequenziamento del DNA su HighSeq 1000. Successivamente viene eseguita l'analisi dei dati per identificare e visualizzare i trascritti genici differenzialmente espressi. Il passaggio finale consiste nel convalidare i risultati dell'aeq RN mediante RT TP CR. Il vantaggio principale dell'IC rispetto ai metodi esistenti come un micro array di DNA per l'analisi del trascrittoma è che l'IC può profilare un trascrittoma completo, fornire dati di tipo digitale e non fare affidamento su alcuna genomica nota dell'espressione genica nelle cellule.

Mentre la misurazione del livello di MRA è uno strumento utile per determinare come la trascrizione del macchinario della cellula è influenzata da segnali esterni o come le cellule differiscono tra uno stato di salute e uno stato di malattia. In questo protocollo, dimostreremo l'analisi IC dei trascrittomi nelle cellule indo syn microvascolari polmonari umane trattate con trobina e nel controllo delle cellule microvascolari indo syn polmonari. Questo protocollo si basa sul nostro recente studio pubblicato in cui abbiamo eseguito con successo la prima analisi completa del trascrittoma di cellule endoteliali microvascolari polmonari umane trattate con trombina utilizzando RNA-Seq sull'High SEQ 1000, una popolare piattaforma di sequenziamento del DNA di nuova generazione.

Utilizzando il sistema VS seven R-T-P-C-R, il Dr.Denova dimostrerà il trattamento con trombina delle cellule endoteliali polmonari e microvascolari umane e l'isolamento dell'RNA cellulare totale. La signora Margaret Gibson dimostrerà il sistema Experian per controllare la qualità dell'RNA e la libreria del DNA, nonché la generazione di cluster sul cbot.

E il Dr.Dimitri Gregor dimostrerà l'analisi dei dati per iniziare questa cultura del protocollo. Cellule endoteliali microvascolari polmonari umane con confluenza compresa tra il 90 e il 100% in piastre a sei pozzetti in terreno EGM due con fattori di crescita FBS al 5% e antibiotici. Cambiare il terreno con il terreno di carenza 30 minuti prima del trattamento con trombina.

Dopo 30 minuti, trattare le cellule con 0,05 unità per millilitro, trombina o lasciare non trattate come controllo. Incubare le cellule per sei ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo un trattamento di sei ore.

Isolare l'RNA totale dalle cellule trattate e di controllo utilizzando il kit Nirvana secondo le istruzioni del produttore. Valutare la qualità dell'RNA con un chip di RNA eucariotico di rilevamento standard Experian secondo il protocollo standard sulla stazione di elettroforesi automatizzata Experian. Infine, quantificare l'RNA utilizzando un metodo spettrofotometrico standard per la costruzione di librerie.

Utilizzare un microgrammo di RNA totale di alta qualità per campione come materiale di partenza per costruire la libreria. Seguire il protocollo standard del produttore. In questo protocollo, vengono eseguiti due cicli di selezioni di mRNA contenenti poli

Per rimuovere il nostro RNA in modo da ridurre al minimo il sequenziamento dell'RNA, valutare la qualità delle librerie utilizzando un chip Experian DNA one K. Secondo il protocollo standard della stazione di elettroforesi automatizzata Experian. Quantificare la libreria utilizzando la reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale.

Abbreviato Q-R-T-P-C-R come descritto nel protocollo scritto. Accompagnando questo video, esegui il Q-R-T-P-C-R secondo il protocollo MM cyber green e calcola la concentrazione originale di ciascuna libreria. Diluire le scorte della libreria a 10 nanomolari e conservare a 20 gradi Celsius.

Quando si è pronti per il raggruppamento di una cella a flusso, scongelare la piastra reattiva cbot in un bagno d'acqua. CBOT è uno strumento utilizzato per semplificare il processo di generazione dei cluster. Dopo aver lavato lo strumento cbot, denaturare le librerie combinando prima 13 microlitri di un XTE e sei microlitri di 10 nanomolari.

