Saggio di profilazione trombonica: una piattaforma basata sulla microfluidica per caratterizzare in modo completo la trombogenesi biomeccanica

Abbiamo sviluppato un nuovo metodo che può catturare adeguatamente gli attributi biomeccanici della trombosi e anche rilevare anomalie protrombotiche negli esseri umani. Per cominciare, utilizzare un wafer di silicio per fabbricare uno stampo master SU8 fotoresist tramite fotolitografia standard basata sul design e fissare lo stampo master sul fondo di una piastra di Petri da 15 centimetri con del nastro adesivo. Prepara la miscela di polidimetilsossiano, o PDMS, mescolando la base prepolimerica e l'agente polimerico dal kit di elastomero in silicone con un rapporto di peso di 10 a 1.

Versa la miscela PDMS sullo stampo master. Poi posiziona la piastra contenente la miscela PDMS in un essiccatore a vuoto per degassarlo. Polimerizza termicamente la miscela PDMS mettendola in un incubatore impostato a 75 gradi Celsius per due ore.

Dopo aver rimosso il campione dall'incubatore, si ritaglia con cura il PDMS polimerizzato dallo stampo master e si divide il PDMS polimerizzato in singole unità a chip. Usando un ago a sonda, fai i fori nei punti designati per creare l'ingresso e l'uscita. In una cappa chimica, usa una salvietta bagnata al 75% di etanolo per pulire le vetrine e asciugarle.

Successivamente, usando un generatore ad alta frequenza, trattate le vetrine di vetro per 30 secondi e i chip PDMS per 20 secondi. Allinea ogni scheggiatura con una lamella di vetro e premi delicatamente la scheggiatura sulla superficie del vetro per legarla. Ora lega termicamente i dispositivi mettendoli in forno impostato a 150 gradi Celsius per 15 minuti.

Dopo il collage, conservare i dispositivi a temperatura ambiente in condizioni prive di polvere. Poi, usando una pinza, rimuovi la parte di plastica degli aghi della sonda e piega i tubi metallici a 90 gradi per creare connettori per i dispositivi microfluidici. Dopo aver impostato le reazioni per la coniugazione del fibrinogeno e degli anticorpi necessari con Alexa Fluor, centrifugare le colonne di purificazione a 1.100 G per due minuti per rimuovere il buffer di stoccaggio.

Dopo aver scartato il flusso attraverso il flusso, carica la soluzione di reazione sulla colonna di purificazione montata in una fiala di raccolta compatibile e centrifuga a 1,100 G per cinque minuti per raccogliere la miscela richiesta. Utilizzando uno spettrofotometro, misura l'assorbanza per la proteina e il segnale del colorante. Calcola la concentrazione proteica e il rapporto fluorescenza-molare proteico.

Conserva i coloranti a quattro gradi Celsius al buio. Aggiungere eparina al tampone tirodico fino a una concentrazione finale di 0,32 unità per millilitro ogni 10 millilitri di sangue da raccogliere, e preparare la siringa aspirando 500 microlitri di tampone tirodico a pH 7,4. Dopo aver raccolto il sangue tramite venipuntura nella siringa contenente eparina, trasferiscilo in un tubo centrifuga da 15 millilitri e mantenerlo a 37 gradi Celsius.

Diluire il monomero del fattore di Von Willebrand a due microgrammi per millilitro in PBS. Pre-rivestire i dispositivi microfluidici con il monomero fattore di von Willebrand diluito e incubarli per un'ora a temperatura ambiente. Ora incuba il campione di sangue con sensore fluorescente impostato 1 o imposta 2 per 10 minuti a temperatura ambiente.

Successivamente, collega un dispositivo microfluidico con connettori di presa e uscita e tubi. Collega l'altra estremità del connettore di ingresso al tubo contenente PBS, e poi collega l'altra estremità del connettore di presa a una siringa. Montare la siringa su una pompa per siringa e il dispositivo microfluidico su un microscopio rovesciato.

Manovrare manualmente lo stadio del microscopio per localizzare il sito della stenosi. Riempire il canale microfluidico e il tubo con PBS utilizzando la pompa della siringa a una portata di 0,5 millilitri al minuto. Ispeziona il dispositivo per assicurarti che non ci siano bolle d'aria intorno al sito della stenosi.

Collega il tubo di ingresso al campione di sangue e perfondi il campione attraverso il canale microfluidico usando la pompa della siringa a una portata di 0,018 millilitri al minuto. In un microscopio invertito, imposta il tempo di esposizione e il guadagno per ciascun canale di fluorescenza nel software. Esegui immagini di fluorescenza multicolore in tempo reale alternando tra i quattro canali ed eccitando un fluoro-4 alla volta.

Regolare il piano di messa a fuoco al trombo e registrare i segnali fluorescenti nel sito della stenosi per 15-30 minuti. Per l'analisi dei dati, apri il file dati usando ImageJ versione 1.53. Usa il canale C di adattamento SZ 22 per identificare il contorno del trombo.

Poi, usando la selezione dei poligoni, si seleziona approssimativamente l'area del trombo. Per ogni canale, elimina il segnale di fondo selezionando immagine, scegliendo Aggiusta e poi selezionando Soglia. Infine, misura l'area e l'intensità media del segnale all'interno del trombo selezionando Analizza e scegliendo Misura.

Istantanee rappresentative hanno mostrato trombombi formatisi nel sangue sano all'interno del canale stenotico con piastrine, fibrinogeno, fattore von Willebrand e P-selectina visualizzati usando il set di sensori 1, e piastrine, fosfatidilserina, integrina alfa IIb beta 3 E-positiva, un'integrina alpha IIb beta 3 attivata visualizzata usando il set di sensori 2. Un'unica immagine a canale di fluorescenza veniva elaborata selezionando l'area del trombo, rimuovendo il segnale di fondo e misurando l'area del segnale e la luminosità media per consentire un'analisi quantitativa. L'analisi continua dell'intensità del segnale fluorescente nel tempo ha generato una curva segnale in funzione temporale per l'accumulo di piastrine durante la formazione del trombo.

Per ogni punto temporale, sono state ottenute le intensità totali del segnale per quattro biomarcatori nel set di sensori uno e per quattro biomarcatori nel set di sensori secondo. La dimensione del trombo è stata calcolata e generato un profilo di trombo a sette dimensioni. Attualmente non è disponibile alcun biosaggio per valutare la tendenza protrombotica dei pazienti umani, e il nostro lavoro cerca di colmare questa lacuna.

Rilevando l'attività biomeccanica dei campioni di sangue, il nostro saggio può valutare in modo completo le caratteristiche protrombotiche dei soggetti. Il nostro saggio può essere sviluppato in un test clinico per rilevare la tendenza protrombotica nei pazienti e può anche essere utilizzato per lo screening di farmaci antitrombotici di nuova generazione.