Biblioteca quindi a lato di ogni provetta, aggiungere un microlitro di un normale idrossido di sodio, agitare le provette e incubarle a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi metti le librerie denaturate sul ghiaccio. Successivamente, diluire le librerie denaturate con tampone di ibridazione pre-raffreddato combinando 996 microlitri di tampone e 4,0 microlitri di libreria denaturata per una concentrazione finale di 12 pico molare.

Posizionare le librerie diluite denaturate. Quindi capovolgere ogni fila di provette della piastra cbot, assicurandosi che tutti i reagenti siano scongelati. Dopo aver fatto girare la piastra, rimuovere la guarnizione di alluminio dalla fila dei tubi di idrossido di sodio e caricarla sull'aliquota cbot.

120 microlitri di librerie denaturate diluite in un tubo a strisce etichettato da uno a otto. Aggiungere 1,2 microlitri della libreria di controllo PHI X diluita e denaturata in ciascuna provetta come picco di controllo. Dopo aver girato e girato i tubi, caricarli sul cbot con l'orientamento corretto con il tubo numero uno a destra.

Caricare una cella di flusso e un collettore sul cbot. Completare il controllo del flusso e iniziare l'esecuzione del clustering. Al termine della seduta, controllare l'erogazione del reagente su tutte le corsie.

Prendere nota di eventuali anomalie. Avviare immediatamente la corsa di sequenziamento o conservare la cella a flusso nella provetta in dotazione a quattro gradi Celsius. Per iniziare la sequenziazione.

Scongelare il sequenziamento mediante reagenti di sintesi. Caricare i reagenti nei punti appropriati dei vassoi dei reagenti, facendo attenzione a non toccare gli altri reagenti. Dopo aver toccato la miscela di scissione, utilizzando una cella a flusso di sequenziamento non sequenza, adescare le linee dei reagenti due volte e pulire accuratamente la cella di flusso di sequenziamento con etanolo al 70% e salviette Kim, quindi con etanolo al 70% e carta per lenti.

Ispezionare la cella di flusso per eventuali striature e ripulirla se necessario. Caricare la cella di flusso sul sequenziatore ed eseguire un controllo del flusso per assicurarsi che la tenuta tra i collettori e la cella di flusso sia a tenuta. Avviare l'esecuzione della sequenziazione.

Valuta le metriche di qualità man mano che diventano disponibili durante la corsa Monitora l'intensità durante la corsa. Dopo che sono stati completati 101 cicli. Esegui la chimica di inversione di tendenza per completare la seconda lettura.

Il primo padre accoppiato e reagenti, e il secondo ha letto il tampone di incorporazione. Quindi caricare i reagenti, continuare il sequenziamento, eseguire la valutazione. In secondo luogo, leggere l'intensità Q3 e altre metriche di qualità man mano che la corsa procede.

Per iniziare l'analisi dei dati, utilizzare l'ultima versione di manioca per convertire i file di chiamata di base in file FAST Q. Impostazione del conteggio dei cluster Q veloci su zero per garantire la creazione di un singolo file Q veloce. Per ogni campione, decomprimere i file Q veloci per l'analisi a valle.

Esegui l'accoppiamento e l'allineamento utilizzando l'ultima versione di top hat, che allinea le letture RNA-Seq ai genomi delle dimensioni dei mammiferi utilizzando gli strumenti di lettura breve e SAM ad altissima produttività, che implementa varie utilità per gli allineamenti post-elaborazione nel formato SAM. Il trascrittoma umano di riferimento può essere scaricato da I genomi in esecuzione top hat sono state utilizzate tutte le impostazioni predefinite dei parametri, inclusa l'opzione del tipo di libreria come frammento non stranded utilizzando il programma cuff diff parte del pacchetto software gemelli. Confrontare le cellule trattate con trombina con le cellule di controllo.

Escludere i trascritti genici differenzialmente espressi nelle cellule trattate con trombina in base al trascrittoma di riferimento umano. Quindi utilizza un foglio di calcolo per visualizzare il risultato sotto forma di tabella. In questo caso, sono state utilizzate tutte le impostazioni dei parametri predefiniti e i trascritti genici con FPKM inferiore a 0,05 e p maggiore di 0,05 sono stati filtrati per rilevare nuove isoforme eseguite gemelli senza un riferimento.

Il trascrittoma confronta i file di trascrizione del campione con il genoma di riferimento utilizzando il confronto del bracciale. Testare l'espressione differenziale con cuff diff utilizzando i file di trascrizione della trombina combinati come genoma di riferimento per un'analisi e i file di trascrizione del controllo combinato come genoma di riferimento per una seconda analisi, ancora una volta, utilizzare un foglio di calcolo per visualizzare il risultato in formato tabellare. Come in precedenza, sono stati filtrati i trascritti genici con FPKM inferiore a 0,05 e p superiore a 0,05.

Dopo questo passaggio, gli investigatori possono scegliere di caricare un elenco di trascrizioni appena riportate sul sito Web del browser del genoma uc SC per verificarne la validità mediante un'ispezione manuale. Elenchi di geni differenzialmente espressi possono anche essere sottoposti all'analisi del percorso di ingenuità per la caratterizzazione dei geni e dei percorsi influenzati dal trattamento con trombina. In questa fase, gli investigatori possono scegliere di utilizzare cummerbund un pacchetto R progettato per aiutare e semplificare l'attività di analisi dell'output RN aeq dei gemelli per aiutare a gestire, visualizzare e integrare tutti i dati prodotti da un'analisi del differenziale del bracciale.

La convalida dei risultati dell'RN aeq viene quindi eseguita da Q-R-T-P-C-R in primo luogo, esegue l'isolamento dell'RNA totale dalle cellule endoteliali microvascolari polmonari umane di controllo e trattate con trombina, la valutazione della qualità dell'RNA e la quantificazione dell'RNA come dimostrato in precedenza nel video. Quindi generare DNA complementare da un microgrammo di RNA totale di ciascun campione con il sistema di sintesi del primo filamento in apice rt seguendo le istruzioni del produttore. Infine, eseguire l'analisi Q-R-T-P-C-R su un sistema di PCR in tempo reale VI a sette utilizzando il test TAC MAN su richiesta di nucleotidi progettati elencati nel protocollo scritto che accompagna questo video e misurare la quantificazione come ivi descritto.

Il rapporto tra 28 s e 18 S è tradizionalmente utilizzato come indicatore della degradazione dell'RNA Per quantificare in modo più accurato la degradazione, il sistema di esperienza calcola un indicatore di qualità dell'RNA o un numero RQI. L'algoritmo RQI confronta l'elettroferogramma dei campioni di RNA con i dati di una serie di campioni di RNA degradati standardizzati e restituisce automaticamente un numero compreso tra 10 e uno. Il campione di RNA dovrebbe avere un RQI di almeno sette e idealmente maggiore di otto.

Questi risultati di Experian indicano un campione di RNA di alta qualità con un RQI di 8,4. Le biblioteche dovrebbero avere una banda larga di circa 250-300 coppie di basi, come mostrato in questa figura dei risultati Experian per una biblioteca di alta qualità. Qui sono mostrati i risultati Q-R-T-P-C-R di campioni di curve standard e di un campione sconosciuto.

L'andamento e la qualità della sequenza devono essere costantemente osservati durante la corsa. Questa figura mostra la densità del cluster appropriata durante la prima fase di imaging del ciclo. Questa è la prima indicazione della corsa.

I cluster di qualità devono essere luminosi e focalizzati. Viene mostrato un esempio del primo report di base generato dopo il completamento del primo ciclo. A questo punto è importante valutare i livelli stimati di densità, intensità e qualità della messa a fuoco.

Qui viene mostrato il prossimo punto di controllo della qualità dopo il quarto ciclo. Mostra la densità assoluta dei cluster per ogni corsia. La densità del cluster non deve essere superiore a 850 K per millimetro quadrato dopo il ciclo 13.

Vengono calcolate le statistiche di fase e pre-fase. I numeri tipici sono compresi tra 0,1 e 0,25. La valutazione della qualità principale è possibile dopo il ciclo 24, quando vengono calcolate diverse metriche di qualità.

La percentuale di letture superiori a Q3 è una misura della fiducia nella base. Chiamare una lettura con un punteggio Q di tre significa che c'è una possibilità su 1000 che la chiamata base sia sbagliata. I punteggi Q diminuiranno man mano che l'esecuzione procede, ma dovrebbero iniziare con più del 95% delle letture che soddisfano o superano Q3. I cluster che passano il filtro o pf sono i cluster da cui verranno presi i dati della sequenza effettiva.

Idealmente, questo dovrebbe essere superiore all'85%Il cluster pf si basa su molti fattori tra cui la fase, l'intensità pre-fase e Q3.It non cambierà man mano che la corsa procede. La percentuale allineata è una misura delle letture che si allineano in tempo reale al genoma FI x. Poiché circa l'1% di FI x della libreria è stato inserito nelle librerie di campioni, la percentuale allineata dovrebbe essere compresa tra 0,5 e uno.

Questa statistica mostra che il contenuto della libreria è ben rappresentato dai cluster e non c'era alcun bias di generazione dei cluster qui elencati sono espressi geni e isoforme sia nelle cellule endoteliali microvascolari polmonari umane di controllo che trattate con trombina. In particolare, sono state rilevate circa 26.000 nuove isoforme, il che illustra la forza di RN aeq. Può identificare RNA sconosciuti.

In alternativa, trascritti con splicing e utilizzo di promotori alternativi, che non sono rilevabili con tecniche di microarray. L'RNA-Seq può anche misurare i trascritti meno abbondanti che vengono quantificati in modo impreciso, o non rilevati dai microarray per convalidare i risultati dell'RNA-Seq utilizzando un approccio alternativo. L'esperimento A-Q-R-T-P-C-R è stato eseguito per analizzare tre diversi geni nei dati RNA-Seq: TR uno è stato sovraregolato da 7,96 volte self.

Uno è stato sottoregolato di 1,16 volte e due ringraziati sono stati ribassati di 1,70 volte nei dati Q-R-T-P-C-R, questi numeri corrispondenti sono rispettivamente più 7,25 volte meno 1,15 volte e meno 2,07 volte. I risultati di questi tre geni analizzati da RNA-Seq e Q-R-T-P-C-R sono in buon accordo, il che corrobora i risultati dell'RNA-Seq. Questo protocollo è specifico per l'IC in un momento di trattamento microvascolare polmonare umano trattato con trobina nelle cellule senior, ma potrebbe essere facilmente adattato a uno studio multi-punto o a studi su tessuti di altre cellule trattati con stimoli o inibitori diversi o al confronto di trascrittomi in cellule o tessuti tra uno stato sano e uno stato di malattia.

Sebbene sia specifico per l'SQ 1000 elevato, questo protocollo è applicabile a qualsiasi membro della famiglia HighSeq o all'analizzatore di genoma. Due strumenti con piccole modifiche alle fasi di generazione del cluster e ai reagenti di sequenziamento. Altre piattaforme di sequenziamento del DNA di nuova generazione come la serie solida.

I sistemi GS, così come alcuni sistemi emergenti più recenti, sono impiegati anche per lo scopo di RNA-Seq. Sebbene le loro procedure di costruzione e sequenziamento delle librerie possano essere leggermente diverse, le punte di manipolazione dell'RNA, le parti di analisi dei dati e la validazione tramite R-T-P-C-R presentate in questo protocollo possono essere di riferimento per le loro applicazioni RNA-Seq.